Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt das Bioengineering von äußeren Membranvesikeln als "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.
Abstract
Biomimetische Nanopartikel, die aus Bakterien oder Viren gewonnen werden, haben großes Interesse an der Impfstoffforschung und -entwicklung geweckt. Äußere Membranvesikel (OMVs) werden hauptsächlich von gramnegativen Bakterien während des durchschnittlichen Wachstums mit einem Durchmesser in Nanogröße und selbstadjuvanter Aktivität sezerniert, was ideal für die Impfstoffabgabe sein kann. OMVs haben als facettenreiches Liefersystem für Proteine, Nukleinsäuren und kleine Moleküle funktioniert. Um die biologischen Eigenschaften von OMVs voll auszuschöpfen, wurden biotechnologisch hergestellte Escherichia coli-abgeleitete OMVs als Träger und SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne (RBD) als Antigen verwendet, um eine "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform zu konstruieren. Die Domänen SpyCatcher (SC) und SpyTag (ST) in Streptococcus pyogenes wurden angewendet, um OMVs und RBD zu konjugieren. Das Cytolysin A (ClyA)-Gen wurde nach Plasmidtransfektion mit dem SC-Gen als Fusionsprotein übersetzt, wobei eine reaktive Stelle auf der Oberfläche der OMVs zurückblieb. Nach dem Mischen von RBD-ST in einem konventionellen Puffersystem über Nacht wurde eine kovalente Bindung zwischen den OMVs und RBD gebildet. Somit wurde ein multivalent anzeigender OMV Impfstoff erreicht. Durch den Ersatz durch verschiedene Antigene kann die OMVs Impfstoffplattform eine Vielzahl heterogener Antigene effizient darstellen und so Epidemien von Infektionskrankheiten schnell verhindern. Dieses Protokoll beschreibt eine präzise Methode zum Aufbau der OMV Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.
Introduction
Als potenzielle Impfstoffplattform haben äußere Membranvesikel (OMVs) in den letzten Jahren immer mehr Aufmerksamkeit erregt 1,2. OMVs, die hauptsächlich auf natürliche Weise von gramnegativen Bakterien3 sezerniert werden, sind kugelförmige nanoskalige Partikel, die aus einer Lipiddoppelschicht bestehen, normalerweise in der Größe von 20-300nm4. OMVs enthalten verschiedene bakterielle Ausgangskomponenten, einschließlich bakterieller Antigene und pathogenassoziierter molekularer Muster (PAMPs), die als feste Immunpotentiatoren dienen5. OMVs profitieren von ihren einzigartigen Komponenten, ihrer natürlichen Vesikelstruktur und ihren großartigen gentechnischen Modifikationsstellen und wurden für den Einsatz in vielen biomedizinischen Bereichen entwickelt, darunter bakterielle Impfstoffe6, Adjuvantien7, Krebsimmuntherapeutika8, Wirkstoffabgabevektoren9 und antibakterielle Klebstoffe10.
Die SARS-CoV-2-Pandemie, die sich seit 2020 weltweit ausbreitet, hat die globale Gesellschaft stark belastet. Die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) im Spike-Protein (S-Protein) kann an das humane Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) binden, das dann den Eintritt des Virus in die Zellevermittelt 11,12,13. Daher scheint RBD ein Hauptziel für die Impfstoffentdeckungzu sein 14,15,16. Monomere RBD ist jedoch schlecht immunogen, und ihr kleines Molekulargewicht erschwert es dem Immunsystem, sie zu erkennen, so dass häufig Adjuvantien erforderlich sind17.
Um die Immunogenität von RBD zu erhöhen, wurden OMVs mit polyvalenten RBDs konstruiert. Bestehende Studien, die OMV zur Darstellung von RBD verwenden, verschmelzen in der Regel RBD mit OMV, um in Bakterien exprimiert zu werden18. RBD ist jedoch ein vom Virus abgeleitetes Protein, und die prokaryotische Expression beeinflusst wahrscheinlich seine Aktivität. Um dieses Problem zu lösen, wurde das von Streptococcus pyogenes abgeleitete SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC)-System verwendet, um ein kovalentes Isopeptid mit OMV und RBD in einem konventionellen Puffersystem19 zu bilden. Die SC-Domäne wurde mit Cytolysin A (ClyA) als Fusionsprotein durch biotechnologisch hergestellte Escherichia coli exprimiert, und ST wurde mit RBD über das HEK293F-Zellexpressionssystem exprimiert. OMV-SC und RBD-ST wurden über Nacht gemischt und inkubiert. Nach Reinigung durch Ultrazentrifugation oder Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde OMV-RBD erhalten.
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Protocol
1. Plasmidaufbau
- Fügen Sie DNA, die die SpyCatcher-Sequenz (Supplementary File 1) kodiert, in ein Ampicillin-resistentes pThioHisA-ClyA-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Stellen BamH I und Sal I ein, um das Plasmid pThioHisA ClyA-SC nach einem zuvor veröffentlichten Bericht zu konstruieren20.
- Ligate das synthetisierte SpyTag-RBD-Histag-Fusionsgen (Supplementary File 1) in ein pcDNA3.1-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Standorten BamH I und EcoR I, um das Plasmid pcDNA3.1 RBD-ST nach einem zuvor veröffentlichten Bericht zu konstruieren19.
2. OMV-SC Vorbereitung
- Führen Sie die ClyA-SC-Transformation mit den folgenden Schritten durch.
- 5 μL pThioHisA ClyA-SC Plasmidlösung (50 ng/μL) zu 50 μL BL21 kompetentem Stamm geben, vorsichtig blasen und 30 min auf Eis abkühlen lassen.
- Die Lösung für 90 s in das Wasserbad bei 42 °C geben und dann sofort die gemischte Lösung für 3 min auf Eis legen.
- 500 μL LB-Medium in die Bakteriensuspension geben und nach dem Mischen bei 220 U/min bei 37 °C für 1 h kultivieren.
- Die gesamte Umwandlung wird auf eine LB-Agarplatte mit Ampicillin (100 μg/ml, siehe Materialtabelle) und Kultur über Nacht bei 37 °C gelegt.
HINWEIS: In nachfolgenden Experimenten wurde das Ampicillin in der gleichen Konzentration im Medium gehalten. Wenn nicht, kann dies zum Verlust von Plasmiden in den Bakterien führen.
- Führen Sie für die OMV-SC-Produktion die folgenden Schritte aus.
- Eine einzelne Kolonie wird von der Platte isoliert (Schritt 2.1.4.) auf 20 ml LB (ampicillinresistentes) Medium und Kultur über Nacht bei 220 U/min bei 37 °C.
- Die Bakterienlösung (ab Schritt 2.2.1.) wird in 2 L Medium geimpft, bei 220 U/min, 37 °C für 5 h bis zum logarithmischen Wachstumsstadium kultiviert (der OD600nm liegt zwischen 0,6 und 0,8).
- Wenn der OD bei 600 nm der Bakterienlösung 0,6-0,8 erreicht, wird Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG, siehe Materialtabelle) hinzugefügt, um die Endkonzentration der Bakterienlösung auf 0,5 mM zu bringen, und dann über Nacht bei 220 U/min bei 25 °C kultiviert.
- Führen Sie eine OMV-SC-Reinigung durch.
- Zentrifugieren Sie die Bakterienlösung bei 7.000 x g bei 4 °C für 30 min.
- Filtern Sie den Überstand mit einem 0,22 μm Membranfilter und konzentrieren Sie ihn dann mit einer 100 kD Ultrafiltrationsmembran oder Hohlfasersäule (siehe Materialtabelle).
- Filtern Sie das Konzentrat durch einen 0,22-μm-Membranfilter, zentrifugieren Sie es dann bei 150.000 x g bei 4 °C für 2 h mit einer Ultrazentrifuge (siehe Materialtabelle) und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Resuspendieren Sie den Niederschlag mit PBS und lagern Sie ihn bei −80 °C. Die Lösung kann bei −80 °C langzeitstabil bleiben.
3. RBD-ST Vorbereitung
- Führen Sie die RBD-ST-Transfektion durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Wählen Sie ein geeignetes eukaryotisches Expressionssystem (z. B. HEK293F) und kultivieren Sie die Zellen nach der Genesung über Nacht bei 130 U/min bei 37 °C.
- 20 μL HEK293F-Zelllösung in den automatisierten Zellzähler geben (siehe Materialtabelle), die Anzahl der Zellen aufzeichnen, die Konzentration auf 1 x 106 Zellen/ml einstellen und dann die Zellen bei 130 U/min bei 37 °C für 4 h kultivieren.
- RBD-ST-Plasmid durch einen 0,22 μm Membranfilter filtern und 300 μg Plasmide in das Zellkulturmedium geben (siehe Materialtabelle), bis das Endvolumen 10 ml beträgt; 10 s schütteln.
- PEI (1 mg/ml, siehe Materialtabelle) im Wasserbad auf 65 °C erhitzen, 0,7 mL PEI mit 9,3 ml Zellkulturmedium mischen und 10 s intermittierend schütteln.
HINWEIS: Schütteln Sie die Lösung nicht kräftig. Andernfalls können die entstehenden Blasen die Transfektionseffizienz beeinträchtigen. - Plasmidlösung in die PEI-Lösung geben, die Mischung intermittierend 10 s schütteln und 15 min bei 37 °C inkubieren.
- Die Mischung in 280 ml Zellkulturmedium geben und 5 Tage lang bei 130 U/min bei 37 °C kultivieren.
- Führen Sie eine RBD-ST-Reinigung durch.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.000 x g bei 25 °C für 20 min und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand aufzufangen.
- Füllen Sie die Säule mit 2 ml Ni-NTA-Agarose (siehe Materialtabelle) und waschen Sie sie 3x mit 3x PBS.
- Fügen Sie Imidazol (siehe Materialtabelle) in den Zellüberstand hinzu, um die Endkonzentration von 20 mM zu erreichen, und laden Sie den Zellüberstand 2x.
- Fügen Sie 3 Säulenvolumina (CV) PBS hinzu, die 20 mM Imidazol zum Waschen enthalten, und sammeln Sie die Waschfraktion.
- Gradientenelue mit 3 CV PBS mit niedrigen bis hohen Konzentrationen (z. B. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) Imidazol; Elue 2x für jede Konzentration.
- Verwenden Sie SDS-PAGE21 , um den RBD-ST in verschiedenen Konzentrationsgradienten zu identifizieren.
4. OMV-RBD Biokonjugation und Reinigung
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der BCA-Methode (siehe Materialtabelle).
- Die BSA-Standardproteinlösung wird in Serie von 2 mg/ml auf 0,0625 mg/ml verdünnt, die gereinigten OMV-SC und RBD-ST 10x verdünnt, und dann BCA-Arbeitslösungen A und B (im Assay-Kit enthalten) im Verhältnis 50:1 (v/v) gemischt.
- Verdünnte Proteinlösung (25 μL/Well) hinzufügen und mit BCA-Arbeitslösung mischen (200 μL/Well); Bei 37 °C 30 min inkubieren.
- Messen Sie die Absorption (OD) bei 562 nm jeder Vertiefung und berechnen Sie die Proteinkonzentration aus der Standardkurve22.
- Führen Sie eine Biokonjugation von OMV-SC und RBD-ST durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Mischen Sie OMV-SC und RBD-ST in PBS im Verhältnis 40:1 (w/w).
- Vertikal drehen, um die Mischung über Nacht bei 15 U/min bei 4 °C zu mischen.
HINWEIS: Verschiedene Antigene können in unterschiedlichen Anteilen reagieren. Man könnte verschiedene Reaktionsverhältnisse basierend auf den Eigenschaften des Antigens ausprobieren.
- Überprüfen Sie die Reaktionseffizienz.
- Bereiten Sie 10 μL OMV-SC, RBD-ST und das Reaktionsprodukt vor (Schritt 4.2.). Fügen Sie 2,5 μL 5x Ladepuffer hinzu (siehe Materialtabelle) und erhitzen Sie die Proben bei 100 °C für 5 min. Laden Sie die Proben in das Gel (10 μL/Well). Führen Sie die Elektrophorese bei 60 V für 20 min durch und ändern Sie den Zustand für 1 h auf 120 V.
- Übertragen Sie das Protein aus dem Gel auf PVDF-Western-Blotting-Membranen (siehe Materialtabelle) bei 100 V für 70 min.
- Die Membran in 5% fettfreies Milchpulver/TBST geben und 1 h schütteln. Dann 3x mit TBST für 5 min pro Waschgang mit Schütteln waschen.
- Legen Sie die Membran in 0,1% His-Tag-Antikörper/TBST (siehe Materialtabelle) und schütteln Sie sie für 1 h, dann waschen Sie 3x mit TBST für 5 min pro Waschgang mit Schütteln.
- Legen Sie die Membran in 0,02% Anti-Maus-IgG1-Antikörper (HRP)/TBST (siehe Materialtabelle) und schütteln Sie sie für 40 min, dann waschen Sie 3x mit TBST für 5 min pro Waschgang mit Schütteln.
- Fügen Sie eine verbesserte Chemilumineszenzlösung hinzu (siehe Materialtabelle) und legen Sie die Membran frei.
- Führen Sie eine Reinigung von OMV-RBD durch.
- 1 ml der umgesetzten OMV-RBD-Lösung auf 10 ml verdünnen und die Verdünnung bei 150.000 x g bei 4 °C für 2 h zentrifugieren.
- Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu verwerfen und den Rückstand mit 10 ml PBS aufzuheben. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 150.000 x g bei 4 °C für 2 h.
- Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie den Rückstand mit 1 ml PBS.
ANMERKUNG: Wenn die Löslichkeit des Antigens viel geringer ist, kann der gleiche Trenneffekt durch Größenausschlusschromatographie19 erreicht werden.
5. Charakterisierung
- Führen Sie dynamische Lichtstreuung (DLS) durch.
- Die Proben werden auf eine Konzentration von 100 μg/ml verdünnt und 1 ml Probe in die Probenzelle gegeben.
- Wählen Sie "Größe" für "Messtyp", "Protein" für "Probenmaterial", "Wasser" für "Dispergiermittel", "25 °C" für "Temperatur", laden Sie dann Proben und messen Sie automatisch23.
- Nehmen Sie Bilder mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) auf.
- Die Proben werden auf 100 μg/ml verdünnt. Nehmen Sie ein Kupfergitter mit 200 Mesh, fügen Sie 20 μL Probe hinzu und lassen Sie es 10 Minuten lang absorbieren.
- Verwenden Sie Filterpapier, um die Lösung abzuleiten, fügen Sie 20 μL 3% Uranylacetat zum Trägerfilm hinzu und färben Sie für 30 s.
- Das Uranylacetat ableiten und die Folie auf natürliche Weise bei Raumtemperatur 1 h trocknen.
- Laden Sie die Proben in das TEM-System (siehe Materialtabelle) und erfassen Sie Bilder bei 80 kV.
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Representative Results
Das Flussdiagramm für dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll könnte ein allgemeiner Ansatz zur Nutzung von OMVs als Impfstoffplattform sein. Man muss nur die geeigneten Expressionssysteme basierend auf der Art der Antigene auswählen.
Abbildung 2 zeigt ein realisierbares Plasmid-Design-Schema. Das SC-Gen ist über einen flexiblen Linker mit dem ClyA-Gen verbunden, während ST mit dem 5'-Terminal des RBD-Gens mit einem His-Tag-Gen zur Reinigung und Verifizierung verbunden ist. Western Blot zeigte, dass die Reaktion allmählich mit zunehmender OMV-SC abgeschlossen wird (Abbildung 3A). Nach der Ultrazentrifugation verblieb fast das gesamte nicht umgesetzte RBD-ST im Überstand. Die zweite Ultrazentrifugation brachte keinen weiteren signifikanten Vorteil gegenüber dem ersten Mal (Abbildung 3B).
Die Verteilung der Partikelgröße wurde mittels DLS bestimmt (Abbildung 4). Der durchschnittliche hydrodynamische Z-Durchmesser von OMV-SC betrug 133 nm, während er für OMV-RBD 152,6 nm betrug (Tabelle 1). Diese Unterschiede können darauf zurückzuführen sein, dass RBD die OMV-Partikelgröße nach intensiver Anzeige erhöht. Die Ergebnisse von TEM (Abbildung 5) stimmen mit den DLS-Ergebnissen überein. Die Bilder zeigten, dass die OMVs immer eine standardmäßige sphärische Struktur haben, unabhängig davon, ob sie mit RBD verbunden sind oder nicht. Dies deutet darauf hin, dass die Extraktions-, Reaktions- und Reinigungsbedingungen der Aufrechterhaltung der biologischen Aktivität von OMVs förderlich sind.
Abbildung 1: Flussdiagramm der OMV-RBD-Vorbereitung. Das ClyA-SC-Plasmid wurde in E.coli umgewandelt, während das RBD-ST-Plasmid in HEK293F-Zellen transfiziert wurde. Nach einer Kultivierungsphase wurden OMV-SC und RBD-ST isoliert und gereinigt. Nach Biokonjugation in konventioneller Puffer- und Ultrazentrifugation wurde OMV-RBD erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die in dieser Studie verwendeten Plasmidprofile . (A) pThioHisA ClyA-SC-Plasmid. (B) pcDNA RBD-ST Plasmid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Nachweis von OMV-RBD durch Western Blot. (A) Die Untersuchung des Reaktionsverhältnisses zwischen OMV-SC und RBD-ST mit anti-6x HisTag. M: Molekulargewichtsmarker 1: OMV-SC; 2: RBD-ST; 3: OMV:RBD = 10:1 (w/w); 4: OMV:RBD = 20:1; 5: OMV:RBD = 40:1. (B) Validierung der Effizienz der Ultrazentrifugation mit Anti-6x HisTag. M: Molekulargewichtsmarker 1: OMV-SC; 2: OMV-RBD Prä-Ultrazentrifugation; 3: RBD-ST; 4: Überstand nach der ersten Ultrazentrifugation; 5: Niederschlag nach der ersten Ultrazentrifugation; 6: überstehende Ultrazentrifugation nach der Sekunde; 7: Niederschlag nach der zweiten Ultrazentrifugation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Partikelgrößenverteilung gemessen mit DLS . (A) OMV-SC. b) OMV-RBD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Visualisierung von OMVs nach TEM. (A) OMV-SC (200 μg/ml). (B) OMV-RBD (200 μg/ml). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Name des Beispiels | Temperatur (°C) | Z-Ave (d.nm) | Pdi |
| OMV-SC | 25 | 133 | 0.483 |
| OMV-RBD | 24.9 | 152.6 | 0.569 |
Tabelle 1: Mit DLS gemessene Parameter.
Ergänzende Datei 1: In der vorliegenden Studie verwendete Plasmidsequenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Um eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform zu schaffen, wurde SC-fusioniertes ClyA in BL21(DE3)-Stämmen exprimiert, die aufgrund ihrer Vorteile bei der Proteinexpression24 eines der am weitesten verbreiteten Modelle für die rekombinante Proteinproduktion sind, so dass während des Prozesses der Bakterienproliferation genügend SC-Fragmente auf der Oberfläche der OMVs angezeigt werden. Gleichzeitig wurde ein ST-fusioniertes Zielantigen für die chemische Kopplung zwischen den Antigenen und OMVs hergestellt. Die Vorteile und zukünftigen Anwendungsaussichten dieses experimentellen Schemas spiegeln sich hauptsächlich in drei Aspekten wider. Zunächst wird das "Plug-and-Display"-System aus verschiedenen Antigenen und biologischen Nanopartikeln realisiert. Der Reaktions- und Reinigungsprozess könnte schnell und unkompliziert sein, was erhebliche Vorteile bei der Entwicklung von Impfstoffen für neu auftretende Infektionskrankheiten und andere Szenarien hat. Zweitens erreicht es das Ziel der Anzeige von Antigenen hoher Dichte und bietet eine Impfstoffdesignmethode für einige Antigene mit geringer Immunogenität. Drittens ist die individuelle Expression von OMVs und RBD (Antigenprotein) vorteilhaft, um eine hohe Antigenaktivität zu gewährleisten, da konventionellen prokaryotischen Expressionssystemen Funktionen wie bestimmte Cofaktoren, molekulare Chaperone und posttranslationale Modifikationen fehlen, was zu Proteinverlust und Fehlfaltung führen kann.
Im Prozess der Plasmidkonstruktion wurde der ClyA als Ziel für die Verbindung mit SC ausgewählt, hauptsächlich aufgrund der lockeren tonnenförmigen Struktur des C-Terminals von ClyA. Studien haben gezeigt, dass der Hämoglobinprotease (Hbp) Autotransporter Antigene von Streptococcus pneumonia und Mycobacterium tuberculosis25,26 aufweisen kann. Andernfalls, wenn das anzuzeigende Antigen von einem Prokaryoten stammt, ist es möglich, die Antigene direkt in das C-Terminal von ClyA zu konstruieren, ohne SC/ST-Konjugation zu verwenden. Diese Methode kann zu OMVs mit höherer Anzeigedichte führen, aber es besteht immer noch das Risiko, dass sich die antigenen Proteine nicht richtig falten. Es ist wichtig zu beachten, dass ein flexibler Linker entworfen und verwendet werden muss, wenn SC / ST in das Zielfragment eingefügt wird, was dazu beiträgt, die Reaktionseffizienz zwischen SC und ST zu verbessern. Die hier verwendete Linker-Sequenz war GSGGSGGSGTG, und es können auch andere flexible Linker ausgewählt werden.
Neben dem SC/ST-System zur Klickchemie-Konjugation werden häufig auch Snooptag/Snoopcatcher- und Sortase-A-Konjugation für kovalente Konjugation zwischen Proteinenverwendet 27,28. Gleichzeitig wurde auch berichtet, dass die Einführung mehrerer verschiedener Verknüpfungssysteme auf demselben Vektor29 oder die Verwendung desselben Verknüpfungssystems für mehrere Antigene19 den Zweck erreichen kann, mehrere heterologe Antigene auf demselben Vektor anzuzeigen, und dann können polyvalente oder multifunktionale Impfstoffe hergestellt werden.
Hohe Zytotoxizität und geringe Ausbeute begrenzen die weit verbreitete Verwendung von OMVs als Impfstoffplattformen 4,30. Einige LPS-bezogene Gene wurden in dem in diesem Protokoll verwendeten Stamm gemäß einschlägiger Literatur31,32,33 ausgeschaltet, um die Zytotoxizität von OMVs zu reduzieren. 1,18 mg OMV können aus jedem 1 l der Bakterienlösung nach dem in diesem Protokoll eingeführten Verfahren extrahiert werden. Die Ausbeute ist immer noch niedriger als die einiger genetisch veränderter Stämme mit hoher Vesikelproduktion34. Bei Bedarf kann die Hochdruckhomogenisierung auch die Keimung der Bakterienmembran fördern, um mehr OMVs zu produzieren, wodurch eine verbesserte Ausbeute und gleichzeitig eine höhere Dichte erreicht werden kann35.
Die Induktionsbedingungen sind entscheidend für die Dichte von SC, die auf der Oberfläche der OMVs angezeigt wird. Wir überwachten die Expression des Zielproteins durch SDS-PAGE und siebten dann den Induktionszustand aus, der relativ mild ist und mehr Protein exprimiert. Verschiedene Proteine können unterschiedliche Induktionsbedingungen erfordern, und Änderungen der Induktionsbedingungen können zu Unterschieden in der Dichte von SC führen, die auf der Oberfläche der OMVs angezeigt wird. Es wird vorgeschlagen, das Antigen- und Trägerverhältnis nach Änderung der experimentellen Bedingungen anzupassen, um das am besten geeignete Reaktionsverhältnis zu untersuchen. Darüber hinaus kann die Reinigung von OMV-RBD durch REM oder Ultrazentrifugation erreicht werden. Beide Methoden wurden ausprobiert; Die Ultrazentrifugation ist bequemer, und die resultierende OMV hatte eine Reinheit, die dem SEM-Protokoll ähnelt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Key Program der Chongqing Natural Science Foundation (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) und das Chinese National Natural Science Foundation Project (Nr. 31670936, 82041045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
References
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
- Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
- Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
- Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
- Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
- Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
- Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
- Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
- Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
- Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
- Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
- Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
- Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
- Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
- Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
- Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
- Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
- Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
- Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
- Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
- van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
- Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
- Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
- Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
- Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
- Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
- Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).
