Summary
Il presente protocollo descrive la bioingegneria delle vescicole della membrana esterna come una piattaforma vaccinale "Plug-and-Display", compresa la produzione, la purificazione, la bioconiugazione e la caratterizzazione.
Abstract
Le nanoparticelle biomimetiche ottenute da batteri o virus hanno suscitato un notevole interesse nella ricerca e nello sviluppo di vaccini. Le vescicole della membrana esterna (OMV) sono secrete principalmente da batteri gram-negativi durante la crescita media, con un diametro di dimensioni nanometriche e un'attività autoadiuvante, che può essere ideale per la somministrazione del vaccino. Gli OMV hanno funzionato come un sistema di consegna multiforme per proteine, acidi nucleici e piccole molecole. Per sfruttare appieno le caratteristiche biologiche degli OMV, gli OMV bioingegnerizzati derivati da Escherichia coli sono stati utilizzati come carrier e il dominio legante il recettore SARS-CoV-2 (RBD) come antigene per costruire una piattaforma vaccinale "Plug-and-Display". I domini SpyCatcher (SC) e SpyTag (ST) in Streptococcus pyogenes sono stati applicati per coniugare OMV e RBD. Il gene della citolisina A (ClyA) è stato tradotto con il gene SC come proteina di fusione dopo trasfezione plasmidica, lasciando un sito reattivo sulla superficie delle OMV. Dopo aver miscelato RBD-ST in un sistema tampone convenzionale durante la notte, è stato formato un legame covalente tra OMV e RBD. Pertanto, è stato raggiunto un vaccino OMV polivalente. Sostituendo con antigeni diversi, la piattaforma vaccinale OMV può visualizzare in modo efficiente una varietà di antigeni eterogenei, prevenendo così potenzialmente rapidamente le epidemie di malattie infettive. Questo protocollo descrive un metodo preciso per costruire la piattaforma vaccinale OMV, compresa la produzione, la purificazione, la bioconiugazione e la caratterizzazione.
Introduction
Come potenziale piattaforma vaccinale, le vescicole della membrana esterna (OMV) hanno attirato sempre più attenzione negli ultimi anni 1,2. Gli OMV, principalmente secreti naturalmente dai batteri gram-negativi3, sono particelle sferiche su scala nanometrica composte da un doppio strato lipidico, di solito delle dimensioni di 20-300 nm4. Gli OMV contengono vari componenti batterici parentali, compresi gli antigeni batterici e i pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP), che fungono da potenziatori immunitari solidi5. Beneficiando dei loro componenti unici, della struttura naturale delle vescicole e dei grandi siti di modifica dell'ingegneria genetica, gli OMV sono stati sviluppati per l'uso in molti campi biomedici, tra cui vaccini batterici6, adiuvanti7, farmaci immunoterapici contro il cancro8, vettori di somministrazione di farmaci9 e adesivi antibatterici10.
La pandemia di SARS-CoV-2, che si è diffusa in tutto il mondo dal 2020, ha avuto un pesante tributo sulla società globale. Il dominio legante il recettore (RBD) nella proteina spike (proteina S) può legarsi con l'enzima umano di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2), che quindi media l'ingresso del virus nella cellula11,12,13. Pertanto, RBD sembra essere un obiettivo primario per la scoperta del vaccino14,15,16. Tuttavia, la RBD monomerica è scarsamente immunogenica e il suo piccolo peso molecolare rende difficile il riconoscimento per il sistema immunitario, quindi sono spesso necessari adiuvanti17.
Al fine di aumentare l'immunogenicità dei RBD, sono stati costruiti OMV che mostrano RBD polivalenti. Gli studi esistenti che utilizzano OMV per visualizzare RBD di solito fondono RBD con OMV per essere espresso nei batteri18. Tuttavia, RBD è una proteina derivata dal virus e l'espressione procariotica può influenzare la sua attività. Per risolvere questo problema, il sistema SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), derivato da Streptococcus pyogenes, è stato utilizzato per formare un isopeptide covalente con OMV e RBD in un sistema tampone convenzionale19. Il dominio SC è stato espresso con la citolisina A (ClyA) come proteina di fusione mediante Escherichia coli bioingegnerizzato e ST è stato espresso con RBD tramite il sistema di espressione cellulare HEK293F. OMV-SC e RBD-ST sono stati miscelati e incubati durante la notte. Dopo la purificazione mediante ultracentrifugazione o cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), OMV-RBD è stato ottenuto.
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Protocol
1. Costruzione plasmidica
- Inserire la sequenza di SpyCatcher codificante DNA (file supplementare 1) in un plasmide pThioHisA-ClyA resistente all'ampicillina (vedi Tabella dei materiali) tra i siti BamH I e Sal I per costruire il plasmide pThioHisA ClyA-SC seguendo un rapporto precedentemente pubblicato20.
- Collegare il gene di fusione sintetizzato SpyTag-RBD-Histag (File supplementare 1) in un plasmide pcDNA3.1 (vedere Tabella dei materiali) tra i siti BamH I ed EcoR I per costruire il plasmide pcDNA3.1 RBD-ST a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato19.
2. Preparazione OMV-SC
- Eseguire la trasformazione ClyA-SC seguendo i passaggi seguenti.
- Aggiungere 5 μL di soluzione plasmidica pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) a 50 μL di ceppo competente BL21, soffiare delicatamente e lasciare raffreddare sul ghiaccio per 30 minuti.
- Mettere la soluzione per 90 s a bagnomaria a 42 °C, quindi mettere immediatamente la soluzione miscelata su ghiaccio per 3 minuti.
- Aggiungere 500 μL di terreno LB alla sospensione batterica e, dopo miscelazione, coltura a 220 giri/min a 37 °C per 1 ora.
- Placcare tutta la trasformazione su una piastra di agar LB contenente ampicillina (100 μg/ml, vedi tabella dei materiali) e coltura per una notte a 37 °C.
NOTA: Negli esperimenti successivi, l'ampicillina è stata mantenuta alla stessa concentrazione nel mezzo. In caso contrario, ciò può causare la perdita di plasmidi nei batteri.
- Per la produzione OMV-SC, eseguire i passaggi seguenti.
- Isolare una singola colonia dalla piastra (fase 2.1.4.) a 20 mL di terreno LB (resistente all'ampicillina) e coltivare per una notte a 220 giri/min a 37 °C.
- Inoculare la soluzione batterica (dal punto 2.2.1.) in terreno da 2 L, coltura a 220 giri/min, 37 °C per 5 ore fino allo stadio di crescita logaritmica (OD600nm è compreso tra 0,6 e 0,8).
- Quando l'OD a 600 nm della soluzione batterica raggiunge 0,6-0,8, aggiungere isopropil beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG, vedi tabella dei materiali) per ottenere la concentrazione finale della soluzione batterica di 0,5 mM, quindi coltura per una notte a 220 giri / min a 25 ° C.
- Eseguire la purificazione OMV-SC.
- Centrifugare la soluzione batterica a 7.000 x g a 4 °C per 30 minuti.
- Filtrare il surnatante con un filtro a membrana da 0,22 μm, quindi concentrarlo utilizzando una membrana di ultrafiltrazione da 100 kD o una colonna di fibra cava (vedi Tabella dei materiali).
- Filtrare il concentrato attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm, quindi centrifugarlo a 150.000 x g a 4 °C per 2 ore utilizzando un'ultracentrifuga (vedere Tabella dei materiali) ed eliminare il surnatante con una pipetta.
- Risospendere la precipitazione con PBS e conservarla a -80 °C. La soluzione può mantenere la stabilità a lungo termine a -80 °C.
3. Preparazione RBD-ST
- Eseguire la trasfezione RBD-ST seguendo i passaggi seguenti.
- Selezionare un sistema di espressione eucariotica appropriato (ad esempio, HEK293F) e coltivare le cellule durante la notte a 130 rpm a 37 °C dopo il recupero.
- Aggiungere 20 μL di soluzione cellulare HEK293F nel contatore automatico delle celle (vedere Tabella dei materiali), registrare il numero di celle, regolare la concentrazione a 1 x 106 celle/ml e quindi coltivare le celle a 130 giri/min a 37 °C per 4 ore.
- Filtrare il plasmide RBD-ST attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm e aggiungere 300 μg di plasmidi nel terreno di coltura cellulare (vedere Tabella dei materiali) fino a quando il volume finale è di 10 ml; agitare per 10 s.
- Riscaldare il PEI (1 mg/ml; vedere tabella dei materiali) a 65 °C a bagnomaria, mescolare 0,7 mL di PEI con 9,3 mL di terreno di coltura cellulare e agitare a intermittenza per 10 s.
NOTA: Non agitare vigorosamente la soluzione. In caso contrario, le bolle risultanti possono influire sull'efficienza della trasfezione. - Aggiungere la soluzione di plasmide alla soluzione PEI, agitare la miscela in modo intermittente per 10 s e incubarla a 37 °C per 15 minuti.
- Aggiungere la miscela a 280 ml di terreno di coltura cellulare e coltivare a 130 giri/min a 37 °C per 5 giorni.
- Eseguire la purificazione RBD-ST.
- Centrifugare le celle a 6.000 x g a 25 °C per 20 minuti e utilizzare una pipetta per raccogliere il surnatante.
- Riempire la colonna con 2 mL di agarosio Ni-NTA (vedi Tabella dei materiali) e lavarla 3 volte con 3x PBS.
- Aggiungere imidazolo (vedere Tabella dei materiali) nel surnatante cellulare per ottenere la concentrazione finale di 20 mM e caricare il surnatante cellulare 2x.
- Aggiungere 3 volumi di colonna (CV) di PBS contenenti 20 mM di imidazolo per il lavaggio e raccogliere la frazione di lavaggio.
- Eluizione a gradiente con 3 CV di PBS contenenti concentrazioni da basse ad alte (ad esempio, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) di imidazolo; eluire 2x per ogni concentrazione.
- Utilizzare SDS-PAGE21 per identificare RBD-ST in diversi gradienti di concentrazione.
4. Bioconiugazione e purificazione OMV-RBD
- Determinare la concentrazione proteica con il metodo BCA (vedi Tabella dei materiali).
- Diluire serialmente la soluzione proteica standard di BSA da 2 mg/ml a 0,0625 mg/ml, diluire OMV-SC e RBD-ST 10x purificati, quindi miscelare le soluzioni di lavoro BCA A e B (fornite nel kit di analisi) con un rapporto di 50:1 (v/v).
- Aggiungere una soluzione proteica diluita (25 μL/pozzetto) e mescolare con una soluzione di lavoro BCA (200 μL/pozzetto); incubare a 37 °C per 30 min.
- Misurare l'assorbanza (OD) a 562 nm di ciascun pozzetto e calcolare la concentrazione proteica dalla curva standard22.
- Eseguire la bioconiugazione di OMV-SC e RBD-ST seguendo i passaggi seguenti.
- Combinare OMV-SC e RBD-ST in PBS con un rapporto di 40:1 (w/w).
- Ruotare verticalmente per frullare la miscela durante la notte a 15 giri/min a 4 °C.
NOTA: Antigeni diversi possono reagire in proporzioni diverse. Si potrebbero provare diversi rapporti di reazione in base alle caratteristiche dell'antigene.
- Verificare l'efficienza di reazione.
- Preparare 10 μL di OMV-SC, RBD-ST e il prodotto di reazione (punto 4.2.). Aggiungere 2,5 μL di tampone di carico 5x (vedere Tabella dei materiali) e riscaldare i campioni a 100 °C per 5 minuti. Caricare i campioni nel gel (10 μL/pozzetto). Eseguire l'elettroforesi a 60 V per 20 minuti e modificare la condizione a 120 V per 1 ora.
- Trasferire la proteina dal gel alle membrane tampone occidentali PVDF (vedi Tabella dei materiali) a 100 V per 70 minuti.
- Mettere la membrana in latte in polvere senza grassi al 5% / TBST e agitare per 1 ora. Quindi, lavare 3 volte con TBST per 5 minuti per lavaggio con agitazione.
- Inserire la membrana in anticorpi His-Tag/TBST allo 0,1% (vedere la tabella dei materiali) e agitare per 1 ora, quindi lavare 3 volte con TBST per 5 minuti per lavaggio agitando.
- Mettere la membrana in uno 0,02% di anticorpi IgG1 anti-topo (HRP)/TBST (vedere la tabella dei materiali) e agitare per 40 minuti, quindi lavare 3 volte con TBST per 5 minuti per lavaggio agitando.
- Aggiungere una soluzione di chemiluminescenza potenziata (vedere la tabella dei materiali) ed esporre la membrana.
- Eseguire la purificazione di OMV-RBD.
- Diluire 1 mL di soluzione di OMV-RBD reagito a 10 mL e centrifugare la diluizione a 150.000 x g a 4 °C per 2 ore.
- Utilizzare una pipetta per eliminare il surnatante e sospendere il residuo con 10 ml di PBS. Centrifugare la sospensione a 150.000 x g a 4 °C per 2 ore.
- Scartare il surnatante e sospendere il residuo con 1 mL di PBS.
NOTA: Se la solubilità dell'antigene è molto più bassa, lo stesso effetto di separazione può essere ottenuto mediante cromatografia ad esclusione dimensionale19.
5. Caratterizzazione
- Eseguire la diffusione dinamica della luce (DLS).
- Diluire i campioni ad una concentrazione di 100 μg/mL e aggiungere 1 mL di campione nella cella del campione.
- Scegliere "Dimensioni" per "Tipo di misurazione", "Proteine" per "Materiale campione", "Acqua" per "Disperdente", "25 °C" per "Temperatura", quindi caricare i campioni e misurare automaticamente23.
- Acquisire immagini utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
- Diluire i campioni a 100 μg/ml. Prendi una griglia di rame a 200 maglie, aggiungi 20 μL di campione e lascia che venga assorbita per 10 minuti.
- Utilizzare carta da filtro per rimuovere la soluzione, aggiungere 20 μL di acetato di uranile al 3% al film di supporto e colorare per 30 s.
- Togliere l'acetato di uranile e asciugare il film naturalmente a temperatura ambiente per 1 ora.
- Caricare i campioni nel sistema TEM (vedere Tabella dei materiali) e acquisire immagini a 80 kV.
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Representative Results
Il diagramma di flusso per questo protocollo è illustrato nella Figura 1. Questo protocollo potrebbe essere un approccio generale all'utilizzo di OMV come piattaforma vaccinale; Basta scegliere i sistemi di espressione appropriati in base al tipo di antigeni.
La Figura 2 fornisce uno schema di progettazione plasmidica fattibile. Il gene SC è collegato con il gene ClyA tramite un linker flessibile, mentre ST si collega al terminale 5' del gene RBD con un gene His-tag per la purificazione e la verifica. Western blot ha mostrato che la reazione si completa gradualmente con l'aumento di OMV-SC (Figura 3A). Dopo l'ultracentrifugazione, quasi tutti gli RBD-ST non reagiti sono rimasti nel surnatante. La seconda ultracentrifugazione non ha fornito un ulteriore vantaggio significativo rispetto alla prima volta (Figura 3B).
La distribuzione della dimensione delle particelle è stata determinata dal DLS (Figura 4). Il diametro idrodinamico medio Z di OMV-SC era di 133 nm, mentre era di 152,6 nm per OMV-RBD (Tabella 1). Queste differenze possono essere dovute al fatto che RBD aumenta la dimensione delle particelle OMV dopo una visualizzazione intensiva. I risultati di TEM (Figura 5) sono coerenti con i risultati DLS. Le immagini hanno mostrato che gli OMV hanno sempre una struttura sferica standard, indipendentemente dal fatto che siano collegati a RBD o meno. Ciò indica che le condizioni di estrazione, reazione e purificazione sono favorevoli al mantenimento dell'attività biologica degli OMV.
Figura 1: Diagramma di flusso della preparazione di OMV-RBD. Il plasmide ClyA-SC è stato trasformato in E.coli, mentre il plasmide RBD-ST è stato trasfettato in cellule HEK293F. Dopo un periodo di coltivazione, OMV-SC e RBD-ST sono stati isolati e purificati. Dopo la bioconiugazione in tampone convenzionale e l'ultracentrifugazione, è stato ottenuto OMV-RBD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: I profili plasmidici utilizzati in questo studio . (A) pThioHisA ClyA-SC plasmide. (B) PCDNA RBD-ST plasmide. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Verifica di OMV-RBD mediante western blot. (A) L'esplorazione del rapporto di reazione tra OMV-SC e RBD-ST con HisTag anti-6x. M: marcatore di peso molecolare 1: OMV-SC; 2: RBD-ST; 3: OMV:RBD = 10:1 (w/w); 4: OMV:RBD = 20:1; 5: OMV:RBD = 40:1. (B) Validazione dell'efficienza dell'ultracentrifugazione con HisTag anti-6x. M: marcatore di peso molecolare 1: OMV-SC; 2: pre-ultracentrifugazione OMV-RBD; 3: RBD-ST; 4: surnatante post prima ultracentrifugazione; 5: precipitare dopo la prima ultracentrifugazione; 6: ultracentrifugazione post seconda surnatante 7: precipitare dopo la seconda ultracentrifugazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Distribuzione granulometrica misurata mediante DLS . (A) OMV-SC. (B) OMV-RBD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Visualizzazione di OMV mediante TEM. (A) OMV-SC (200 μg/mL). (B) OMV-RBD (200 μg/ml). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Nome del campione | Temperatura (°C) | Z-Ave (d.nm) | PdI |
| OMV-SC | 25 | 133 | 0.483 |
| OMV-RBD | 24.9 | 152.6 | 0.569 |
Tabella 1: Parametri misurati dal DLS.
File supplementare 1: Sequenze plasmidiche utilizzate nel presente studio. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Per creare una piattaforma di vaccino a nanoparticelle "Plug-and-Display", ClyA fuso SC è stato espresso in ceppi BL21 (DE3), che è uno dei modelli più utilizzati per la produzione di proteine ricombinanti a causa dei suoi vantaggi nell'espressione proteica24, in modo che ci sarebbe abbastanza frammento SC visualizzato sulla superficie degli OMV durante il processo di proliferazione batterica. Allo stesso tempo, è stato preparato un antigene bersaglio fuso ST per l'accoppiamento chimico tra gli antigeni e gli OMV. I vantaggi di questo schema sperimentale e le prospettive di applicazione futura si riflettono principalmente in tre aspetti. In primo luogo, viene realizzato il sistema "Plug-and-Display" di diversi antigeni e nanoparticelle biologiche. Il processo di reazione e purificazione potrebbe essere rapido e semplice, il che presenta vantaggi significativi nello sviluppo di vaccini per malattie infettive emergenti e altri scenari. In secondo luogo, raggiunge l'obiettivo della visualizzazione di antigeni ad alta densità e fornisce un metodo di progettazione del vaccino per alcuni antigeni con bassa immunogenicità. In terzo luogo, l'espressione individuale di OMV e RBD (proteina antigenica) è utile per garantire un'elevata attività dell'antigene perché i sistemi di espressione procariotica convenzionali mancano di funzioni come particolari cofattori, chaperoni molecolari e modifiche post-traduzionali, che possono portare alla perdita di proteine e al misfolding.
Nel processo di costruzione del plasmide, il ClyA è stato scelto come bersaglio per connettersi con SC principalmente a causa della struttura a forma di botte sciolta del terminale C di ClyA. Gli studi hanno dimostrato che l'autotrasportatore della proteasi dell'emoglobina (Hbp) può mostrare antigeni da polmonite da Streptococcus e Mycobacterium tuberculosis25,26. Altrimenti, se l'antigene da visualizzare proviene da un procariota, è possibile costruire gli antigeni direttamente nel C-terminale di ClyA senza utilizzare la coniugazione SC/ST. Questo metodo può portare a OMV con una maggiore densità di visualizzazione, ma c'è ancora il rischio che le proteine antigeniche non si ripieghino correttamente. È importante notare che un linker flessibile deve essere progettato e utilizzato quando SC/ST viene inserito nel frammento target, il che aiuta a migliorare l'efficienza di reazione tra SC e ST. La sequenza di linker utilizzata qui era GSGGSGGSGTG e possono essere selezionati anche altri linker flessibili.
Oltre al sistema SC/ST per la coniugazione click-chimica, la coniugazione Snooptag/Snoopcatcher e Sortase A sono comunemente usate anche per la coniugazione covalente tra le proteine27,28. Allo stesso tempo, è stato anche riportato che l'introduzione di più sistemi di collegamento diversi sullo stesso vettore29 o l'uso dello stesso sistema di collegamento per più antigeni19 può raggiungere lo scopo di visualizzare più antigeni eterologhi sullo stesso vettore, e quindi possono essere preparati vaccini polivalenti o multifunzionali.
L'elevata citotossicità e la bassa resa limitano l'uso diffuso di OMV come piattaforme vaccinali 4,30. Alcuni geni correlati alla LPS sono stati eliminati nel ceppo utilizzato in questo protocollo, secondo la letteratura pertinente31,32,33, al fine di ridurre la citotossicità delle OMV. 1,18 mg di OMV possono essere estratti da ogni 1 L della soluzione batterica con il metodo introdotto in questo protocollo. La resa è ancora inferiore a quella di alcuni ceppi geneticamente modificati ad alta produzione di vescicole34. Se necessario, l'omogeneizzazione ad alta pressione può anche promuovere la germinazione della membrana batterica per produrre più OMV, che possono ottenere una migliore resa e densità di visualizzazione allo stesso tempo35.
Le condizioni di induzione sono cruciali per la densità di SC visualizzata sulla superficie degli OMV. Abbiamo monitorato l'espressione della proteina bersaglio attraverso SDS-PAGE e poi abbiamo esaminato la condizione di induzione, che è relativamente lieve ed esprime più proteine. Proteine diverse possono richiedere condizioni di induzione diverse e cambiamenti nelle condizioni di induzione possono portare a differenze nella densità di SC visualizzata sulla superficie degli OMV. Si suggerisce di regolare il rapporto tra antigene e carrier dopo il cambiamento delle condizioni sperimentali per esplorare il rapporto di reazione più appropriato. Inoltre, la purificazione di OMV-RBD può essere ottenuta mediante SEM o ultracentrifugazione. Entrambi i metodi sono stati provati; l'ultracentrifugazione è più conveniente e l'OMV risultante aveva una purezza simile al protocollo SEM.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Key Program of Chongqing Natural Science Foundation (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) e il progetto della Chinese National Natural Science Foundation (n. 31670936, 82041045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
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