Summary
Describimos un método que combina perlas inmunomagnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia para aislar y analizar subpoblaciones de células inmunes definidas de células mononucleares de sangre periférica (monocitos, células T CD4 +, células T CD8 +, células B y células asesinas naturales). Usando este método, las células magnéticas y marcadas con fluorescencia pueden ser purificadas y analizadas.
Abstract
La mononucleosis infecciosa (IM) es un síndrome agudo asociado principalmente con la infección primaria por el virus de Epstein-Barr (VEB). Los principales síntomas clínicos incluyen fiebre irregular, linfadenopatía y aumento significativo de linfocitos en sangre periférica. El mecanismo patogénico de la MI aún no está claro; No existe un método de tratamiento eficaz para ello, con terapias principalmente sintomáticas disponibles. La pregunta principal en la inmunobiología del VEB es por qué solo un pequeño subconjunto de individuos infectados muestra síntomas clínicos graves e incluso desarrolla neoplasias malignas asociadas al VEB, mientras que la mayoría de los individuos son asintomáticos de por vida con el virus.
Las células B están involucradas primero en la IM porque los receptores de EBV se presentan en su superficie. Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos innatos citotóxicos que son importantes para matar las células infectadas por el VEB. La proporción de células T CD4 + disminuye, mientras que la de células T CD8 + se expande dramáticamente durante la infección aguda por VEB, y la persistencia de las células T CD8 + es importante para el control de por vida de la IM. Esas células inmunes juegan un papel importante en la IM, y sus funciones deben identificarse por separado. Para este propósito, los monocitos se separan primero de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos IM utilizando microperlas CD14, una columna y un separador magnético.
Los PBMC restantes se tiñen con peridina-clorofila-proteína (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, aloficocianina (APC)/cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD19, anticuerpos APC anti-CD56 y anticuerpos APC anti-CD16 para clasificar las células T CD4+, las células T CD8+, las células B y las células NK utilizando un citómetro de flujo. Además, se realizó la secuenciación del transcriptoma de cinco subpoblaciones para explorar sus funciones y mecanismos patogénicos en IM.
Introduction
El virus de Epstein-Barr (VEB), un γ-herpesvirus también conocido como virus del herpes humano tipo 4, es ubicuo en la población humana y establece una infección latente de por vida en más del 90% de la población adulta1. La mayoría de las infecciones primarias por VEB ocurren durante la infancia y la adolescencia, con una fracción de pacientes que se manifiestan con mononucleosis infecciosa (IM)2, mostrando inmunopatología característica, incluida una respuesta inmune activada con células T CD8 + en sangre y una proliferación transitoria de células B infectadas por VEB en la orofaringe3. El curso de la IM puede durar de 2 a 6 semanas y la mayoría de los pacientes se recuperan bien4. Sin embargo, algunos individuos desarrollan síntomas persistentes o recurrentes similares a los IM con alta morbilidad y mortalidad, que se clasifica como infección crónica activa por VEB (VEB)5. Además, el VEB es un virus oncogénico importante, que está estrechamente relacionado con una variedad de neoplasias malignas, incluidas las neoplasias epitelioides y linfoides como el carcinoma nasofaríngeo, el linfoma de Burkitt, el linfoma de Hodgkin (LH) y el linfoma de células T/NK6. Aunque el VEB se ha estudiado durante más de 50 años, su patogénesis y el mecanismo por el cual induce la proliferación de linfocitos no se han dilucidado completamente.
Varios estudios han investigado las firmas moleculares para la inmunopatología de la infección por VEB mediante secuenciación del transcriptoma. Zhong et al. analizaron el perfil del transcriptoma completo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de niños chinos con IM o CAEBV para encontrar que la expansión de las células T CD8 + se encontró predominantemente en el grupo IM7, lo que sugiere que las células T CD8 + pueden desempeñar un papel importante en la IM. Del mismo modo, otro estudio encontró menores proporciones de células T y CD19+ B citotóxicas específicas del VEB y mayores porcentajes de linfocitos T CD8+ en pacientes con MI causada por infección primaria por VEB que en pacientes con MI causada tanto por reactivación del VEB como por otros agentes8. Las células B están involucradas primero en la IM porque los receptores de EBV se presentan en su superficie. Al Tabaa et al. encontraron que las células B se activaron policlonalmente y se diferenciaron en plasmablastos (CD19+, CD27+ y CD20−, y células CD138−) y células plasmáticas (CD19+, CD27+ y CD20−, y CD138+) durante IM9. Además, Zhong et al. encontraron que los marcadores de monocitos CD14 y CD64 estaban regulados al alza en CAEBV, lo que sugiere que los monocitos pueden desempeñar un papel importante en la respuesta inmune celular de CAEBV a través de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y fagocitosis hiperactiva7. Alka et al. caracterizaron el transcriptoma de células NK CD56dim CD16+ clasificadas por MACS de cuatro pacientes de IM o HL y encontraron que las células NK de IM y HL tenían inmunidad innata regulada a la baja y genes de señalización de quimiocinas, que podrían ser responsables de la hiporeactividad de las células NK10. Además, Greenough et al. analizaron la expresión génica de células T CD8 + clasificadas de 10 PBMC de individuos con IM. Informaron que una gran proporción de células T CD8 + en IM eran específicas del virus, activadas, en división y preparadas para ejercer actividades efectoras11. Tanto las respuestas mediadas por células T, específicas del VEB, como las respuestas no específicas mediadas por células NK desempeñan funciones esenciales durante la infección primaria por VEB. Sin embargo, estos estudios solo investigaron los resultados del transcriptoma de la mezcla diversa de células inmunes o solo una cierta subpoblación de linfocitos, lo que no es suficiente para la comparación exhaustiva de las características moleculares y funciones de diferentes subpoblaciones de células inmunes en niños con MI en el mismo estado de enfermedad.
Este documento describe un método que combina perlas inmunomagnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar y analizar subpoblaciones definidas de células inmunes de PBMC (monocitos, células T CD4 +, células T CD8 +, células B y células NK). Usando este método, las células magnéticas y marcadas con fluorescencia pueden purificarse usando un separador magnético y FACS o analizarse por citometría de flujo. El ARN se puede extraer de las células purificadas para la secuenciación del transcriptoma. Este método permitirá la caracterización y expresión génica de diferentes células inmunes en los mismos estados de enfermedad de individuos con MI, lo que ampliará nuestra comprensión de la inmunopatología de la infección por VEB.
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Protocol
Se obtuvieron muestras de sangre de pacientes con MI (n = 3), portadores sanos del VEB (n = 3) y niños no infectados por el VEB (n = 3). Se reclutaron voluntarios del Hospital de Niños de Beijing, la Universidad Médica Capital, y todos los estudios fueron aprobados éticamente. La aprobación ética fue obtenida por el Comité de Ética del Hospital de Niños de Beijing, Capital Medical University (Número de aprobación: [2021]-E-056-Y). Se renunció al consentimiento informado de los pacientes ya que el estudio solo utilizó las muestras restantes para las pruebas clínicas. Todos los datos fueron completamente desidentificados y anonimizados para proteger la privacidad del paciente.
1. Aislamiento de PBMC de sangre periférica
- Recolectar sangre periférica fresca (2 ml) de pacientes con IM en tubos con EDTAK3mediante venopunción estándar.
NOTA: El proceso debe ser rápido para mantener la viabilidad celular. - Diluir la sangre periférica al doble de volumen con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y colocarla sobre el medio de separación de linfocitos humanos (densidad: 1,077 ± 0,001 g/ml) en un tubo de centrífuga de 15 ml.
NOTA: La relación de volumen de sangre, PBS y medio de separación fue de 1:1:1. Agregue la sangre lentamente al medio de separación y centrifugar inmediatamente para evitar que la sangre se deposite en el medio de separación. - Centrifugar a 800 × g durante 20 min a temperatura ambiente. Transfiera la capa intermedia (PBMC enriquecidas) a otro tubo de centrífuga de 15 ml.
NOTA: Después de la centrifugación, en la parte inferior del tubo hay eritrocitos, la capa intermedia es el medio de separación, la capa superior es plasma y entre la capa de plasma y la capa líquida de separación estaban los PBMC (incluidos linfocitos y monocitos). - Lave las PBMC con 10 ml de PBS y centrifugar a 800 × g durante 20 min a temperatura ambiente; Deseche el sobrenadante cuidadosamente.
- Repetir el lavado y centrifugado (paso 1.4) 2 x. Vuelva a suspender las PBMC con 1 ml de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y cuente las células con un contador automatizado a base de azul de tripano.
2. Aislamiento de monocitos CD14+ de PBMCs utilizando microperlas CD14
- Preparar una solución tampón que contenga 0,5% de suero fetal bovino (FBS) y 2 mM de EDTA en PBS (pH 7.2). Mantener el tampón frío (2-8 °C).
NOTA: Desgasifique el tampón antes de usarlo ya que las burbujas de aire podrían bloquear la columna. Mantenga las células frías para evitar el tapado de los anticuerpos en la superficie celular y el etiquetado celular no específico. - Centrifugar las PBMC a 300 × g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante cuidadosamente. Resuspender las células con 80 μL del tampón. Agregue 20 μL de microperlas CD14 a la suspensión celular.
NOTA: Si hay ≤107 PBMC, utilice el volumen indicado anteriormente. Si hay >107 PBMC, aumente proporcionalmente todos los volúmenes de reactivos y el volumen total. - Mezclar bien las microperlas CD14 y las células en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e incubar durante 15 minutos en un refrigerador a 4 °C. Lave las PBMC con 1 ml de tampón y centrifugar a 300 × g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante por completo. Resuspender las células con 500 μL del tampón.
NOTA: Si hay ≤108 PBMC, utilice el volumen indicado anteriormente. Si hay >108 PBMC, aumente proporcionalmente el volumen del búfer. - Separación magnética con columnas:
- Coloque la columna en el separador de perlas magnéticas y lave la columna con 3 ml de tampón. Agregue la suspensión de celdas (del paso 2.3) a la columna.
- Recoja las células no marcadas que pasan a través de la columna en un tubo de centrífuga de 15 ml y lave la columna con 3 ml de tampón. Lave la columna con 3 x 3 ml de tampón. Recoger el efluente total en el tubo de centrífuga de 15 ml.
- Coloque la columna en un nuevo tubo centrífugo de 15 ml. Agregue 5 ml de búfer a la columna. Empuje el émbolo firmemente en la columna para eliminar inmediatamente las células marcadas magnéticamente en el tubo de centrífuga de 15 ml.
- Centrifugar las células marcadas magnéticamente a 300 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Resuspender las células en 500 μL de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para su uso en la secuenciación posterior del transcriptoma.
3. Separación de las poblaciones de linfocitos de las PBMC mediante tinción de anticuerpos marcados con fluorescencia y FACS
- Centrifugar las células no marcadas (paso 2.4.2) a 300 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Resuspender las células en 100 μL de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 2 μL de cada anticuerpo marcado (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) a los 100 μL de suspensión celular (los volúmenes y la información fluorófora conjugada de los anticuerpos se muestran en la Tabla 1), incubar en hielo durante 30 min, y proteger de la luz.
- Lave las células 2 veces añadiendo 1 ml de PBS y centrifugando a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender las células en 500 μL de PBS en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Vortex la suspensión celular suavemente antes de adquirir datos en un citómetro clasificador de células de flujo.
4. Ajuste de parámetros de citometría de flujo
- Tomar 100 μL de la suspensión celular (ver sección 1) en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml según sea necesario, y configurar una muestra de control negativo, una muestra de tinción única CD3, una muestra de tinción única CD4, una muestra de tinción única CD8, una muestra de tinción única CD19 y una muestra de tinción CD56/CD16.
- Agregue 2 μL del anticuerpo marcado fluorescentemente correspondiente por cada 100 μL de la suspensión celular y el vórtice. Incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Centrifugar durante 5 min a 300 × g y aspirar el sobrenadante. Resuspender los pellets con 500 μL de PBS y vórtice.
- Ponga en marcha el flujo de clasificación y retrase las gotas utilizando las perlas fluorescentes de la siguiente manera:
- Abra el sistema de clasificación de celdas, ejecute el programa de encendido, instale la boquilla de 85 μm y abra el flujo de clasificación. Ajuste el voltaje de clasificación a 4.500 V y el Freq a 47.
- Ajuste los parámetros principalmente ajustando el punto de ruptura de la gota de flujo principal y el retardo de gota de acuerdo con las instrucciones del fabricante12. Configure la primera posición del punto de interrupción de la gota (Drop1) en 275 y la Brecha en 8 en la ventana Breakoff . Active el modo de clasificación automática Sweet Spot para permitir que la citometría determine automáticamente el valor de amplitud de gotas para estabilizar el flujo.
- Ajuste el retardo de gotas a 30,31 en la ventana Flujo lateral cargando las perlas fluorescentes, asegurándose de que las perlas logren una desviación del flujo lateral del >99% en modo inicial o de ajuste fino.
- Consulte la estrategia de acceso que se muestra en la Figura 1 para realizar la activación de la siguiente manera:
- Usando un diagrama de puntos de área de dispersión directa (FSC-A)/área de dispersión lateral (SSC-A), dibuje la puerta del polígono (P1) para identificar la población de linfocitos intacta .
- Usando un diagrama de puntos FSC-A/FSC-height (FSC-H), dibuje la puerta del polígono (P2) para identificar las celdas individuales y excluir dobletes (Figura 1A).
- Usando un diagrama de puntos CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, dibuje la puerta rectangular (P3) para seleccionar las células T CD3+ y las células B CD19+ (Figura 1A,B).
- Usando un diagrama de puntos CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, dibuje una puerta rectangular para seleccionar células T CD4+ y células T CD8+ (células con una alta fluorescencia para estos marcadores, respectivamente).
- Usando un diagrama de puntos APC-A/SSC-A CD56/CD16, dibuje una puerta rectangular para seleccionar las celdas NK CD56+/CD16+ (Figura 1C).
- Ajuste los parámetros instrumentales utilizando la muestra de control negativo:
- Instale el tubo de control negativo en el puerto de carga y haga clic en Cargar en el panel de adquisiciones. Seleccione la configuración del citómetro en el software.
- En la ventana Inspector, haga clic en la pestaña Parámetros y ajuste los voltajes de FSC, SSC y diferentes tintes fluorescentes; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanine 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanine 5.5: 663.
- Ajustar la compensación utilizando las muestras de una sola tinción13.
- Cargue los tubos de una sola tinción en la citometría secuencialmente y seleccione Configuración del citómetro en el software. Haga clic en la ficha Compensación para ajustar la compensación.
NOTA: La referencia de compensación de la citometría de flujo se muestra en la Tabla 2.
- Cargue los tubos de una sola tinción en la citometría secuencialmente y seleccione Configuración del citómetro en el software. Haga clic en la ficha Compensación para ajustar la compensación.
5. Clasificación celular y recopilación de datos mediante citometría de flujo
- Vórtice la suspensión celular (PBMC separadas de acuerdo con las secciones 1-3) brevemente para resuspender las células antes de cargar el tubo en el citómetro. Mantenga los tubos restantes en hielo.
- Agregue 200 μL de FBS a cuatro tubos de flujo de recolección para evitar que las células clasificadas se peguen a la pared del tubo y colóquelas en la cámara de recolección del citómetro.
- Recolectar linfocitos T CD3+CD4+, linfocitos T CD3+CD8+, linfocitos B CD3−CD19+ y linfocitos NK CD3− CD56+/CD16+ por separado de la muestra de un paciente con IM en los cuatro tubos de flujo (Figura 2A).
- Centrifugar las células separadas a 300 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Agregue 200 μL de reactivo de aislamiento de ARN a las células para la secuenciación del transcriptoma.
- Separe las subpoblaciones de células inmunitarias de muestras de portadores sanos de VEB y niños no infectados por VEB de acuerdo con los pasos anteriores (Figura 2B, C).
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Representative Results
Referencia de la estrategia de compuerta
La estrategia de gating utilizada para ordenar las cuatro subpoblaciones de linfocitos se muestra en la Figura 1. Brevemente, los linfocitos se seleccionan (P1) en un diagrama de puntos que muestra la granulosidad (SSC-A) versus el tamaño (FSC-A). Luego, se seleccionan celdas individuales (P2) en un diagrama de puntos que muestra el tamaño (FSC-A) frente a la dispersión directa (FSC-H), mientras que las celdas dobles se excluyen. Las células T CD3+ (P3) y las células B CD19+ (Figura 1B) se seleccionan por separado en un diagrama de puntos que muestra el CD3 PerCP-Cy5.5-A frente al CD19 FITC-A. Las células T CD8+ y las células T CD4+ se seleccionan por separado en un diagrama de puntos que muestra CD8 PE-A frente a CD4 APC-Cy7-A de P3. Las células NK CD16+/CD56+ se seleccionan en un diagrama de puntos que muestra CD56/CD16 APC-A versus SSC-A de P4 (Figura 1C).
Los resultados representativos de cuatro subpoblaciones celulares clasificadas de las muestras de pacientes con MI por el método descrito se muestran en la Figura 2A. También realizamos la clasificación celular en muestras de portadores sanos del VEB y niños no infectados por el VEB como grupos de control para confirmar la viabilidad de este experimento. Los resultados representativos de las subpoblaciones celulares separadas de la muestra de un portador sano del VEB se muestran en la Figura 2B. El resultado representativo de las subpoblaciones celulares clasificadas de la muestra de niños no infectados por el VEB se muestra en la Figura 2C. Como se muestra en la Figura 2, P1 se cerró para identificar linfocitos y las células dobletes se excluyeron a través de P2; P3 se contrató para seleccionar células T CD3+ y P5 para seleccionar células B CD19+; Las células T CD3+ CD8+ (P6) y CD3+ CD4+ (P7) se seleccionaron por separado de P3; Las células NK CD16+/CD56+ (P8) se seleccionaron de P4. Cada una de estas subpoblaciones se puede clasificar individualmente y recolectar para experimentos posteriores. Este sistema se utilizó para analizar la expresión génica a través de la extracción de ARN y la secuenciación del transcriptoma.
Como se informó en la Tabla 3, se observó un aumento en las células T CD3+ CD8+ en pacientes con MI en comparación con los portadores sanos del VEB y los niños no infectados por el VEB (46,5 ± 4,0 vs. 27,0 ± 0,1 y 46,5 ± 4,0 vs. 24,7 ± 2,9, % de linfocitos T CD3+ CD8+ por linfocitos totales); Se observó una disminución de las proporciones de células T CD3+ CD4+ y células B CD19+ en pacientes con MI en comparación con portadores sanos de VEB y niños no infectados por VEB (13,4 ± 1,5 vs. 19,3 ± 1,5 y 13,4 ± 1,5 vs. 23,6 ± 3,2, % de linfocitos T CD4+ CD3+ por linfocitos totales; 1,4 ± 0,3 vs. 7,6 ± 0,7 y 1,4 ± 0,3 vs. 9,0 ± 1,5, % de linfocitos B CD19+ por linfocitos totales). Se observó una disminución de las proporciones de células NK CD16+/CD56+ en pacientes con MI en comparación con niños no infectados por VEB (7,5 ± 0,5 vs. 10,7 ± 0,4, % de células NK CD16+/CD56+ por linfocitos totales). Estos resultados validaron la efectividad de este protocolo de clasificación y demostraron que las proporciones de subconjuntos de linfocitos son diferentes en pacientes con MI y niños no infectados por VEB.
Figura 1: Estrategia general de activación utilizada para clasificar las subpoblaciones de células inmunes de las PBMC. (A) El filtro PerCP-Cy5.5 se utilizó para separar las células T CD3 +. Las células T CD8+ y las células T CD4+ se seleccionaron por separado en un diagrama de puntos que mostraba CD8 PE-A versus CD4 APC-Cy7-A de P3. (B) El filtro FITC se utilizó para identificar las células B CD19 +. (C) El filtro APC se utilizó para separar las células NK CD16+/CD56+ de P4. Abreviaturas: PBMCs = células mononucleares de sangre periférica; FSC-A = área de dispersión hacia adelante; SSC-A = área de dispersión lateral; FSC-H = altura de dispersión hacia adelante; PerCP = peridina-crorófila-proteína; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos de cuatro subpoblaciones celulares aisladas con éxito por el método descrito. (A) Cifras representativas de clasificación celular de la muestra de sangre periférica de paciente con IM. (B) Cifras representativas de clasificación celular de la muestra de sangre periférica de un portador sano del VEB. (C) Cifras representativas de clasificación celular de la muestra de sangre periférica de niños no infectados por EBV. P1, puerta de diagrama de puntos para identificar linfocitos; P2, puerta de diagrama de puntos para seleccionar celdas individuales; P3, puerta de diagrama de puntos para seleccionar células T CD3 +; P4, puerta de diagrama de puntos para identificar linfocitos CD3- CD19-; P5, puerta de diagrama de puntos para seleccionar células B CD19 +; P6, puerta de diagrama de puntos para seleccionar células T CD3+ CD8+ de P3; P7, puerta de diagrama de puntos para seleccionar células T CD3+ CD4+ de P3; P8, puerta de diagrama de puntos para seleccionar células NK CD16+/CD56+ de P4. Abreviaturas: EBV = virus de Epstein-Barr; IM = mononucleosis infecciosa; FSC-A = área de dispersión hacia adelante; SSC-A = área de dispersión lateral; FSC-H = altura de dispersión hacia adelante; PerCP = peridina-crorófila-proteína; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Diana de anticuerpos | Fluoróforo conjugado | Dosificación | Clon | Isotipo |
| CD3 | PerCP/cianina5.5 | 2 μL | SK7 | Ratón IgG1, κ |
| CD4 | APC/Cianina7 | 2 μL | SK3 | Ratón IgG1, κ |
| CD8 | PEI | 2 μL | SK1 | Ratón IgG1, κ |
| CD19 | FITC | 2 μL | HIB19 | Ratón IgG1, κ |
| CD56 | APC | 2 μL | 5.1H11 | Ratón IgG1, κ |
| CD16 | APC | 2 μL | 3G8 | Ratón IgG1, κ |
Tabla 1: Anticuerpos utilizados para citometría de flujo. Abreviaturas: PerCP = peridina-crorófila-proteína; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína.
| Referencia de compensación de la citometría de flujo (%) | |||||
| PEI | APC | APC-Cy7 | FITC | PerCP-Cy5.5 | |
| PEI | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| APC | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| FITC | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| PerCP-Cy5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
Tabla 2: Referencia de compensación de la citometría de flujo. Abreviaturas: PerCP = peridina-crorófila-proteína; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína.
| Proporción de linfocitos de diferentes subpoblaciones en linfocitos clasificados totales (%) | |||
| Subpoblación de linfocitos | IM | portadores sanos del VEB | Niños no infectados por el VEB |
| Células T CD3+ | 80,5 ± 1,8 | 70,2 ± 2,3 | 66,1 ± 2.1 |
| CD3+ Células T CD8+ | 46,5 ± 4,0 | 27,0 ± 0,1 | 24,7 ± 2,9 |
| CD3+ Células T CD4+ | 13,4 ± 1,5 | 19,3 ± 1,5 | 23,6 ± 3,2 |
| Células NK CD16+/CD56+ | 7,5 ± 0,5 | 2.2 ± 0.1 | 10,7 ± 0,4 |
| CD3- CD19+ Células B | 1.4 ± 0.3 | 7,6 ± 0,7 | 9,0 ± 1,5 |
Tabla 3: La proporción de linfocitos ordenados de diferentes grupos. Abreviaturas: EBV = virus de Epstein-Barr; IM = mononucleosis infecciosa; NK = asesino natural.
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Discussion
Este protocolo representa una forma eficiente de clasificar las subpoblaciones de células inmunes de sangre periférica. En este estudio, se seleccionaron muestras de sangre venosa de pacientes con MI, portadores sanos del VEB y niños no infectados por el VEB como objetivo de la investigación. Este trabajo utilizando la sangre periférica de pacientes de IM se centra principalmente en analizar y determinar las proporciones de diferentes subconjuntos celulares a través de la citometría de flujo multicolor. La secuenciación del transcriptoma se utiliza principalmente para la detección y el análisis de una determinada subpoblación de linfocitos que fue insuficiente para las comparaciones exhaustivas y específicas de las características moleculares y funciones de diferentes subpoblaciones de células inmunes en niños con MI en el mismo estado de enfermedad. Por lo tanto, clasificar varios tipos de células de la sangre periférica y realizar la secuenciación del transcriptoma para comparar las diferencias en los genes de expresión y las funciones de estas células inmunes podría proporcionar datos significativos para el estudio de la patogénesis de la IM.
La clasificación por sistemas de control del sistema de control de los bienes sobre el terreno tiene la ventaja adicional de poder procesar células vivas fraccionadas para otros experimentos in vitro o in vivo 14. Mantener la viabilidad celular es vital para experimentos posteriores. Hemos optimizado el paso de clasificación para mejorar la viabilidad celular en este protocolo: las manipulaciones experimentales se han realizado en hielo o en un refrigerador a 4 ° C. La velocidad y el tiempo de centrifugación adecuados también son críticos para el aislamiento celular. El rendimiento de las células clasificadas también es la principal limitación en este método, y el uso de tubos recubiertos con FBS durante la clasificación puede reducir en gran medida la pérdida de células que se adhieren a los tubos. Proporcionar la configuración adecuada para el clasificador FACS puede mejorar la eficiencia general de la clasificación al evitar el bloqueo celular o la contaminación cruzada en el tubo de recolección. A través de la optimización de pasos y configuraciones experimentales, este protocolo se puede extrapolar a la clasificación de otras células inmunes mediante la sustitución de etiquetas magnéticas o fluorescentes. Sin embargo, debido a la especificidad de las muestras de los niños (bajo volumen de recolección de sangre), solo investigamos las principales poblaciones de células inmunes (monocitos, células T CD4 +, células T CD8 +, células B y células NK) sin proceder a clasificar las subpoblaciones debido a la restricción del canal de clasificación de flujo. Este estudio demostró que las muestras de sangre periférica de niños inmunocompetentes y las muestras de IM podrían clasificar con éxito estos cinco grupos de células inmunes; sin embargo, las muestras de sangre de pacientes con neoplasias hematológicas malignas (p. ej., leucemia, linfoma), trastornos linfoproliferativos (p. ej., trastornos linfoproliferativos postrasplante, CAEBV) o inmunodeficiencia primaria/síndrome de inmunodeficiencia adquirida pueden no clasificarse con éxito de acuerdo con este protocolo.
La IM se considera una enfermedad autolimitada, y las células inmunes como las células T γδ, las células NKT y las células NK juegan un papel importante en la respuesta inmune antiviral15. Las células T CD8+ específicas del VEB se diferencian en gran medida hacia un fenotipo efector10,16, y hay contracción de la memoria efectora tardía y de las células efectoras de IM a convalecencia 17. Mientras tanto, las células NK en IM parecen ser funcionalmente defectuosas, incluida la falta de activación celular10, la pérdida de la señalización del receptor activador y la desgranulación18. Algunos estudios han encontrado que las células T CD4+ no solo pueden ayudar a las células T CD8+ a matar y eliminar las células B infectadas por el VEB, sino que también inhiben la proliferación de células B secretando citoquinas e incluso desempeñan directamente un papel asesino durante la infección por VEB19,20. Como se muestra en este estudio, se observó una mayor proporción de células T CD3 + CD8 + en pacientes con MI en comparación con portadores sanos de VEB y niños no infectados por VEB. Por el contrario, se observó una disminución de las proporciones de células T CD3+ CD4+, células B CD19+ y células NK CD16+/CD56+ en pacientes con MI en comparación con niños no infectados por el VEB. Sin embargo, la función y la expresión génica de estos diferentes subtipos de células inmunes en el mismo estado de enfermedad de IM siguen sin estar claras. Un análisis adicional de los perfiles de expresión génica de subconjuntos específicos de células inmunes en IM puede ayudar a obtener información sobre el mecanismo patogénico de IM.
Proporcionamos una estrategia que combina la clasificación de perlas inmunomagnéticas y FACS para aislar y analizar subpoblaciones de células inmunes definidas en PBMC. Los monocitos se separan primero utilizando microperlas CD14, y las PBMC restantes se tiñen con los correspondientes anticuerpos marcados con fluorescencia para clasificar las células T CD4 +, las células T CD8 +, las células B y las células NK a través de FACS. Además, utilizamos estas células clasificadas para la extracción de ARN y la secuenciación del transcriptoma para caracterizar la función y la expresión génica de diferentes células inmunes en la inmunopatología de la IM. La pureza y el rendimiento de las células clasificadas fueron generalmente suficientes para realizar estudios de expresión génica (datos no mostrados). Por lo tanto, el método de clasificación de subpoblaciones de células inmunes separadas se puede utilizar para explorar más a fondo los trastornos linfoproliferativos asociados al VEB, como CAEBV, trastorno linfoproliferativo posterior al trasplante para detectar genes patógenos, proteínas patógenas y posibles objetivos terapéuticos.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82002130), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7222059) y el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
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