Summary
Vi beskriver en metod som kombinerar immunomagnetiska pärlor och fluorescensaktiverad cellsortering för att isolera och analysera definierade immuncellssubpopulationer av mononukleära celler i perifert blod (monocyter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler och naturliga mördarceller). Med hjälp av denna metod kan magnetiska och fluorescerande märkta celler renas och analyseras.
Abstract
Infektiös mononukleos (IM) är ett akut syndrom som oftast förknippas med primär Epstein – Barr-virusinfektion (EBV). De viktigaste kliniska symptomen inkluderar oregelbunden feber, lymfadenopati och signifikant ökade lymfocyter i perifert blod. Den patogena mekanismen för IM är fortfarande oklar; Det finns ingen effektiv behandlingsmetod för det, med huvudsakligen symptomatiska terapier tillgängliga. Huvudfrågan i EBV-immunbiologi är varför endast en liten delmängd av infekterade individer visar allvarliga kliniska symtom och till och med utvecklar EBV-associerade maligniteter, medande flesta individer är asymptomatiska för livet med viruset.
B-celler är först involverade i IM eftersom EBV-receptorer presenteras på deras yta. Naturliga mördarceller (NK) är cytotoxiska medfödda lymfocyter som är viktiga för att döda EBV-infekterade celler. Andelen CD4 + T-celler minskar medan andelen CD8 + T-celler expanderar dramatiskt under akut EBV-infektion, och persistensen hos CD8 + T-celler är viktig för livslång kontroll av IM. Dessa immunceller spelar viktiga roller i IM, och deras funktioner måste identifieras separat. För detta ändamål separeras monocyter först från mononukleära celler i perifert blod (PBMC) hos IM-individer som använder CD14-mikrober, en kolonn och en magnetisk separator.
De återstående PBMC: erna är färgade med peridinin-klorofyllprotein (PerCP) / cyanin 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC) / Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isotiocyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 och APC anti-CD16 antikroppar för att sortera CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler och NK-celler med hjälp av en flödescytometer. Vidare utfördes transkriptomsekvensering av fem delpopulationer för att utforska deras funktioner och patogena mekanismer i IM.
Introduction
Epstein–Barr-virus (EBV), ett γ-herpesvirus även känt som humant herpesvirus typ 4, är allestädes närvarande i den mänskliga befolkningen och etablerar livslång latent infektion hos mer än 90% av den vuxna befolkningen1. De flesta EBV-primära infektioner inträffar under barndomen och tonåren, med en bråkdel av patienterna som manifesterar sig med infektiös mononukleos (IM)2, som visar karakteristisk immunopatologi, inklusive ett aktiverat immunsvar med CD8 + T-celler i blod och en övergående proliferation av EBV-infekterade B-celler i orofarynx3. Förloppet av IM kan pågå i 2–6 veckor och majoriteten av patienterna återhämtar sig väl4. Vissa individer utvecklar dock ihållande eller återkommande IM-liknande symtom med hög sjuklighet och dödlighet, vilket klassificeras som kronisk aktiv EBV-infektion (CAEBV)5. Dessutom är EBV ett viktigt onkogent virus, som är nära besläktat med en mängd olika maligniteter, inklusive epiteloida och lymfoida maligniteter såsom nasofaryngealt karcinom, Burkitts lymfom, Hodgkins lymfom (HL) och T / NK-celllymfom6. Även om EBV har studerats i över 50 år har dess patogenes och mekanismen genom vilken den inducerar proliferation av lymfocyter inte helt klarlagts.
Flera studier har undersökt de molekylära signaturerna för immunopatologin för EBV-infektion genom transkriptomsekvensering. analyserade hel-transkriptomprofilering av mononukleära celler i perifert blod (PBMC) från kinesiska barn med IM eller CAEBV för att upptäcka att CD8 + T-cellutvidgning övervägande hittades i IM-gruppen7, vilket tyder på att CD8 + T-celler kan spela en viktig roll i IM. På samma sätt fann en annan studie lägre andelar av EBV-specifika cytotoxiska T- och CD19 + B-celler och högre procentandelar av CD8 + T-celler hos patienter med IM orsakad av primär EBV-infektion än hos patienter med IM orsakad både av EBV-reaktivering och andra medel8. B-celler är först involverade i IM eftersom EBV-receptorer presenteras på deras yta. fann att B-celler aktiverades polyklonalt och differentierades tillplasmablaster (CD19 +, CD27 + och CD20 − och CD138 - celler) och plasmaceller (CD19 +, CD27 + och CD20 − och CD138 +) under IM 9. fann dessutom att monocytmarkörerna CD14 och CD64 var uppreglerade i CAEBV, vilket tyder på att monocyter kan spela en viktig roll i det cellulära immunsvaret hos CAEBV genom antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC) och hyperaktiv fagocytos7. karakteriserade transkriptomet av MACS-sorterade CD56dim CD16 + NK-celler från fyra patienter med IM eller HL och fann att NK-celler från både IM och HL hade nedreglerad medfödd immunitet och kemokinsignaleringsgener, vilket kan vara ansvarigt för hyporesponsiviteten hos NK-celler10. analyserade dessutom genuttryck av sorterade CD8 + T-celler från 10 PBMC av individer med IM. De rapporterade att en stor andel av CD8 + T-cellerna i IM var virusspecifika, aktiverade, delande och grundade för att utöva effektoraktiviteter11. Både T-cellmedierade, EBV-specifika svar och NK-cellmedierade, ospecifika svar spelar viktiga roller under primär EBV-infektion. Dessa studier undersökte emellertid endast transkriptomresultaten av den olika blandningen av immunceller eller endast en viss subpopulation av lymfocyter, vilket inte är tillräckligt för en omfattande jämförelse av molekylära egenskaper och funktioner hos olika immuncellssubpopulationer hos barn med IM vid samma sjukdomstillstånd.
Detta dokument beskriver en metod som kombinerar immunomagnetiska pärlor och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att isolera och analysera definierade immuncellssubpopulationer av PBMC (monocyter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler och NK-celler). Med hjälp av denna metod kan magnetiska och fluorescerande märkta celler renas med hjälp av en magnetisk separator och FACS eller analyseras med flödescytometri. RNA kan extraheras från de renade cellerna för transkriptomsekvensering. Denna metod kommer att möjliggöra karakterisering och genuttryck av olika immunceller i samma sjukdomstillstånd hos individer med IM, vilket kommer att utöka vår förståelse för immunopatologin för EBV-infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprover erhölls från patienter med IM (n = 3), friska EBV-bärare (n = 3) och EBV-oinfekterade barn (n = 3). Volontärer rekryterades från Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, och alla studier var etiskt godkända. Etiskt godkännande erhölls av etikkommittén vid Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkännandenummer: [2021] -E-056-Y). Informerat samtycke från patienter upphävdes eftersom studien endast använde de återstående proverna för klinisk testning. All data avidentifierades fullständigt och anonymiserades för att skydda patientens integritet.
1. Isolering av PBMC från perifert blod
- Samla färskt perifert blod (2 ml) från patienter med IM till K3EDTA-rör med standard venipunktur.
OBS: Processen måste vara snabb för att upprätthålla cellviabilitet. - Späd perifert blod till dubbel volym med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och lägg det ovanpå humant lymfocytseparationsmedium (densitet: 1,077 ± 0,001 g / ml) i ett 15 ml centrifugrör.
OBS: Volymförhållandet mellan blod, PBS och separationsmedium var 1:1:1. Tillsätt blodet långsamt till separationsmediet och centrifugera omedelbart för att undvika att blod sätter sig i separationsmediet. - Centrifugera vid 800 × g i 20 min vid rumstemperatur. Överför mellanskiktet (berikade PBMC) till ett annat 15 ml centrifugrör.
OBS: Efter centrifugering finns erytrocyter i botten av röret, mellanskiktet är separationsmediet, det övre lagret är plasma och mellan plasmaskiktet och separationsvätskeskiktet fanns PBMC: erna (inklusive lymfocyter och monocyter). - Tvätta PBMC med 10 ml PBS och centrifugera vid 800 × g i 20 min vid rumstemperatur; Kassera supernatanten försiktigt.
- Upprepa tvätten och centrifugeringen (steg 1.4) 2 x. Återsuspendera PBMC: erna med 1 ml PBS i ett 1.5 ml mikrocentrifugrör och räkna cellerna med en trypan blåbaserad, automatiserad räknare.
2. Isolering av CD14 + monocyter från PBMC med CD14-mikrober
- Bered en buffertlösning innehållande 0,5% fetalt bovint serum (FBS) och 2 mM EDTA i PBS (pH 7.2). Håll bufferten kall (2−8 °C).
OBS: Avgasa bufferten före användning eftersom luftbubblor kan blockera kolonnen. Håll cellerna kalla för att förhindra kapsling av antikropparna på cellytan och icke-specifik cellmärkning. - Centrifugera PBMC vid 300 × g i 10 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten försiktigt. Återsuspendera cellerna med 80 μl av bufferten. Tillsätt 20 μl CD14-mikrober till cellsuspensionen.
OBS: Om det finns ≤107 PBMC, använd volymen som anges ovan. Om det finns >107 PBMC, öka proportionellt alla reagensvolymer och den totala volymen. - Blanda CD14-mikroberna och cellerna väl i 1,5 ml mikrocentrifugröret och inkubera i 15 minuter i ett 4 °C kylskåp. Tvätta PBMC med 1 ml buffert och centrifugera vid 300 × g i 10 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten helt. Återsuspendera cellerna med 500 μl av bufferten.
OBS: Om det finns ≤108 PBMC, använd volymen som anges ovan. Om det finns >108 PBMC, öka buffertvolymen proportionellt. - Magnetisk separation med kolumner:
- Sätt kolonnen på magnetpärlseparatorn och tvätta kolonnen med 3 ml buffert. Lägg till cellsuspensionen (från steg 2.3) i kolumnen.
- Samla de omärkta cellerna som passerar genom kolonnen i ett 15 ml centrifugrör och tvätta kolonnen med 3 ml buffert. Tvätta kolonnen med 3 x 3 ml buffert. Samla det totala avloppsvattnet i 15 ml centrifugröret.
- Placera kolonnen i ett nytt centrifugrör på 15 ml. Lägg till 5 ml buffert i kolumnen. Tryck in kolven ordentligt i kolonnen för att omedelbart spola ut de magnetiskt märkta cellerna i centrifugröret på 15 ml.
- Centrifugera de magnetiskt märkta cellerna vid 300 × g i 5 minuter och ta bort supernatanten. Återsuspendera cellerna i 500 μL PBS i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör för användning vid efterföljande transkriptomsekvensering.
3. Separation av lymfocytpopulationer från PBMC genom fluorescerande märkt antikroppsfärgning och FACS
- Centrifugera de omärkta cellerna (steg 2.4.2) vid 300 × g i 5 minuter och avlägsna supernatanten. Återsuspendera cellerna i 100 μL PBS i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 2 μl av varje märkt antikropp (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) till 100 μl cellsuspension (volymerna och konjugerad fluoroforinformation för antikroppar visas i tabell 1), inkubera på is i 30 minuter och skydda mot ljus.
- Tvätta cellerna 2 x genom att tillsätta 1 ml PBS och centrifugera vid 300 × g i 5 minuter vid rumstemperatur. Återsuspendera cellerna i 500 μL PBS i 1,5 ml mikrocentrifugröret. Vörda cellsuspensionen försiktigt innan du hämtar data på en flödescellssorterare.
4. Inställning av flödescytometriparametern
- Ta 100 μl av cellsuspensionen (se avsnitt 1) i 1,5 ml mikrocentrifugrör efter behov och ställ in ett negativt kontrollprov, ett CD3-prov med en färgning, ett CD4-prov med en färgning, ett CD8-prov med en färgning, ett CD19-prov med en färgning och ett CD56/CD16-färgningsprov.
- Tillsätt 2 μl av motsvarande fluorescerande märkta antikropp per 100 μl av cellsuspensionen och virveln. Inkubera på is i 30 min i mörkret. Centrifugera i 5 minuter vid 300 × g och aspirera supernatanten. Återsuspendera pelletsen med 500 μL PBS och virvel.
- Beställ sorteringsströmmen och fördröj dropparna med hjälp av lysrören enligt följande:
- Öppna cellsorteringssystemet, kör startprogrammet, installera 85 μm munstycket och öppna sorteringsströmmen. Ställ in sorteringsspänningen på 4 500 V och Freq på 47.
- Justera parametrarna huvudsakligen genom att justera brytpunkten för huvudflödesdroppen och droppfördröjningen enligt tillverkarens instruktioner12. Ställ in den första brytpunktspositionen för droppen (Drop1) till 275 och gapet till 8 i fönstret Avbrott . Slå på Sweet Spot automatiska sorteringsläge så att cytometrin automatiskt kan bestämma droppamplitudvärdet för att stabilisera strömmen.
- Justera droppfördröjningen till 30,31 i sidoströmsfönstret genom att ladda de fluorescerande pärlorna, så att pärlorna uppnår en sidoflödesböjning på >99% i antingen initialt eller finjusterat läge.
- Se grindstrategin som visas i figur 1 för att utföra gating enligt följande:
- Använd ett framåtriktat spridningsområde (FSC-A)/sidospridningsområde (SSC-A) punktdiagram och rita polygonporten (P1) för att identifiera den intakta lymfocytpopulationen .
- Använd ett punktdiagram för FSC-A/FSC-höjd (FSC-H) och rita polygongrinden (P2) för att identifiera de enskilda cellerna och utesluta dubbletter (figur 1A).
- Använd ett CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A punktdiagram och rita den rektangulära grinden (P3) för att välja CD3+ T-celler och CD19+ B-celler (bild 1A,B).
- Använd ett CD4 APC-Cy7-A / CD8 PE-A-punktdiagram och rita en rektangulär grind för att välja CD4 + T-celler och CD8 + T-celler (celler med hög fluorescens för dessa markörer).
- Använd ett CD56/CD16 APC-A/SSC-A-punktdiagram och rita en rektangulär grind för att välja CD56+/CD16+ NK-celler (bild 1C).
- Justera instrumentella parametrar med hjälp av det negativa kontrollprovet:
- Installera det negativa kontrollröret på laddningsporten och klicka på Läs in i instrumentpanelen för anskaffning. Välj cytometerinställningarna i programvaran.
- I fönstret Granskare klickar du på fliken Parametrar och justerar spänningarna för FSC, SSC och olika fluorescerande färgämnen. FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-cyanin 7: 824, FITC: 555, PerCP-cyanin 5.5: 663.
- Justera kompensationen med hjälp av de enkelfärgade proverna13.
- Ladda de enkelfärgade rören på cytometrin sekventiellt och välj Cytometerinställningar i programvaran. Klicka på fliken Kompensation för att justera kompensationen.
OBS: Kompensationsreferensen för flödescytometri visas i tabell 2.
- Ladda de enkelfärgade rören på cytometrin sekventiellt och välj Cytometerinställningar i programvaran. Klicka på fliken Kompensation för att justera kompensationen.
5. Cellsortering och insamling av data via flödescytometri
- Vortex cellsuspensionen (separerade PBMC enligt avsnitt 1–3) kort för att återsuspendera cellerna innan röret laddas i cytometern. Håll de återstående rören på is.
- Tillsätt 200 μL FBS till fyra uppsamlingsflödesrör för att undvika att de sorterade cellerna fastnar på rörväggen och placera dem i cytometeruppsamlingskammaren.
- Samla CD3+CD4+ T-celler, CD3+CD8+ T-celler, CD3−CD19+ B-celler och CD3− CD56+/CD16+ NK-celler separat från provet från en patient med IM i de fyra flödesrören (figur 2A).
- Centrifugera de separerade cellerna vid 300 × g i 5 minuter och avlägsna supernatanten. Tillsätt 200 μl RNA-isoleringsreagens till cellerna för transkriptomsekvensering.
- Separera immuncellunderpopulationerna av prover från friska EBV-bärare och EBV-oinfekterade barn enligt ovanstående steg (figur 2B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hänvisning till grindstrategin
Gatingstrategin som används för att sortera de fyra lymfocytunderpopulationerna visas i figur 1. Kortfattat väljs lymfocyter (P1) på ett punktdiagram som visar granulositeten (SSC-A) kontra storleken (FSC-A). Sedan markeras enstaka celler (P2) på ett punktdiagram som visar storleken (FSC-A) kontra framåtriktad spridning (FSC-H), medan dubblettceller utesluts. CD3+ T-celler (P3) och CD19+ B-celler (bild 1B) väljs separat i ett punktdiagram som visar CD3 PerCP-Cy5.5-A jämfört med CD19 FITC-A. CD8 + T-celler och CD4 + T-celler väljs separat på ett punktdiagram som visar CD8 PE-A kontra CD4 APC-Cy7-A från P3. CD16+/CD56+ NK-celler är markerade i ett punktdiagram som visar CD56/CD16 APC-A jämfört med SSC-A från P4 (bild 1C).
De representativa resultaten av fyra cellunderpopulationer sorterade från prover av patienter med IM med den beskrivna metoden visas i figur 2A. Vi utförde också cellsortering på prover från friska EBV-bärare och EBV-oinfekterade barn som kontrollgrupper för att bekräfta genomförbarheten av detta experiment. De representativa resultaten av cellunderpopulationer separerade från en frisk EBV-bärarprov visas i figur 2B. Det representativa resultatet av cellunderpopulationer sorterade från provet av EBV-oinfekterade barn visas i figur 2C. Som visas i figur 2 var P1 gated för att identifiera lymfocyter och dubblettceller uteslöts genom P2; P3 var gated för att välja CD3 + T-celler och P5 var gated för att välja CD19 + B-celler; CD3 + CD8 + T-celler (P6) och CD3 + CD4 + T-celler (P7) valdes separat från P3; CD16+/CD56+ NK-celler (P8) valdes från P4. Var och en av dessa delpopulationer kan sorteras individuellt och samlas in för nedströmsexperiment. Detta system användes för att analysera genuttryck genom RNA-extraktion och transkriptomsekvensering.
Som rapporterats i tabell 3 observerades en ökning av CD3 + CD8 + T-celler hos patienter med IM jämfört med både friska EBV-bärare och EBV-oinfekterade barn (46,5 ± 4,0 jämfört med 27,0 ± 0,1 och 46,5 ± 4,0 jämfört med 24,7 ± 2,9, % CD3 + CD8 + T-celler per totala lymfocyter); Minskade andelar av CD3 + CD4 + T-celler och CD19 + B-celler observerades hos patienter med IM jämfört med friska EBV-bärare och EBV-oinfekterade barn (13,4 ± 1,5 mot 19,3 ± 1,5 och 13,4 ± 1,5 jämfört med 23,6 ± 3,2, % CD3 + CD4 + T-celler per totala lymfocyter; 1,4 ± 0,3 jämfört med 7,6 ± 0,7 och 1,4 ± 0,3 jämfört med 9,0 ± 1,5, % CD19 + B-celler per totalt lymfocyter). Minskade andelar av CD16+/CD56+ NK-celler observerades hos patienter med IM jämfört med EBV-oinfekterade barn (7,5 ± 0,5 jämfört med 10,7 ± 0,4, % CD16+/CD56+ NK-celler per totalt lymfocyter). Dessa resultat validerade effektiviteten av detta sorteringsprotokoll och visade att proportionerna av lymfocytundergrupper är olika hos patienter med IM och EBV-oinfekterade barn.
Figur 1: Övergripande gatingstrategi som används för att sortera immuncellsunderpopulationer från PBMC. (A) PerCP-Cy5.5-filtret användes för att separera CD3 + T-celler. CD8 + T-celler och CD4 + T-celler valdes separat på ett punktdiagram som visar CD8 PE-A kontra CD4 APC-Cy7-A från P3. (B) FITC-filtret användes för att identifiera CD19 + B-celler. (C) APC-filtret användes för att separera CD16+/CD56+ NK-celler från P4. Förkortningar: PBMC = mononukleära celler i perifert blod; FSC-A = spridningsområde framåt; SSC-A = sidospridningsområde; FSC-H = spridningshöjd framåt; PerCP = peridinin-kromofyllprotein; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa resultat av fyra celldelpopulationer som framgångsrikt isolerats med den beskrivna metoden. (A) Representativa cellsorteringssiffror från det perifera blodprovet från patienten med IM. (B) Representativa cellsorteringssiffror från det perifera blodprovet från frisk EBV-bärare. C) Representativa cellsorteringssiffror från provet av perifert blod från EBV-oinfekterade barn. P1, dot plot gate för att identifiera lymfocyter; P2, punktplottport för att välja enstaka celler; P3, punktplottport för att välja CD3 + T-celler; P4, punktplottport för att identifiera CD3- CD19- lymfocyter; P5, punktplottport för att välja CD19 + B-celler; P6, punktplottport för att välja CD3 + CD8 + T-celler från P3; P7, punktplottport för att välja CD3 + CD4 + T-celler från P3; P8, punktdiagram grind för att välja CD16 + / CD56 + NK-celler från P4. Förkortningar: EBV = Epstein–Barr-virus; IM = infektiös mononukleos; FSC-A = spridningsområde framåt; SSC-A = sidospridningsområde; FSC-H = spridningshöjd framåt; PerCP = peridinin-kromofyllprotein; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antikroppsmål | Konjugerad fluorofor | Dosering | Klon | Isotyp |
| CD3 | PerCP/cyanin5.5 | 2 μl | SK7 | Mus IgG1, κ |
| CD4 | APC/cyanin7 | 2 μl | SK3 | Mus IgG1, κ |
| CD8 | PE | 2 μl | SK1 | Mus IgG1, κ |
| CD19 | FITC | 2 μl | HIB19 | Mus IgG1, κ |
| CD56 | APC | 2 μl | 5.1H11 | Mus IgG1, κ |
| CD16 | APC | 2 μl | 3G8 | Mus IgG1, κ |
Tabell 1: Antikroppar som används för flödescytometri. Förkortningar: PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat.
| Kompensationsreferens för flödescytometri (%) | |||||
| PE | APC | APC-CY7 | FITC | PerCP-CY5,5 | |
| PE | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| APC | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-CY7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| FITC | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| PerCP-CY5,5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
Tabell 2: Kompensationsreferens för flödescytometri. Förkortningar: PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat.
| Andel lymfocyter i olika delpopulationer av totalt sorterade lymfocyter (%) | |||
| lymfocyter subpopulation | IM | friska EBV-bärare | EBV-oinfekterade barn |
| CD3+ T-celler | 80,5 ± 1,8 | 70.2 ± 2.3 | 66.1 ± 2.1 |
| CD3 + CD8 + T-celler | 46,5 ± 4,0 | 27,0 ± 0,1 | 24.7 ± 2.9 |
| CD3+ CD4+ T-celler | 13.4 ± 1.5 | 19.3 ± 1.5 | 23.6 ± 3.2 |
| CD16+/CD56+ NK-celler | 7,5 ± 0,5 | 2.2 ± 0,1 | 10,7 ± 0,4 |
| CD3- CD19+ B-celler | 1.4 ± 0,3 | 7,6 ± 0,7 | 9,0 ± 1,5 |
Tabell 3: Andelen sorterade lymfocyter i olika grupper. Förkortningar: EBV = Epstein–Barr-virus; IM = infektiös mononukleos; NK = naturlig mördare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll representerar ett effektivt sätt att sortera perifera blodimmunceller subpopulationer. I denna studie valdes venösa blodprover från patienter med IM, friska EBV-bärare och EBV-oinfekterade barn som forskningsmål. Detta arbete med hjälp av perifert blod hos patienter med IM fokuserar huvudsakligen på att analysera och bestämma proportionerna av olika cellundergrupper genom flerfärgsflödescytometri. Transkriptomsekvensering används huvudsakligen för detektion och analys av en viss delpopulation av lymfocyter som var otillräcklig för de omfattande och specifika jämförelserna av molekylära egenskaper och funktioner hos olika immuncellssubpopulationer hos barn med IM vid samma sjukdomstillstånd. Därför kan sortering av flera typer av celler från det perifera blodet och utföra transkriptomsekvensering för att jämföra skillnaderna i uttrycksgener och funktioner hos dessa immunceller ge betydande data för studier av patogenesen av IM.
FACS-sortering har den ytterligare fördelen att kunna bearbeta levande, fraktionerade celler för ytterligare in vitro- eller in vivo-experiment 14. Att upprätthålla cellviabiliteten är avgörande för efterföljande experiment. Vi har optimerat sorteringssteget för att förbättra cellviabiliteten i detta protokollexperimentella manipuleringar har utförts på is eller i ett 4 °C kylskåp. Korrekt centrifugeringshastighet och tid är också avgörande för cellisolering. Utbytet av sorterade celler är också den största begränsningen i denna metod, och användningen av FBS-belagda rör under sortering kan kraftigt minska förlusten av celler som fäster vid rören. Att tillhandahålla rätt inställningar för FACS-sorteraren kan förbättra sorteringens totala effektivitet genom att undvika cellblockering eller korskontaminering i uppsamlingsröret. Genom optimering av experimentella steg och inställningar kan detta protokoll extrapoleras till sortering av andra immunceller genom att ersätta magnetiska eller fluorescerande etiketter. På grund av specificiteten hos barnproverna (låg bloduppsamlingsvolym) undersökte vi dock bara de viktigaste populationerna av immunceller (monocyter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler och NK-celler) utan att fortsätta att sortera subpopulationer på grund av begränsningen av flödessorteringskanalen. Denna studie visade att perifera blodprover från immunkompetenta barn och prover från IM framgångsrikt kunde sortera ut dessa fem grupper av immunceller; blodproverna från patienter med hematologiska maligniteter (t.ex. leukemi, lymfom), lymfoproliferativa störningar (t.ex. posttransplanterade lymfoproliferativa störningar, CAEBV) eller primär immunbrist/förvärvat immunbristsyndrom kan dock inte sorteras framgångsrikt enligt detta protokoll.
IM anses vara en självbegränsande sjukdom, och immunceller som γδ T-celler, NKT-celler och NK-celler spelar en viktig roll i det antivirala immunsvaret15. EBV-specifika CD8 + T-celler är till stor del differentierade mot en effektorfenotyp10,16, och det finns sammandragning av sent effektorminne och effektorceller från IM till konvalescens 17. Under tiden verkar NK-celler i IM vara funktionellt defekta, inklusive brist på cellaktivering10, förlust av aktiverande receptorsignalering och degranulering18. Vissa studier har visat att CD4 + T-celler inte bara kan hjälpa CD8 + T-celler att döda och eliminera EBV-infekterade B-celler utan också hämma spridningen av B-celler genom att utsöndra cytokiner och till och med direkt spela en dödande roll under EBV-infektion19,20. Som visats i denna studie observerades en ökad andel CD3 + CD8 + T-celler hos patienter med IM jämfört med både friska EBV-bärare och EBV-oinfekterade barn. Däremot observerades minskade andelar av CD3 + CD4 + T-celler, CD19 + B-celler och CD16 + / / CD56 + NK-celler hos patienter med IM jämfört med EBV-oinfekterade barn. Funktionen och genuttrycket hos dessa olika subtyper av immunceller i samma sjukdomstillstånd som IM är dock fortfarande oklart. Ytterligare analys av genuttrycksprofilerna för specifika immuncellsundergrupper i IM kan hjälpa till att få insikt i den patogena mekanismen för IM.
Vi tillhandahåller en strategi som kombinerar immunomagnetisk pärlsortering och FACS för att isolera och analysera definierade immuncellssubpopulationer i PBMC. Monocyter separeras först med CD14-mikropärlor, och de återstående PBMC: erna färgas med motsvarande fluorescerande märkta antikroppar för att sortera CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler och NK-celler genom FACS. Vi använde vidare dessa sorterade celler för RNA-extraktion och transkriptomsekvensering för att karakterisera funktionen och genuttrycket hos olika immunceller i immunopatologin för IM. Renheten och utbytet av de sorterade cellerna var i allmänhet tillräckligt för att genomföra genuttrycksstudier (data visas inte). Därför kan sorteringsmetoden för separata immuncellssubpopulationer användas för att ytterligare utforska EBV-associerade lymfoproliferativa störningar såsom CAEBV, lymfoproliferativ störning efter transplantation för att upptäcka patogena gener, patogena proteiner och potentiella terapeutiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation (7222059) och CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
