Summary
Den nuværende protokol beskriver bioengineering af ydre membranvesikler som en "Plug-and-Display" vaccineplatform, herunder produktion, oprensning, biokonjugation og karakterisering.
Abstract
Biomimetiske nanopartikler opnået fra bakterier eller vira har tiltrukket sig betydelig interesse for vaccineforskning og -udvikling. Ydre membranvesikler (OMV'er) udskilles hovedsageligt af gramnegative bakterier under gennemsnitlig vækst med en diameter i nanostørrelse og selvadjuverende aktivitet, hvilket kan være ideelt til vaccinelevering. OMV'er har fungeret som et mangesidet leveringssystem for proteiner, nukleinsyrer og små molekyler. For at drage fuld fordel af OMV'ernes biologiske egenskaber blev bioengineerede Escherichia coli-afledte OMV'er anvendt som bærer og SARS-CoV-2-receptorbindende domæne (RBD) som et antigen til at konstruere en "Plug-and-Display" vaccineplatform. SpyCatcher (SC) og SpyTag (ST) domænerne i Streptococcus pyogenes blev anvendt til konjugering af OMV'er og RBD. Cytolysin A (ClyA) genet blev oversat med SC-genet som et fusionsprotein efter plasmidtransfektion, hvilket efterlod et reaktivt sted på overfladen af OMV'erne. Efter blanding af RBD-ST i et konventionelt buffersystem natten over blev der dannet kovalent binding mellem OMV'erne og RBD. Således blev der opnået en multivalent OMV-vaccine. Ved at erstatte med forskellige antigener kan OMV-vaccineplatformen effektivt vise en række heterogene antigener og derved potentielt hurtigt forhindre infektionssygdomsepidemier. Denne protokol beskriver en præcis metode til konstruktion af OMV-vaccineplatformen, herunder produktion, oprensning, biokonjugation og karakterisering.
Introduction
Som en potentiel vaccineplatform har ydre membranvesikler (OMV'er) tiltrukket sig mere og mere opmærksomhed i de senere år 1,2. OMV'er, der hovedsageligt udskilles naturligt af gramnegative bakterier3, er sfæriske nanoskalapartikler sammensat af et lipiddobbeltlag, normalt i størrelsen 20-300 nm4. OMV'er indeholder forskellige forældrebakteriekomponenter, herunder bakterielle antigener og patogenassocierede molekylære mønstre (PAMP'er), der tjener som faste immunpotentiatorer5. Ved at drage fordel af deres unikke komponenter, naturlige vesikelstruktur og store genteknologiske modifikationssteder er OMV'er blevet udviklet til brug inden for mange biomedicinske områder, herunder bakterielle vacciner6, adjuvanser7, kræftimmunterapilægemidler8, lægemiddelafgivelsesvektorer9 og antibakterielle klæbemidler10.
SARS-CoV-2-pandemien, der har spredt sig over hele verden siden 2020, har taget hårdt på det globale samfund. Det receptorbindende domæne (RBD) i spike-protein (S-protein) kan binde med humant angiotensin-konverterende enzym 2 (ACE2), som derefter medierer virusets indtræden i cellen11,12,13. RBD ser således ud til at være et primært mål for vaccineopdagelse14,15,16. Imidlertid er monomer RBD dårligt immunogen, og dens lille molekylvægt gør det vanskeligt for immunsystemet at genkende, så adjuvanser kræves ofte17.
For at øge immunogeniciteten af RBD blev OMV'er, der viste polyvalente RBD'er, konstrueret. Eksisterende undersøgelser, der bruger OMV til at vise RBD, smelter normalt RBD sammen med OMV, der skal udtrykkes i bakterier18. RBD er imidlertid et virusafledt protein, og prokaryot ekspression vil sandsynligvis påvirke dets aktivitet. For at løse dette problem blev SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) -systemet, der stammer fra Streptococcus pyogenes, brugt til at danne et kovalent isopeptid med OMV og RBD i et konventionelt buffersystem19. SC-domænet blev udtrykt med Cytolysin A (ClyA) som et fusionsprotein af bioengineered Escherichia coli, og ST blev udtrykt med RBD via HEK293F cellulært ekspressionssystem. OMV-SC og RBD-ST blev blandet og inkuberet natten over. Efter oprensning ved ultracentrifugering eller størrelsesekskluderende kromatografi (SEC) blev omv-rbd opnået.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmid konstruktion
- Indsæt DNA-kodning af SpyCatcher-sekvens (supplerende fil 1) i et ampicillinresistent pThioHisA-ClyA-plasmid (se Materialetabel) mellem BamH I- og Sal I-stederne for at konstruere plasmidet pThioHisA ClyA-SC efter en tidligere offentliggjort rapport20.
- Sammensæt det syntetiserede SpyTag-RBD-Histag fusionsgen (supplerende fil 1) i et pcDNA3.1 plasmid (se Materialetabel) mellem BamH I- og EcoR I-stederne for at konstruere plasmidet pcDNA3.1 RBD-ST efter en tidligere offentliggjort rapport19.
2. Forberedelse af OMV-SC
- Udfør ClyA-SC-transformation ved at følge nedenstående trin.
- Tilsæt 5 μL pThioHisA ClyA-SC plasmidopløsning (50 ng/μL) til 50 μL BL21 kompetent stamme, blæs forsigtigt, og lad afkøle på is i 30 min.
- Opløsningen til 90 s anbringes i vandbadet ved 42 °C, og lægges derefter straks den blandede opløsning på is i 3 min.
- Der tilsættes 500 μL LB-medium til bakteriesuspensionen, og efter blanding dyrkes det ved 220 o/min ved 37 °C i 1 time.
- Plade al omdannelse til en LB-agarplade indeholdende ampicillin (100 μg/ml, se materialetabel) og dyrkning natten over ved 37 °C.
BEMÆRK: I efterfølgende forsøg blev ampicillinet holdt i samme koncentration i mediet. Hvis ikke, kan dette medføre tab af plasmider i bakterierne.
- For OMV-SC-produktion skal du udføre nedenstående trin.
- En enkelt koloni isoleres fra pladen (trin 2.1.4.) til 20 ml LB (ampicillinresistent) medium og kultur natten over ved 220 o / min ved 37 °C.
- Bakterieopløsningen (fra trin 2.2.1.) podes i 2 L medium, dyrkning ved 220 o / min, 37 °C i 5 timer indtil det logaritmiske vækststadium (OD600 nm er mellem 0,6 og 0,8).
- Når OD ved 600 nm af bakterieopløsningen når 0,6-0,8, tilsættes isopropyl beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG, se Materialetabel) for at gøre den endelige koncentration af bakterieopløsningen til 0,5 mM, og derefter kultur natten over ved 220 o / min ved 25 ° C.
- Udfør OMV-SC-rensning.
- Bakterieopløsningen centrifugeres ved 7.000 x g ved 4 °C i 30 min.
- Supernatanten filtreres med et 0,22 μm membranfilter, og koncentrer den derefter ved hjælp af en 100 kD ultrafiltreringsmembran eller hul fibersøjle (se Materialetabel).
- Koncentratet filtreres gennem et 0,22 μm membranfilter, centrifugeres derefter ved 150.000 x g ved 4 °C i 2 timer ved hjælp af en ultracentrifuge (se Materialetabel), og supernatanten kasseres med en pipette.
- Resuspender nedbøren med PBS og opbevares ved -80 °C. Løsningen kan opretholde langsigtet stabilitet ved -80 °C.
3. Forberedelse af RBD-ST
- Udfør RBD-ST-transfektion ved at følge nedenstående trin.
- Vælg et passende eukaryot ekspressionssystem (f.eks. HEK293F), og dyrk cellerne natten over ved 130 o / min ved 37 ° C efter genopretning.
- Tilsæt 20 μL HEK293F-celleopløsning i den automatiserede celletæller (se Materialetabel), registrer antallet af celler, juster koncentrationen til 1 x 106 celler / ml, og oplev derefter cellerne ved 130 o / min ved 37 ° C i 4 timer.
- Rbd-ST-plasmid filtreres gennem et 0,22 μm membranfilter, og der tilsættes 300 μg plasmider i cellekulturmediet (se Materialetabel), indtil det endelige volumen er 10 ml; ryst i 10 s.
- PEI opvarmes (1 mg/ml, se materialetabel) til 65 °C i vandbadet, der blandes 0,7 ml PEI med 9,3 ml cellekulturmedium, og der rystes intermitterende i 10 s.
BEMÆRK: Ryst ikke opløsningen kraftigt. Ellers kan de resulterende bobler påvirke transfektionseffektiviteten. - Der tilsættes plasmidopløsning til PEI-opløsningen, blandes periodisk i 10 s, og den inkuberes ved 37 °C i 15 min.
- Blandingen tilsættes til 280 ml cellekulturmedium og dyrkes ved 130 o/min ved 37 °C i 5 dage.
- Udfør RBD-ST-rensning.
- Centrifuger cellerne ved 6.000 x g ved 25 °C i 20 minutter, og brug en pipette til at opsamle supernatanten.
- Fyld søjlen med 2 ml Ni-NTA agarose (se Materialefortegnelse) og vask den 3x med 3x PBS.
- Tilsæt imidazol (se Materialetabel) i cellesupernatanten for at gøre den endelige koncentration på 20 mM, og læg cellesupernatanten 2x.
- Der tilsættes 3 kolonnevolumener (CV) PBS indeholdende 20 mM imidazol til vask, og vaskefraktionen opsamles.
- Gradientelue med 3 CV PBS indeholdende lave til høje koncentrationer (f.eks. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) imidazol; elut 2x for hver koncentration.
- Brug SDS-SIDE21 til at identificere RBD-ST i forskellige koncentrationsgradienter.
4. OMV-RBD biokonjugation og oprensning
- Proteinkoncentrationen bestemmes ved BCA-metoden (se Materialetabel).
- Serielt fortyndes standard BSA-proteinopløsningen fra 2 mg/ml til 0,0625 mg/ml, fortyndes den oprensede OMV-SC og RBD-ST 10x, og bland derefter BCA-arbejdsløsningerne A og B (angivet i analysesættet) i et forhold på 50:1 (v/v).
- Tilsæt fortyndet proteinopløsning (25 μL/brønd) og bland med BCA-arbejdsopløsning (200 μL/brønd); inkuberes ved 37 °C i 30 min.
- Absorbansen (OD) måles ved 562 nm for hver brønd, og proteinkoncentrationen beregnes ud fra standardkurven22.
- Udfør biokonjugering af OMV-SC og RBD-ST ved at følge nedenstående trin.
- Bland OMV-SC og RBD-ST i PBS i forholdet 40:1 (w/w).
- Drej lodret for at blande blandingen natten over ved 15 o / min ved 4 °C.
BEMÆRK: Forskellige antigener kan reagere i forskellige proportioner. Man kunne prøve forskellige reaktionsforhold baseret på antigenets egenskaber.
- Kontroller reaktionseffektiviteten.
- Der fremstilles 10 μL OMV-SC, RBD-ST og reaktionsproduktet (trin 4.2.). Der tilsættes 2,5 μL 5x læssebuffer (se materialetabel), og prøverne opvarmes ved 100 °C i 5 min. Prøverne lægges i gelen (10 μL/brønd). Udfør elektroforese ved 60 V i 20 minutter og skift tilstanden til 120 V i 1 time.
- Overfør proteinet fra gelen til PVDF western blotting membraner (se Materialetabel) ved 100 V i 70 min.
- Kom membranen i 5% fedtfri mælkepulver/TBST og ryst i 1 time. Vask derefter 3x med TBST i 5 minutter pr. vask med rystelser.
- Sæt membranen i 0,1% His-Tag antistof/TBST (se Materialetabel) og ryst i 1 time, vask derefter 3x med TBST i 5 min pr. vask med omrystning.
- Sæt membranen i 0,02% anti-mus IgG1 antistof (HRP)/TBST (se Materialetabel) og ryst i 40 min, vask derefter 3x med TBST i 5 minutter pr. vask med omrystning.
- Tilsæt forbedret kemiluminescensopløsning (se Materialetabel) og udsæt membranen.
- Udfør rensning af OMV-RBD.
- 1 ml omsat OMV-RBD-opløsning fortyndes til 10 ml, og fortyndingen centrifugeres ved 150.000 x g ved 4 °C i 2 timer.
- Brug en pipette til at kassere supernatanten og suspendere resten med 10 ml PBS. Affjedringen centrifugeres ved 150.000 x g ved 4 °C i 2 timer.
- Supernatanten kasseres, og resten suspenderes med 1 ml PBS.
BEMÆRK: Hvis antigenets opløselighed er meget lavere, kan den samme separationseffekt opnås ved størrelsesekskluderingskromatografi19.
5. Karakterisering
- Udfør dynamisk lysspredning (DLS).
- Prøverne fortyndes til en koncentration på 100 μg/ml, og der tilsættes 1 ml prøve i prøvecellen.
- Vælg "Størrelse" for "Måletype", "Protein" for "Prøvemateriale", "Vand" for "Dispergeringsmiddel", "25 °C" for "Temperatur", og indlæs derefter prøver og mål automatisk23.
- Tag billeder ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM).
- Prøverne fortyndes til 100 μg/ml. Tag et 200-mesh kobbergitter, tilsæt 20 μL prøve til det, og lad det blive absorberet i 10 minutter.
- Brug filterpapir til at transportere opløsningen af, tilsæt 20 μL 3% uranylacetat til støttefilmen og plet i 30 s.
- Væg uranylacetatet af, og tør filmen naturligt ved stuetemperatur i 1 time.
- Indlæs prøverne til TEM-systemet (se Materialefortegnelse), og tag billeder ved 80 kV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rutediagrammet for denne protokol er vist i figur 1. Denne protokol kan være en generel tilgang til at bruge OMV'er som en vaccineplatform; man behøver kun at vælge de passende ekspressionssystemer baseret på typen af antigener.
Figur 2 giver et gennemførligt plasmiddesignskema. SC-genet er forbundet med ClyA-genet via en fleksibel linker, mens ST forbinder til 5'-terminalen af RBD-genet med et His-tag-gen til oprensning og verifikation. Western blot viste, at reaktionen gradvist afsluttes med stigende OMV-SC (figur 3A). Efter ultracentrifugering forblev næsten alle de ureagerede RBD-ST i supernatanten. Den anden ultracentrifugering gav ikke en yderligere signifikant fordel i forhold til første gang (figur 3B).
Fordelingen af partikelstørrelse blev bestemt af DLS (figur 4). Den Z-gennemsnitlige hydrodynamiske diameter af OMV-SC var 133 nm, mens den var 152,6 nm for OMV-RBD (tabel 1). Disse forskelle kan skyldes, at RBD øger OMV-partikelstørrelsen efter intensiv visning. Resultaterne af TEM (figur 5) er i overensstemmelse med DLS-resultaterne. Billederne viste, at OMV'erne altid har en standard sfærisk struktur, uanset om de er forbundet med RBD eller ej. Dette indikerer, at ekstraktions-, reaktions- og rensningsbetingelserne er befordrende for at opretholde OMV'ernes biologiske aktivitet.
Figur 1: Rutediagram over forberedelse af OMV-RBD. ClyA-SC-plasmidet blev omdannet til E.coli, mens RBD-ST-plasmidet blev transficeret til HEK293F-celler. Efter en periode med dyrkning blev OMV-SC og RBD-ST isoleret og renset. Efter biokonjugation i konventionel buffer og ultracentrifugering blev OMV-RBD opnået. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: De plasmidprofiler, der er anvendt i denne undersøgelse . (A) pThioHisA ClyA-SC plasmid. B) PCDNA RBD-ST plasmid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Verifikation af OMV-RBD ved western blot. (A) Udforskningen af reaktionsforholdet mellem OMV-SC og RBD-ST med anti-6x HisTag. M: molekylvægtsmarkør 1: OMV-SC; 2: RBD-ST; 3: OMV:RBD = 10:1 (w/w); 4: OMV:RBD = 20:1; 5: OMV:RBD = 40:1. (B) Validering af effektiviteten af ultracentrifugering med anti-6x HisTag. M: molekylvægtsmarkør 1: OMV-SC; 2: OMV-RBD præ-ultracentrifugering; 3: RBD-ST; 4: supernatant efter første ultracentrifugering; 5: bundfald efter første ultracentrifugering; 6: supernatant efter anden ultracentrifugering; 7: bundfald efter anden ultracentrifugering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Partikelstørrelsesfordeling målt ved DLS . (A) OMV-SC. B) OMV-RBD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Visualisering af OMV'er efter TEM. (A) OMV-SC (200 μg/ml). (B) OMV-RBD (200 μg/ml). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Eksempel på navn | Temperatur (°C) | Z-Ave (d.nm) | Pdi |
| OMV-SC | 25 | 133 | 0.483 |
| OMV-RBD | 24.9 | 152.6 | 0.569 |
Tabel 1: Parametre målt ved DLS.
Supplerende fil 1: Plasmidsekvenser anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at skabe en "Plug-and-Display" nanopartikelvaccineplatform blev SC-fusioneret ClyA udtrykt i BL21 (DE3) stammer, som er en af de mest anvendte modeller til rekombinant proteinproduktion på grund af dens fordele i proteinekspression24, så der ville være nok SC-fragment, der vises på overfladen af OMV'erne under processen med bakterieproliferation. Samtidig blev der udarbejdet et ST-smeltet målantigen til den kemiske kobling mellem antigenerne og OMV'erne. Denne forsøgsordnings fordele og fremtidsudsigter afspejles hovedsagelig i tre aspekter. For det første realiseres "Plug-and-Display" -systemet med forskellige antigener og biologiske nanopartikler. Reaktions- og rensningsprocessen kan være hurtig og ligetil, hvilket har betydelige fordele ved udvikling af vacciner til nye infektionssygdomme og andre scenarier. For det andet opnår det målet om antigenvisning med høj densitet og giver en vaccinedesignmetode til nogle antigener med lav immunogenicitet. For det tredje er den individuelle ekspression af OMV'er og RBD (antigenprotein) gavnlig for at sikre høj antigenaktivitet, fordi konventionelle prokaryote ekspressionssystemer mangler funktioner såsom bestemte cofaktorer, molekylære chaperoner og posttranslationelle modifikationer, hvilket kan føre til proteintab og misfoldning.
I processen med plasmidkonstruktion blev ClyA valgt som et mål for at forbinde med SC hovedsageligt på grund af den løse tøndeformede struktur af C-terminalen af ClyA. Undersøgelser har vist, at hæmoglobinprotease (Hbp) autotransporter kan vise antigener fra Streptococcus lungebetændelse og Mycobacterium tuberculosis25,26. Ellers, hvis antigenet, der skal vises, er fra en prokaryote, er det muligt at konstruere antigenerne direkte ind i C-terminalen af ClyA uden at bruge SC / ST-konjugation. Denne metode kan resultere i OMV'er med højere visningstæthed, men der er stadig en risiko for, at de antigene proteiner ikke foldes korrekt. Det er vigtigt at bemærke, at en fleksibel linker skal designes og bruges, når SC/ST indsættes i målfragmentet, hvilket hjælper med at forbedre reaktionseffektiviteten mellem SC og ST. Den linkersekvens, der blev brugt her, var GSGGSGGSGTG, og andre fleksible linkere kan også vælges.
Ud over SC/ST-systemet til klikkemikonjugation anvendes Snooptag/Snoopcatcher og Sortase A-konjugation også almindeligvis til kovalent konjugation mellem proteinerne27,28. Samtidig er det også blevet rapporteret, at indførelsen af flere forskellige koblingssystemer på den samme vektor29 eller brugen af det samme koblingssystem til flere antigener19 kan opnå det formål at vise flere heterologe antigener på den samme vektor, og derefter kan polyvalente eller multifunktionelle vacciner fremstilles.
Høj cytotoksicitet og lavt udbytte begrænser den udbredte anvendelse af OMV'er som vaccineplatforme 4,30. Nogle LPS-relaterede gener er blevet slået ud i den stamme, der anvendes i denne protokol, ifølge relevant litteratur31,32,33, for at reducere cytotoksiciteten af OMV'er. 1,18 mg OMV'er kan ekstraheres fra hver 1 liter bakterieopløsning ved den metode, der er indført i denne protokol. Udbyttet er stadig lavere end for nogle genetisk modificerede højvesikelproducerende stammer34. Om nødvendigt kan højtrykshomogenisering også fremme spiring af bakteriemembranen for at producere flere OMV'er, som kan opnå forbedret udbytte og vise densitet på samme tid35.
Induktionsbetingelserne er afgørende for tætheden af SC, der vises på overfladen af OMV'erne. Vi overvågede ekspressionen af målproteinet gennem SDS-PAGE og screenede derefter induktionstilstanden, som er relativt mild og udtrykker mere protein. Forskellige proteiner kan kræve forskellige induktionsbetingelser, og ændringer i induktionsbetingelserne kan føre til forskelle i tætheden af SC, der vises på overfladen af OMV'erne. Justering af antigen- og bærerforholdet, efter at de eksperimentelle betingelser er ændret for at undersøge det mest passende reaktionsforhold, foreslås. Derudover kan rensningen af OMV-RBD opnås ved SEM eller ultracentrifugering. Begge metoder blev afprøvet; ultracentrifugering er mere praktisk, og den resulterende OMV havde en renhed svarende til SEM-protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Key Program of Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) og Chinese National Natural Science Foundation Project (nr. 31670936, 82041045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
References
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
- Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
- Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
- Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
- Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
- Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
- Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
- Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
- Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
- Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
- Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
- Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
- Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
- Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
- Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
- Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
- Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
- Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
- Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
- Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
- van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
- Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
- Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
- Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
- Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
- Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
- Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).
