Summary
Vi beskriver en metode som kombinerer immunmagnetiske perler og fluorescensaktivert cellesortering for å isolere og analysere definerte immuncelleunderpopulasjoner av mononukleære celler i perifert blod (monocytter, CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, B-celler og naturlige drepeceller). Ved hjelp av denne metoden kan magnetiske og fluorescerende merkede celler renses og analyseres.
Abstract
Infeksiøs mononukleose (IM) er et akutt syndrom som hovedsakelig er forbundet med primær Epstein-Barr-virus (EBV) infeksjon. De viktigste kliniske symptomene inkluderer uregelmessig feber, lymfadenopati og signifikant økte lymfocytter i perifert blod. Den patogene mekanismen for IM er fortsatt uklar; Det er ingen effektiv behandlingsmetode for det, med hovedsakelig symptomatisk behandling tilgjengelig. Hovedspørsmålet i EBV-immunbiologi er hvorfor bare en liten delmengde av infiserte individer viser alvorlige kliniske symptomer og til og med utvikler EBV-assosierte maligniteter, mens de fleste individer er asymptomatiske for livet med viruset.
B-celler er først involvert i IM fordi EBV-reseptorer presenteres på overflaten. Natural killer (NK) celler er cytotoksiske medfødte lymfocytter som er viktige for å drepe EBV-infiserte celler. Andelen CD4 + T-celler reduseres mens CD8 + T-celler utvides dramatisk under akutt EBV-infeksjon, og utholdenheten til CD8 + T-celler er viktig for livslang kontroll av IM. Disse immuncellene spiller viktige roller i IM, og deres funksjoner må identifiseres separat. Til dette formål separeres monocytter først fra mononukleære celler i perifert blod (PBMC) av IM-individer ved bruk av CD14-mikroperler, en kolonne og en magnetisk separator.
De resterende PBMCs er farget med peridinin-klorofyll-protein (PerCP) / Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC) / Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluoresceinisotiocyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 og APC anti-CD16 antistoffer for å sortere CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og NK-celler ved hjelp av et flowcytometer. Videre ble transkriptomsekvensering av fem subpopulasjoner utført for å utforske deres funksjoner og patogene mekanismer i IM.
Introduction
Epstein-Barr-virus (EBV), et γ-herpesvirus også kjent som humant herpesvirus type 4, er allestedsnærværende i den menneskelige befolkningen og etablerer livslang latent infeksjon hos mer enn 90% av den voksne befolkningen1. De fleste EBV primær infeksjon oppstår i barndommen og ungdomsårene, med en brøkdel av pasientene som manifesterer seg med infeksiøs mononukleose (IM) 2, som viser karakteristisk immunpatologi, inkludert en aktivert immunrespons med CD8 + T-celler i blod og en forbigående spredning av EBV-infiserte B-celler i oropharynx3. IM-forløpet kan vare i 2–6 uker, og de fleste pasientene blir friske4. Noen individer utvikler imidlertid vedvarende eller tilbakevendende IM-lignende symptomer med høy morbiditet og dødelighet, som er klassifisert som kronisk aktiv EBV-infeksjon (CAEBV)5. I tillegg er EBV et viktig onkogent virus, som er nært beslektet med en rekke maligniteter, inkludert epiteloid og lymfoide maligniteter som nasopharyngeal karsinom, Burkitts lymfom, Hodgkins lymfom (HL) og T/NK-cellelymfom6. Selv om EBV har blitt studert i over 50 år, har patogenesen og mekanismen som induserer spredning av lymfocytter ikke blitt fullstendig belyst.
Flere studier har undersøkt molekylære signaturer for immunpatologi av EBV-infeksjon ved transkriptomsekvensering. Zhong og medarbeidere analyserte hel-transkriptomprofilering av mononukleære celler i perifert blod (PBMC) fra kinesiske barn med IM eller CAEBV for å finne at CD8+ T-celleutvidelse hovedsakelig ble funnet i IM-gruppe7, noe som tyder på at CD8+ T-celler kan spille en viktig rolle i IM. Tilsvarende fant en annen studie lavere andel EBV-spesifikke cytotoksiske T- og CD19+ B-celler og høyere prosentandel CD8+ T-celler hos pasienter med IM forårsaket av primær EBV-infeksjon enn hos pasienter med IM forårsaket både av EBV-reaktivering og andre midler8. B-celler er først involvert i IM fordi EBV-reseptorer presenteres på overflaten. Al Tabaa og medarbeidere fant at B-celler var polyklonalt aktiverte og differensierte intoplasmablaster (CD19+, CD27+ og CD20−, og CD138−-celler) og plasmaceller (CD19+, CD27+ og CD20−, og CD138+) under IM 9. Videre fant Zhong og medarbeidere at monocyttmarkørene CD14 og CD64 ble oppregulert i CAEBV, noe som tyder på at monocytter kan spille en viktig rolle i den cellulære immunresponsen til CAEBV gjennom antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) og hyperaktiv fagocytose7. Alka og medarbeidere karakteriserte transkriptomet til MACS sorterte CD56dim CD16+ NK-celler fra fire pasienter med IM eller HL og fant at NK-celler fra både IM og HL hadde nedregulert medfødt immunitet og kjemokinsignaleringsgener, som kunne være ansvarlig for hyporesponsiviteten til NK-celler10. I tillegg analyserte Greenough og medarbeidere genuttrykk av sorterte CD8+ T-celler fra 10 PBMCs av individer med IM. De rapporterte at en stor andel av CD8 + T-celler i IM var virusspesifikke, aktiverte, delte og primet for å utøve effektoraktiviteter11. Både T-cellemedierte, EBV-spesifikke responser og NK-cellemedierte, uspesifikke responser spiller viktige roller under primær EBV-infeksjon. Imidlertid undersøkte disse studiene bare transkriptomresultatene av den mangfoldige blandingen av immunceller eller bare en viss underpopulasjon av lymfocytter, noe som ikke er tilstrekkelig for den omfattende sammenligningen av molekylære egenskaper og funksjoner av forskjellige immuncelleunderpopulasjoner hos barn med IM ved samme sykdomstilstand.
Dette papiret beskriver en metode som kombinerer immunomagnetiske perler og fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for å isolere og analysere definerte immuncelleunderpopulasjoner av PBMCs (monocytter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og NK-celler). Ved hjelp av denne metoden kan magnetiske og fluorescerende merkede celler renses ved hjelp av en magnetisk separator og FACS eller analyseres ved strømningscytometri. RNA kan ekstraheres fra de rensede cellene for transkriptomsekvensering. Denne metoden vil muliggjøre karakterisering og genuttrykk av forskjellige immunceller i samme sykdomstilstander hos personer med IM, noe som vil utvide vår forståelse av immunpatologien til EBV-infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det ble tatt blodprøver av pasienter med i.m. (n = 3), friske EBV-bærere (n = 3) og EBV-uinfiserte barn (n = 3). Frivillige ble rekruttert fra Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, og alle studier ble etisk godkjent. Etisk godkjenning ble innhentet av den etiske komiteen for Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkjenningsnummer: [2021]-E-056-Y). Informert samtykke fra pasienter ble frafalt da studien bare brukte de resterende prøvene til klinisk testing. Alle data ble fullstendig avidentifisert og anonymisert for å beskytte pasientens personvern.
1. Isolering av PBMCs fra perifert blod
- Samle friskt perifert blod (2 ml) fra pasienter med IM i K3EDTA-rør ved standard venepunksjon.
MERK: Prosessen må være rask for å opprettholde cellens levedyktighet. - Fortynn perifert blod til to ganger volum med fosfatbufret saltvann (PBS) og lag det på toppen av humant lymfocyttseparasjonsmedium (tetthet: 1,077 ± 0,001 g / ml) i et 15 ml sentrifugerør.
MERK: Volumforholdet mellom blod, PBS og separasjonsmedium var 1: 1: 1. Tilsett blodet sakte til separasjonsmediet, og sentrifuger umiddelbart for å unngå at blodet setter seg inn i separasjonsmediet. - Sentrifuge ved 800 × g i 20 minutter ved romtemperatur. Overfør mellomlaget (berikede PBMC-er) til et annet 15 ml sentrifugerør.
MERK: Etter sentrifugering er det erytrocytter i bunnen av røret, mellomlaget er separasjonsmediet, det øverste laget er plasma, og mellom plasmalaget og separasjonsvæskelaget var PBMCs (inkludert lymfocytter og monocytter). - Vask PBMCs med 10 ml PBS og sentrifuge ved 800 × g i 20 minutter ved romtemperatur; kast supernatanten forsiktig.
- Gjenta vasking og sentrifugering (trinn 1.4) 2 x. Resuspender PBMCs med 1 ml PBS i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og tell cellene med en trypanblåbasert, automatisert teller.
2. Isolering av CD14 + monocytter fra PBMCs ved bruk av CD14 mikroperler
- Klargjør en bufferløsning inneholdende 0,5 % føtalt bovint serum (FBS) og 2 mM EDTA i PBS (pH 7,2). Hold bufferen kald (2−8 °C).
MERK: Degas bufferen før bruk som luftbobler kan blokkere kolonnen. Hold cellene kalde for å forhindre kapping av antistoffene på celleoverflaten og ikke-spesifikk cellemerking. - Sentrifuge PBMCs ved 300 × g i 10 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten forsiktig. Resuspender cellene med 80 μL av bufferen. Tilsett 20 μL CD14 mikroperler til cellesuspensjonen.
MERK: Hvis det er ≤107 PBMC, bruk volumet som er angitt ovenfor. Hvis det er >107 PBMC, øker proporsjonalt alle reagensvolumer og totalvolumet. - Bland CD14-mikroperlene og cellene godt i 1,5 ml mikrosentrifugerøret og rug i 15 minutter i et 4 °C kjøleskap. Vask PBMCs med 1 ml buffer og sentrifuge ved 300 × g i 10 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten helt. Resuspender cellene med 500 μL av bufferen.
MERK: Hvis det er ≤108 PBMC, bruk volumet som er angitt ovenfor. Hvis det er >108 PBMC, øker buffervolumet proporsjonalt. - Magnetisk separasjon med kolonner:
- Sett kolonnen på den magnetiske perleseparatoren, og vask kolonnen med 3 ml buffer. Legg til cellesuspensjonen (fra trinn 2.3) i kolonnen.
- Samle de umerkede cellene som passerer gjennom kolonnen inn i et 15 ml sentrifugerør og vask kolonnen med 3 ml buffer. Vask kolonnen med 3 x 3 ml buffer. Samle det totale avløpet i 15 ml sentrifugerøret.
- Plasser søylen i et nytt 15 ml sentrifugerør. Legg til 5 ml buffer i kolonnen. Skyv stempelet godt inn i kolonnen for umiddelbart å skylle ut de magnetisk merkede cellene i 15 ml sentrifugerøret.
- Sentrifuge de magnetisk merkede cellene ved 300 × g i 5 minutter og fjern supernatanten. Resuspender cellene i 500 μL PBS i et 1,5 ml mikrosentrifugerør for bruk i påfølgende transkriptomsekvensering.
3. Separasjon av lymfocyttpopulasjoner fra PBMCs ved fluorescerende merket antistofffarging og FACS
- Sentrifuge de umerkede cellene (trinn 2.4.2) ved 300 × g i 5 minutter og fjern supernatanten. Resuspender cellene i 100 μL PBS i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Tilsett 2 μL av hvert merket antistoff (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) til 100 μL cellesuspensjon (volumene og konjugert fluoroforinformasjon av antistoffer er vist i tabell 1), inkuber på is i 30 minutter og beskytt mot lys.
- Vask cellene 2 x ved å tilsette 1 ml PBS og sentrifugere ved 300 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspender cellene i 500 μL PBS i 1,5 ml mikrosentrifugerøret. Vortex cellesuspensjonen forsiktig før du henter data på et flowcellesorteringscytometer.
4. Parameterinnstilling for flowcytometri
- Ta 100 μL av cellesuspensjonen (se pkt. 1) i 1,5 ml mikrosentrifugerør etter behov, og sett opp en negativ kontrollprøve, en CD3-enkeltfargingsprøve, en CD4-enkeltfargingsprøve, en CD8-enkeltfargingsprøve, en CD19-enkeltfargingsprøve og en CD56/CD16-fargeprøve.
- Tilsett 2 μL av det tilsvarende fluorescerende merkede antistoffet per 100 μL av cellesuspensjonen og virvelen. Inkuber på is i 30 minutter i mørket. Sentrifuge i 5 min ved 300 × g og aspirer supernatanten. Resuspender pellets med 500 μL PBS og vortex.
- Bestill sorteringsstrømmen og forsink dråpene ved hjelp av fluorescerende perler som følger:
- Åpne cellesorteringssystemet, kjør oppstartsprogrammet, installer 85 μm dysen og åpne sorteringsstrømmen. Sett sorteringsspenningen til 4,500 V, og Freq til 47.
- Juster parametrene hovedsakelig ved å justere hovedstrømningsdråpebruddpunktet og dråpeforsinkelsen i henhold til produsentens instruksjoner12. Sett opp den første dråpebryterposisjonen (Drop1) til 275, og Gap til 8 i Breakoff-vinduet . Slå på den automatiske sorteringsmodusen Sweet Spot for å la cytometrien automatisk bestemme dråpeamplitudeverdien for å stabilisere strømmen.
- Juster dråpeforsinkelsen til 30,31 i sidestrømvinduet ved å laste inn de fluorescerende perlene, slik at perlene oppnår en sidestrømningsavbøyning på >99 % i enten innledende eller finjusteringsmodus.
- Se gatingstrategien vist i figur 1 for å utføre gating som følger:
- Ved hjelp av punktplottet forward scatter-area (FSC-A)/side scatter-area (SSC-A) tegner du polygonporten (P1) for å identifisere den intakte lymfocyttpopulasjonen .
- Bruk et punktplott i FSC-A/FSC-høyde (FSC-H) til å tegne polygonporten (P2) for å identifisere enkeltcellene og ekskludere dubletter (figur 1A).
- Bruk et CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A-punktdiagram til å tegne den rektangulære porten (P3) for å velge CD3+ T-celler og CD19+ B-celler (figur 1A,B).
- Bruk et CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A-punktplott til å tegne en rektangulær port for å velge CD4+ T-celler og CD8+ T-celler (celler med høy fluorescens for disse markørene).
- Bruk et CD56/CD16 APC-A/SSC-A-A-punktdiagram til å tegne en rektangulær port for å velge CD56+/CD16+ NK-celler (figur 1C).
- Juster instrumentelle parametere ved hjelp av den negative kontrollprøven:
- Installer det negative kontrollrøret på lasteporten, og klikk Last inn på instrumentbordet for anskaffelse. Velg Cytometerinnstillinger i programvaren.
- I inspektørvinduet klikker du på Parametere-fanen og justerer spenningene til FSC, SSC og forskjellige fluorescerende fargestoffer; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanine 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanine 5.5: 663.
- Juster kompensasjonen ved hjelp av enkeltfargede prøver13.
- Legg de enkeltfargede rørene på cytometrien sekvensielt og velg Cytometerinnstillinger i programvaren. Klikk kategorien Kompensasjon for å justere kompensasjonen.
MERK: Kompensasjonsreferansen for flowcytometri er vist i tabell 2.
- Legg de enkeltfargede rørene på cytometrien sekvensielt og velg Cytometerinnstillinger i programvaren. Klikk kategorien Kompensasjon for å justere kompensasjonen.
5. Cellesortering og innsamling av data via flowcytometri
- Vortex cellesuspensjonen (separert PBMC i henhold til avsnitt 1-3) kort for å resuspendere cellene før du legger røret inn i cytometeret. Hold de resterende rørene på is.
- Tilsett 200 μL FBS til fire oppsamlingsstrømningsrør for å unngå å stikke de sorterte cellene til rørveggen og plassere dem i cytometeroppsamlingskammeret.
- Samle CD3 + CD4 + T-celler, CD3 + CD8 + T-celler, CD3-CD19 + B-celler og CD3- CD56 + / CD16 + NK-celler separat fra prøven av en pasient med IM i de fire strømningsrørene (figur 2A).
- Sentrifuge de separerte cellene ved 300 × g i 5 minutter og fjern supernatanten. Tilsett 200 μL RNA-isolasjonsreagens til cellene for transkriptomsekvensering.
- Skill immuncelleunderpopulasjonene av prøver fra friske EBV-bærere og EBV-infiserte barn i henhold til trinnene ovenfor (figur 2B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Referanse til gating-strategien
Gating-strategien som brukes til å sortere de fire lymfocytt-subpopulasjonene er vist i figur 1. Kort fortalt velges lymfocytter (P1) på et punktplott som viser granulositet (SSC-A) versus størrelse (FSC-A). Deretter velges enkeltceller (P2) på et punktdiagram som viser størrelsen (FSC-A) kontra fremoverpunkt (FSC-H), mens dobbeltceller utelates. CD3+ T-celler (P3) og CD19+ B-celler (figur 1B) velges separat på et punktdiagram som viser CD3 PerCP-Cy5.5-A versus CD19 FITC-A. CD8+ T-celler og CD4+ T-celler velges separat på et punktdiagram som viser CD8 PE-A versus CD4 APC-Cy7-A fra P3. CD16+/CD56+ NK-celler er valgt på et punktdiagram som viser CD56/CD16 APC-A versus SSC-A fra P4 (figur 1C).
De representative resultatene av fire celleunderpopulasjoner sortert fra prøvene av pasienter med IM etter den beskrevne metoden er vist i figur 2A. Vi utførte også cellesortering på prøver fra friske EBV-bærere og EBV-infiserte barn som kontrollgrupper for å bekrefte gjennomførbarheten av dette eksperimentet. De representative resultatene av celleunderpopulasjoner skilt fra en sunn EBV-bærers prøve er vist i figur 2B. Det representative resultatet av celleunderpopulasjoner sortert fra utvalget av EBV-uinfiserte barn er vist i figur 2C. Som vist i figur 2 ble P1 gated for å identifisere lymfocytter og dobbeltceller ble ekskludert gjennom P2; P3 ble gated for å velge CD3 + T-celler og P5 ble gated for å velge CD19 + B-celler; CD3+ CD8+ T-celler (P6) og CD3+ CD4+ T-celler (P7) ble valgt separat fra P3; CD16+/CD56+ NK-celler (P8) ble valgt fra P4. Hver av disse underpopulasjonene kan sorteres individuelt og samles inn for nedstrøms eksperimenter. Dette systemet ble brukt til å analysere genuttrykk gjennom RNA-ekstraksjon og transkriptomsekvensering.
Som rapportert i tabell 3 ble det observert en økning i CD3+ CD8+ T-celler hos pasienter med IM sammenlignet med både friske EBV-bærere og EBV-uinfiserte barn (46,5 ± 4,0 vs. 27,0 ± 0,1 og 46,5 ± 4,0 vs. 24,7 ± 2,9, % CD3+ CD8+ T-celler per totale lymfocytter); Redusert andel CD3+ CD4+ T-celler og CD19+ B-celler ble observert hos pasienter med IM sammenlignet med friske EBV-bærere og EBV-infiserte barn (13,4 ± 1,5 vs. 19,3 ± 1,5 og 13,4 ± 1,5 vs. 23,6 ± 3,2, % CD3+ CD4+ T-celler per totale lymfocytter; 1,4 ± 0,3 vs. 7,6 ± 0,7 og 1,4 ± 0,3 vs. 9,0 ± 1,5, % CD19+ B-celler per totale lymfocytter). Reduserte andeler av CD16+/CD56+ NK-celler ble observert hos pasienter med i.m. sammenlignet med EBV-infiserte barn (7,5 ± 0,5 vs. 10,7 ± 0,4, % CD16+/CD56+ NK-celler per totale lymfocytter). Disse resultatene validerte effektiviteten av denne sorteringsprotokollen og viste at andelen lymfocyttundergrupper er forskjellig hos pasienter med IM og EBV-infiserte barn.
Figur 1: Samlet gatingstrategi som brukes til å sortere immuncelleunderpopulasjoner fra PBMCs. (A) PerCP-Cy5.5-filteret ble brukt til å skille CD3 + T-celler. CD8+ T-celler og CD4+ T-celler ble valgt separat på et punktdiagram som viser CD8 PE-A versus CD4 APC-Cy7-A fra P3. (B) FITC-filteret ble brukt til å identifisere CD19+ B-celler. (C) APC-filteret ble brukt til å skille CD16+/CD56+ NK-celler fra P4. Forkortelser: PBMCs = perifere blod mononukleære celler; FSC-A = fremover spredningsområde; SSC-A = sidespredningsområde; FSC-H = fremover spredningshøyde; PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative resultater fra fire celleunderpopulasjoner vellykket isolert ved den beskrevne metoden. (A) Representative cellesorteringstall fra perifert blodprøve av pasient med i.m. (B) Representative cellesorteringstall fra perifer blodprøve av friske EBV-bærere. (C) Representative cellesorteringstall fra perifere blodprøver av EBV-uinfiserte barn. P1, dot plot gate for å identifisere lymfocytter; P2, prikkplottport for å velge enkeltceller; P3, prikkplottport for å velge CD3 + T-celler; P4, dot plot gate for å identifisere CD3- CD19- lymfocytter; P5, prikkplottport for å velge CD19+ B-celler; P6, prikkplottport for å velge CD3+ CD8+ T-celler fra P3; P7, prikkplottport for å velge CD3+ CD4+ T-celler fra P3; P8, punktplottport for å velge CD16+/CD56+ NK-celler fra P4. Forkortelser: EBV = Epstein–Barr-virus; IM = smittsom mononukleose; FSC-A = fremover spredningsområde; SSC-A = sidespredningsområde; FSC-H = fremover spredningshøyde; PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antistoff Mål | Konjugert fluorofor | Dosering | Klon | Isotype |
| CD3 | PerCP/Cyanine5.5 | 2 μL | SK7 | Mus IgG1, κ |
| CD4 | APC/Cyanine7 | 2 μL | SK3 | Mus IgG1, κ |
| CD8 | PE | 2 μL | SK1 | Mus IgG1, κ |
| CD19 | FITC | 2 μL | HIB19 | Mus IgG1, κ |
| CD56 | APC | 2 μL | 5.1H11 | Mus IgG1, κ |
| CD16 | APC | 2 μL | 3G8 | Mus IgG1, κ |
Tabell 1: Antistoffer brukt til flowcytometri. Forkortelser: PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat.
| Kompensasjonsreferanse for flowcytometri (%) | |||||
| PE | APC | APC-CY7 | FITC | PerCP-Cy5.5 | |
| PE | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| APC | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-CY7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| FITC | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| PerCP-Cy5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
Tabell 2: Kompensasjonsreferanse for flowcytometri. Forkortelser: PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat.
| Andel lymfocytter med ulik subpopulasjon i totalt sorterte lymfocytter (%) | |||
| lymfocytter subpopulasjon | IM | friske EBV-bærere | EBV-infiserte barn |
| CD3+ T-celler | 80,5 ± 1,8 | 70.2 ± 2.3 | 66.1 ± 2.1 |
| CD3+ CD8+ T-celler | 46,5 ± 4,0 | 27.0 ± 0.1 | 24.7 ± 2.9 |
| CD3+ CD4+ T-celler | 13.4 ± 1.5 | 19.3 ± 1.5 | 23.6 ± 3.2 |
| CD16+/CD56+ NK-celler | 7,5 ± 0,5 | 2.2 ± 0.1 | 10.7 ± 0.4 |
| CD3- CD19+ B-celler | 1.4 ± 0.3 | 7,6 ± 0,7 | 9.0 ± 1.5 |
Tabell 3: Andel sorterte lymfocytter i ulike grupper. Forkortelser: EBV = Epstein–Barr-virus; IM = smittsom mononukleose; NK = naturlig morder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen representerer en effektiv måte å sortere underpopulasjoner av perifere immunceller på. I denne studien ble venøse blodprøver fra pasienter med IM, friske EBV-bærere og EBV-uinfiserte barn valgt som forskningsmål. Dette arbeidet ved bruk av perifert blod hos pasienter med IM fokuserer hovedsakelig på å analysere og bestemme proporsjonene av forskjellige celleundergrupper gjennom flerfarget flowcytometri. Transkriptomsekvensering brukes hovedsakelig til påvisning og analyse av en viss underpopulasjon av lymfocytter som ikke var tilstrekkelig for omfattende og spesifikke sammenligninger av molekylære egenskaper og funksjoner av forskjellige immuncelleunderpopulasjoner hos barn med IM ved samme sykdomstilstand. Derfor kan sortering av flere typer celler fra perifert blod og utføre transkriptomsekvensering for å sammenligne forskjellene i uttrykksgenene og funksjonene til disse immuncellene gi signifikante data for studiet av patogenesen av IM.
FACS-sortering har den ekstra fordelen av å kunne behandle levende, fraksjonerte celler for videre in vitro eller in vivo eksperimenter14. Opprettholde cellens levedyktighet er viktig for påfølgende eksperimenter. Vi har optimalisert sorteringstrinnet for å forbedre cellens levedyktighet i denne protokollen - eksperimentelle manipulasjoner har blitt utført på is eller i et 4 ° C kjøleskap. Riktig sentrifugeringshastighet og tid er også avgjørende for celleisolasjon. Utbyttet av sorterte celler er også hovedbegrensningen i denne metoden, og bruken av FBS-belagte rør under sortering kan i stor grad redusere tapet av celler som fester seg til rørene. Hvis du angir de riktige innstillingene for FACS-sortereren, kan du forbedre den generelle effektiviteten til sorteringen ved å unngå celleblokkering eller krysskontaminering i oppsamlingsrøret. Gjennom optimalisering av eksperimentelle trinn og innstillinger kan denne protokollen ekstrapoleres til sortering av andre immunceller ved å erstatte magnetiske eller fluorescerende etiketter. På grunn av spesifisiteten til barnas prøver (lavt blodinnsamlingsvolum) undersøkte vi imidlertid bare de store populasjonene av immunceller (monocytter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og NK-celler) uten å fortsette å sortere underpopulasjoner på grunn av begrensningen av flytsorteringskanalen. Denne studien viste at perifere blodprøver fra immunkompetente barn og prøver fra IM med hell kunne sortere ut disse fem gruppene av immunceller; Blodprøver av pasienter med hematologiske maligniteter (f.eks. leukemi, lymfom), lymfoproliferative sykdommer (f.eks. posttransplanterte lymfoproliferative sykdommer, CAEBV) eller primært immunsvikt/ervervet immunsviktsyndrom kan imidlertid ikke sorteres i henhold til denne protokollen.
IM regnes som en selvbegrensende sykdom, og immunceller som γδ T-celler, NKT-celler og NK-celler spiller en betydelig rolle i den antivirale immunresponsen15. EBV-spesifikke CD8+ T-celler er i stor grad differensiert mot en effektorfenotype10,16, og det er sammentrekning av seneffektorminne og effektorceller fra IM til rekonvalesens 17. I mellomtiden synes NK-celler i IM å være funksjonelt defekte, inkludert mangel på celleaktivering10, tap av aktiverende reseptorsignalering og degranulering18. Noen studier har funnet ut at CD4 + T-celler ikke bare kan hjelpe CD8 + T-celler til å drepe og eliminere EBV-infiserte B-celler, men også hemme spredning av B-celler ved å utskille cytokiner og til og med direkte spille en drepende rolle under EBV-infeksjon 19,20. Som vist i denne studien ble det observert en økt andel CD3+ CD8+ T-celler hos pasienter med IM sammenlignet med både friske EBV-bærere og EBV-uinfiserte barn. I motsetning til dette ble det observert reduserte andeler av CD3 + CD4 + T-celler, CD19 + B-celler og CD16 + / CD56 + NK-celler hos pasienter med IM sammenlignet med EBV-uinfiserte barn. Imidlertid forblir funksjonen og genuttrykket til disse forskjellige subtypene av immunceller i samme sykdomstilstand av IM uklart. Videre analyse av genuttrykksprofilene til spesifikke immuncelleundergrupper i IM kan bidra til å få innsikt i den patogene mekanismen til IM.
Vi tilbyr en strategi som kombinerer immunomagnetisk perlesortering og FACS for å isolere og analysere definerte immuncelleunderpopulasjoner i PBMCs. Monocytter separeres først ved hjelp av CD14-mikroperler, og de resterende PBMC-ene er farget med tilsvarende fluorescerende merkede antistoffer for å sortere CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og NK-celler gjennom FACS. Vi brukte videre disse sorterte cellene for RNA-ekstraksjon og transkriptomsekvensering for å karakterisere funksjonen og genuttrykket til forskjellige immunceller i immunpatologien til IM. Renheten og utbyttet av de sorterte cellene var generelt tilstrekkelig til å gjennomføre genuttrykksstudier (data ikke vist). Derfor kan sorteringsmetoden for separate immuncelleunderpopulasjoner brukes til å utforske EBV-assosierte lymfoproliferative lidelser som CAEBV, posttransplantasjon lymfoproliferativ lidelse for å oppdage patogene gener, patogene proteiner og potensielle terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation (7222059) og CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
