Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bestemmelse af tarmpermeabilitet ved hjælp af Lucifer Yellow i en apikal enteroidmodel

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64215

Summary

Den nuværende protokol skitserer en metode, der anvender lucifer gul i en apikal-out enteroid model til bestemmelse af tarmpermeabilitet. Denne metode kan bruges til at bestemme paracellulær permeabilitet hos enteroider, der modellerer inflammatoriske tarmsygdomme såsom nekrotiserende enterocolitis.

Abstract

Enteroider er et nyt forskningsværktøj i undersøgelsen af inflammatoriske tarmsygdomme såsom nekrotiserende enterocolitis (NEC). De dyrkes traditionelt i den basolaterale ud (BO) konformation, hvor epitelcellens apikale overflade vender mod det indre lumen. I denne model er adgang til den lysende overflade af enteroider til behandling og eksperimentering udfordrende, hvilket begrænser evnen til at studere værtspatogeninteraktioner. For at omgå dette blev der oprettet en neonatal apical-out (AO) model til nekrotiserende enterocolitis. Da ændringer i tarmepitelcellepermeabilitet er patognomoniske for NEC, skitserer denne protokol ved hjælp af lucifer gul (LY) som en markør for paracellulær permeabilitet. LY krydser tarmepitelbarrieren via alle tre store paracellulære veje: pore, lækage og ubegrænset. Brug af LY i en AO-model giver mulighed for en bredere undersøgelse af permeabilitet i NEC. Efter IRB-godkendelse og forældrenes samtykke blev kirurgiske prøver af tarmvæv indsamlet fra humane for tidligt fødte nyfødte. Intestinale stamceller blev høstet via kryptisolering og brugt til at dyrke enteroider. Enteroider blev dyrket til modenhed og derefter omdannet AO eller efterladt i BO-konformation. Disse blev enten ikke behandlet (kontrol) eller blev behandlet med lipopolysaccharid (LPS) og udsat for hypoxiske tilstande til induktion af in vitro NEC. LY blev brugt til at vurdere permeabilitet. Immunofluorescerende farvning af det apikale protein zonula okkluraner-1 og basolateralt protein β-catenin bekræftede AO-konformation. Både AO- og BO-enteroider behandlet med LPS og hypoxi viste signifikant øget paracellulær permeabilitet sammenlignet med kontroller. Både AO- og BO-enteroider viste øget optagelse af LY i lumen af de behandlede enteroider sammenlignet med kontroller. Anvendelsen af LY i en AO enteroid model giver mulighed for undersøgelse af alle tre hovedveje for paracellulær permeabilitet. Det giver desuden mulighed for undersøgelse af værtspatogeninteraktioner, og hvordan dette kan påvirke permeabiliteten sammenlignet med BO enteroidmodellen.

Introduction

Enteroider er tredimensionelle (3D) strukturer afledt af organbegrænsede humane tarmstamceller 1,2. De består udelukkende af epitelafstamning og indeholder alle de differentierede tarmepitelcelletyper2. Enteroider opretholder også cellulær polaritet, der består af en apikal luminal overflade, der danner et indre rum og en basolateral overflade, der vender mod det omgivende medie. Enteroider er en unik model, idet de bevarer egenskaberne ved den vært, hvorfra de blev genereret3. Således repræsenterer enteroider genereret fra for tidlige menneskelige spædbørn en model, der er nyttig til undersøgelse af sygdomme, der primært påvirker denne befolkning, såsom nekrotiserende enterocolitis (NEC).

Den traditionelle enteroidmodel dyrkes i en basolateral-out (BO) konformation, hvor enteroiden er indkapslet i en kuppel af kældermembranmatrix (BMM). BMM inducerer enteroiden til at opretholde en 3D-struktur med den basolaterale overflade på ydersiden. BO-enteroider er en passende model til NEC, der bygger bro mellem todimensionale (2D) primære humane cellelinjer og in vivo-dyremodeller 2,4. NEC induceres i enteroider ved at placere patogener såsom LPS eller bakterier i medierne omkring enteroiderne efterfulgt af eksponering for hypoxiske tilstande 2,3. Udfordringen med BO enteroid NEC-modellen er, at den ikke tillader effektiv undersøgelse af værtspatogeninteraktioner, som forekommer ved den apikale overflade in vivo. Ændringer i tarmpermeabilitet skyldes disse værtspatogeninteraktioner. For bedre at forstå, hvordan permeabilitet påvirker det patofysiologiske grundlag for sygdom, skal der oprettes en model, der involverer behandling af den apikale overflade.

Co et al. var de første til at demonstrere, at modne BO-enteroider kan induceres til at danne en apikal-out (AO) konformation ved at fjerne BMM-kuplerne og resuspending dem i medier5. Denne artikel viste, at AO-enteroider opretholdt korrekt epitelpolaritet, indeholdt alle tarmcelletyper, opretholdt tarmepitelbarrieren og tillod adgang til den apikale overflade5. Ved hjælp af AO-enteroider som NEC-model opnås en fysiologisk reproduktion af sygdomsprocessen og undersøgelse af værtspatogeninteraktioner.

En stor bidragyder til patofysiologien af NEC er øget tarmpermeabilitet6. Flere molekyler er blevet foreslået som en måde at teste for tarmpermeabilitet in vitro7. Blandt disse er lucifer gul (LY) et hydrofilt farvestof med excitations- og emissionstoppe ved henholdsvis428 nm og 540 nm 8. Da det krydser gennem alle de store paracellulære veje, er det blevet brugt til at evaluere paracellulær permeabilitet i forskellige applikationer, herunder blod-hjerne og tarmepitelbarrierer 8,9. Den traditionelle anvendelse af LY bruger celler dyrket i monolag på en semipermeabel overflade10. LY påføres den apikale overflade og krydser gennem paracellulære tætte krydsproteiner for at samles på den basolaterale side. Højere LY-koncentrationer i det basolaterale rum indikerer nedsat tæt forbindelsesproteiner med efterfølgende nedbrydning af tarmepitelcellebarrieren og øget permeabilitet10. Det er også blevet beskrevet i 3D BO enteroidmodeller, hvor LY blev tilføjet til medierne, og individuelle enteroider blev afbildet til optagelse af LY i lumen11. Selvom dette giver mulighed for kvalitativ analyse via visualisering af LY-optagelse, er kvantitativ analyse begrænset. Denne protokol skitserer en unik teknik, der bruger LY til at vurdere paracellulær permeabilitet ved hjælp af en in vitro NEC enteroidmodel i AO-enteroider, samtidig med at 3D-orienteringen opretholdes. Denne metode kan bruges til både kvalitativ og kvantitativ analyse af permeabilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nuværende forskning blev udført i overensstemmelse med Institutional Review Board godkendelse (IRB, # 11610, 11611) ved University of Oklahoma. Forældres samtykke var påkrævet forud for indsamling af humane kirurgiske prøver i henhold til IRB-specifikationer. Efter IRB-godkendelse og forældrenes samtykke blev humant tyndtarmsvæv opnået fra spædbørn (korrigeret svangerskabsalder (GA), der spænder fra 36-41 uger på tidspunktet for prøveindsamling, alle med en historie med for tidlig fødsel ved en anslået GA på 25-34 uger, 2: 1 M: F), der gennemgår kirurgi for NEC eller anden tarmresektion, såsom stomifjernelse eller atresireparation. Enteroider blev genereret fra væv opnået fra enten jejunum eller ileum.

1. Enteroidkulturer afledt af mennesker fra spædbørn: kryptisolering og plettering fra hele væv

  1. Forbered kulturmedier, chelatering buffer #1 og chelatering buffer #2 (tabel 1) efter den foregående rapport4. Chelatbuffere opbevares ved 4 °C, og de anvendes inden for 48 timer.
  2. Forbered menneskelige minigutmedier (tabel 1). Opbevar lageret ved -20 °C og varmt i et 37 °C vandbad inden brug.
  3. Forbered 50% L-WRN konditionerede medier (CM) (tabel 1). Opbevar lageret ved 4 °C i op til 1 uge.
    BEMÆRK: 100% L-WRN-base for de konditionerede medier er beskrevet i en protokol af Miyoshi et al.12.
  4. Generer enteroider fra tyndtarmsvævsprøver opnået fra kirurgiske prøver efter den foregående rapport4. Plade fire brønde af enteroider i en 24-brønd plade fra et 0,75-2,5 g stykke tarmvæv.
    BEMÆRK: Enteroider kan med succes genereres fra væv opbevaret i 30 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium i et 50 ml konisk rør ved 4 ° C i op til 48 timer.
  5. Placer 24-brøndspladen i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator på hovedet i 15-20 minutter for at muliggøre polymerisation af BMM domes4.
  6. Der tilsættes 500 μL 50 % L-WRN CM (som beskrevet i trin 1.3) med 0,5 μL Y-27632, ROCK-hæmmer (RI, se Materialetabel) til hver brønd. Efter 2-3 dage udskiftes med 50% L-WRN CM uden RI.

2. Generering af AO-enteroider

  1. Dyrk enteroider indlejret i BMM i 7-10 dage med 50% L-WRN CM4.
  2. Fjern mediet, og tilsæt 500 μL cellegendannelsesopløsning (CRS, se Tabel over materialer) til en brønd. Skrab kuplen, pipetten op og ned flere gange, og tilsæt derefter CRS/enteroid/BMM-opløsningen til den næste brønd.
  3. Skrab kuplen, pipetten op og ned flere gange, og anbring opløsningen i et mikrocentrifugerør. Tilsæt 500 μL CRS til den anden brønd, pipetter op og ned, og tilsæt den derefter til den første brønd. Overfør denne opløsning til det samme 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  4. Gentag trin 2.3, og saml to brønde i et mikrocentrifugerør, indtil alt brøndindholdet er i CRS.
    BEMÆRK: Mere end to brønde kan samles i et større 15 ml konisk rør, hvis der genereres store mængder AO-enteroider. Opretholdelse af et 500 μL CRS pr. brøndforhold er vigtigt for at sikre fuldstændig opløselighed af BMM.
  5. Mikrocentrifugerørene (trin 2.3) anbringes med samlet CRS/enteroid/BMM-opløsning på en rotator i 1 time ved 4 °C for at opløse BMM'en.
  6. Centrifuger opløsningen ved 200 x g i 3 minutter ved 4 °C, og fjern derefter supernatanten med en mikropipette, og lad pelleten stå.
  7. Enteroidpelleten gensuspenderes i 1 ml 50% L-WRN CM (som fremstillet i trin 1.3) pr. mikrocentrifugerør. Forsigtigt pipetteres 500 μL af den gensuspenderede enteroid/medieopløsning i hver brønd i de ultralave fastgjorte 24-brønds vævskulturplader (se Materialetabel).
  8. Inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 3 dage før forsøg.

3. Verifikation af AO enteroid konformation via helmonteret immunfluorescerende farvning

  1. Efter inkubation af enteroiderne i mediesuspension i 3 dage pipetteres enteroid/mediesuspensionen fra et godt stykke ind i et mikrocentrifugerør.
  2. Enteroid-/medieophænget centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten med en mikropipette.
  3. Resuspender enteroiderne i 20 μL BMM. Pipetter 10 μL enteroidophæng på et mikroskopglas og fordel det i et tyndt lag ca. 1 cm x 1 cm kvadratisk. Gentag med de resterende 10 μL enteroidophæng på en separat del af det samme dias, så der er to udstrygninger af enteroid/BMM-suspension.
  4. Lad enteroid/BMM-udstrygningerne størkne ved stuetemperatur (RT) i 15 minutter.
  5. Arbejd i røghætten, læg diaset i en farvebeholder og fyld med 4% paraformaldehyd, indtil det dækker enteroid / BMM-udtværing (~ 30 ml for et dias, hvis du bruger en glasfarvningskrukke med 10 diaskapacitet). Lad 30 minutter (ved stuetemperatur) finde sted.
    FORSIGTIG: 4% paraformaldehyd er farligt og kan forårsage øjenskader / irritation, hudirritation og kræft. Arbejd altid under en røghætte, når du bruger den. Brug beskyttelseshandsker og personlige værnemidler, når du håndterer det. Bortskaf det i en godkendt affaldsbeholder.
  6. Kassér 4% paraformaldehyd i en passende affaldsbeholder. Der tilsættes 30 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) til farvningsglasset, eller indtil PBS dækker enteroid/BMM-udstrygningerne. Lad det sidde i 3 min ved RT, og kassér derefter PBS i paraformaldehydaffaldsflasken. Gentag dette trin to gange mere for i alt tre vaske.
  7. Fyld en ny farvningskrukke med 30 ml 0,5% Triton X-100 fortyndet i PBS. Placer diaset med enteroid/BMM-udstrygninger i Triton-opløsningen, og lad det trænge igennem i 20 minutter ved RT.
  8. De 0,5% Triton X-100, der er fortyndet i PBS, kasseres. Tilsæt 30 ml PBS til farvningskrukken og lad den sidde i 3 min. Kassér PBS ved dekantering.
  9. Tør forsigtigt glideren omkring enteroid/BMM-udtværingerne, og pas på ikke at forstyrre dem. Brug en hydrofob barrierepen (barriere PAP-pen, se Materialetabel) til at tegne en cirkel omkring hver af enteroid/BMM-udstrygningerne. Lav et 20% serum, der er specifikt for det dyr, hvor det sekundære antistof blev rejst (se Materialetabel).
  10. Læg mikroskoprutsjebanen fladt på laboratoriebænken. Glideglasset blokeres i 1 time ved 4 °C ved at pipettere 100 μL specifikt 20 % serum fra trin 3.9 på hver af de enteroid-/BMM-udstrygninger, der er omkranset af den hydrofobe barrierepen.
  11. Der fremstilles en 100 μL opløsning med 1:100 og 1:200 fortyndinger af henholdsvis β-catenin og ZO-1 primære antistoffer, fortyndet i PBS.
    BEMÆRK: Hvert primært antistof skal være fra et andet dyr for at sikre, at de vil have forskellige immunfluorescerende kanaler, når de afbildes. Denne undersøgelse anvender et muse-β-catenin-antistof og et kanin ZO-1-antistof (se Materialetabel).
  12. Tryk på diaset på disken for at fjerne 20% serum, og tør forsigtigt det af, og pas på ikke at forstyrre enteroid/BMM-udstrygningerne. Pipette 100 μL β-catenin/ZO-1 primær antistofopløsning på en af enteroid/BMM-udstrygningerne. Pipetter 100 μL PBS uden primært antistof på den anden enteroid/BMM-udtværing som en negativ kontrol.
  13. Beklæd bunden af en plastbeholder med et vådt papirhåndklæde for at skabe en befugtet beholder. Placer diaset i beholderen, og pas på ikke at forstyrre opløsninger, der dækker enteroid / BMM-udstrygninger. Læg låget på beholderen for at forsegle, og opbevar det fladt ved 4 °C natten over.
    BEMÆRK: Lad ikke rutsjebanen tørre ud. Sørg for, at beholderen er lukket for at undgå udtørring.
  14. Når du er klar til at fortsætte, skal du trykke på diaset på tælleren for at fjerne primære antistoffer og PBS fra enteroid / BMM-udstrygningerne.
  15. Udfør et vasketrin ved at placere diaset i en farvningsbeholder og fylde med 30 ml PBS, eller indtil PBS dækker enteroid/BMM-udstrygningerne. Lad det sidde i 3 min ved stuetemperatur. Kassér PBS'en, og gentag dette trin to gange mere i alt tre vaske.
  16. Der fremstilles 200 μL sekundære antistoffer til to forskellige immunfluorescerende kanaler, hvor hvert antistof har en fortynding på 1:1000 i PBS (se materialetabel). Hold opløsningen væk fra lys.
  17. Der pipetteres 100 μL sekundær antistofopløsning på hver af enteroid/BMM-udstrygningerne. Placer den i mørket og lad den sidde i 1 time ved RT.
  18. Tryk på diaset på tælleren for at fjerne sekundære antistoffer. Gentag vasketrinnene i trin 3.15, og sørg for, at alle vaske udføres i mørke.
  19. Tilsæt en dråbe 4′,6-diamidino-2-phenylindol (fluorskjold med DAPI, se Materialetabel) monteringsmedium til hver af enteroid/BMM-udstrygningerne, og påfør en dækslip for at sikre, at begge udstrygninger er tilstrækkeligt dækket. Undgå at fange bobler under dækslippen. Hold diaset i mørke, indtil det er klar til at se under mikroskopet.
    BEMÆRK: Øjeblikkelig billeddannelse af diasene giver de mest optimale resultater; dias kan dog opbevares fladt i en befugtet beholder ved 4 °C og afbildes i op til 1 uge efter tilsætning af DAPI.

4. Induktion af eksperimentel NEC

  1. Sørg for, at AO-enteroider har været i suspension i mindst 72 timer før brug.
  2. Forsigtigt pipetteres al enteroid/medieophæng fra hver brønd ned i et mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: Flere brønde kan samles i et 15 ml konisk rør, hvis et stort volumen brønde behandles. Der anbefales mindst tre brønde pr. behandlingsgruppe til denne protokol.
  3. Centrifuge ved 300 x g i 3 minutter ved RT og fjern supernatanten.
  4. Der tilsættes 10 μL 5 mg/ml lipopolysaccharid (LPS, se materialetabel) til 500 μL 50% LWRN CM pr. brønd (slutkoncentration 100 μg/ml LPS).
  5. Resuspenderer AO-enteroider udpeget som behandlingsgruppe i 50% LWRN + LPS og aliquot 500 μL suspension til en 24-brønds ultralav fastgørelsesplade. Resuspend AO-enteroider betegnet som ubehandlede kontroller i 500 μL 50% LWRN CM pr. Brønd. Aliquot 500 μL af denne suspension til en separat 24-brønds ultra-lav fastgørelsesplade.
  6. Inducer hypoxi i de LPS-behandlede AO-enteroider via et modulært inkubatorkammer (MIC) med 1%O2, 5% CO 2 og 94% N2 i henhold til producentens anvisninger (se Materialetabel). Behandl enteroiderne med hypoxi og LPS i 24 timer.
  7. De ubehandlede og LPS + hypoxibehandlede kulturer, stadig i MIC-kammeret, anbringes i en 37 °C, 5 % CO2 -inkubator i 24 timer.

5. Måling af paracellulær permeabilitet ved hjælp af LY

  1. Forsigtigt pipetteres enteroid-/mediesuspensionen fra hver brønd ind i et mikrocentrifugerør. Varm DPBS og 50% LRWN CM i et 37 °C vandbad.
  2. Centrifuge enteroid/medieophænget ved 300 x g i 3 minutter ved RT.
  3. Fjern mediet. Vask enteroiderne med varme 500 μL DPBS.
  4. Centrifuge ved 300 x g i 3 minutter ved RT. Fjern supernatanten med en mikropipette.
  5. Gentag trin 5.3-5.4 igen i alt to gange.
  6. Efter vask tilsættes 450 μL varm 50% LWRN CM (som tilberedt i trin 1.3).
  7. Der tilsættes 50 μL 2,5 mg/ml LY (slutkoncentrationen er 0,25 μg/μL, se materialetabel) til hver brønd og hvirvles forsigtigt for at blande. Anbring i en 37 °C, 5% CO 2 inkubator i2 timer.
  8. Forsigtigt pipetteres enteroid-/mediesuspensionen fra hver brønd ind i et mikrocentrifugerør.
  9. Centrifuge ved 300 x g i 3 minutter ved RT, fjern derefter supernatanten, og lad enteroidpillen stå.
  10. Vask enteroiderne med 500 μL varm DPBS.
  11. Centrifuge ved 300 x g i 3 minutter ved RT, og fjern derefter supernatanten, der efterlader den enteroide pille.
  12. Gentag trin 5.10-5.11 tre gange mere for i alt fire vaske.
  13. Resuspender hver pellet med 1.000 μL kold DPBS og pipetterer kraftigt op og ned for at adskille enteroiderne.
  14. Der udarbejdes standarder for LY-standardkurven fortyndet i DPBS (100 ng/ml; 50 ng/ml; 25 ng/ml; 12,5 ng/ml; 6,25 ng/ml; 3,13 ng/ml; 1,57 ng/ml; 0 ng/ml).
  15. Der pipetteres 150 μL af hver prøve pr. boring i tre eksemplarer på en plade med 96 brønde.
  16. Fluorescensen måles ved en excitationstop på 428 nm og emissionstoppen på 536 nm på en pladelæser, der er i stand til at læse fluorescens (se Materialetabel). Ved hjælp af statistisk software (se Materialetabel) beregnes koncentrationerne ved at interpolere standardkurven og bruge en kurve med fire parametre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

AO konformation
Enteroider suspenderet i 50% LWRN-medier i 72 timer antager en AO-konformation (figur 1). Dette blev bekræftet via immunfluorescerende farvning ved hjælp af enteroide hele monteringer af det apikale protein, zonula occludens-1 (ZO-1) og basolateralt protein, β-catenin (figur 1). AO-enteroider viser ZO-1 (grøn) på den ydre, apikale overflade af enteroiden, mens β-catenin (rød) er på den indre, basolaterale overflade (figur 1A). BO-enteroider viser det inverse med β-catenin (rødt) på den ydre overflade og ZO-1 (grøn) på den indre, lysende overflade (figur 1B). Disse resultater viser den forventede polaritetsvending for at bekræfte, at enteroiderne er AO før eksperimentering.

LY assay resultater
Øget permeabilitet, demonstreret ved øget optagelse af LY-farvestof i enteroid lumen, forventes i NEC6. BO-enteroider behandlet med LPS og hypoxi viste signifikant øget permeabilitet sammenlignet med ubehandlede kontroller ved hjælp af den teknik, der er beskrevet i denne protokol (figur 2A, **p = 0,005). Dette stemmer overens med den litteratur, der har beskrevet øget permeabilitet i BO enteroidmodeller af NEC 4,13. Tilsvarende viste AO-enteroider behandlet med LPS og hypoxi også signifikant øget permeabilitet sammenlignet med ubehandlede kontroller, som forventet i en NEC-model (figur 3A, *p = 0,02). Behandlede AO-enteroider viste øget optagelse af LY i lumen hos behandlede enteroider (figur 3C) sammenlignet med ubehandlede kontroller (figur 3B). Dette svarer til det, der ses i BO-enteroider, hvor LY visualiseres i enteroidlumen (figur 2B). Øget optagelse af LY-farvestof i enteroidens lumen resulterer i øget fluorescens hos behandlede enteroider, hvilket muliggør kvantitativ analyse via en mikropladelæser ved hjælp af AO-enteroider fra forskellige brønde (figur 3A). Dette viser, at denne teknik, der anvender LY, kan bruges til at vurdere permeabilitet i 3D-enteroider. Resultaterne kan analyseres ved hjælp af statistisk software, der er i stand til at interpolere en standardkurve for at bestemme LY-koncentrationerne af behandlingsgrupperne. En studerendes t-test, som vist i figur 2 og figur 3, kan bruges til at bestemme betydningen mellem grupper.

Figure 1
Figur 1: Verifikation af AO-konformation . (A) Apical-out (AO) enteroid, der viser omvendt polaritet sammenlignet med (B) basolateral out (BO) enteroid, der viser traditionel polaritet ved 20x forstørrelse, skalabjælke indstillet til 100 μm. DAPI, blå; beta-catenin (basolateralt protein), rød; zonula occludens-1 (apikalt protein), grøn. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Øget permeabilitet i en BO enteroidmodel efter in vitro NEC-induktion målt ved et LY-assay. (A) LPS- og hypoxibehandlede basolaterale enteroider har signifikant øget permeabilitet sammenlignet med ubehandlede kontroller, der anvender lucifergult assay; fejlbjælker viser standardfejlen for middelværdien; **p = 0,005. (B) Billede af basolaterale enteroider med lucifer gul visualiseret i lumen efter behandling af medierne med lucifer gult farvestof ved 10x forstørrelse, 300 μm skala bar. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Øget permeabilitet i en AO enteroid model efter in vitro NEC induktion målt ved et LY assay. (A) LPS og hypoxi-behandlede apikale enteroider har signifikant øget permeabilitet sammenlignet med ubehandlede kontroller ved hjælp af lucifer gul assay; fejlbjælker viser standardfejlen for middelværdien; *p = 0,02. (B) et repræsentativt billede af ubehandlet kontrol apical-out (AO) enteroid ved 10x; skalabjælken er indstillet til 100 μm. (C) Et repræsentativt billede af en LPS- og hypoxibehandlet AO-enteroid med LY visualiseres i lumen ved 10x; Skalalinjen er indstillet til 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sammensætning af opløsninger, buffere og medier, der er anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tarmpermeabilitet er kompleks og afspejler epitelbarrierefunktion. Tarmbarrieren består af et enkelt lag af epitelceller, der formidler transcellulær og paracellulær transport14. Paracellulær permeabilitet er afhængig af tætte krydsproteiner, der forsegler mellemrummet mellem epitelceller14. Inden for denne paracellulære transport er der tre forskellige veje, hvormed molekyler kan krydse: pore, lækage og ubegrænset15. Porevejen giver mulighed for permeabilitet for små ladede ioner, mens lækagevejen tillader større, uladede molekyler over15. Den tredje, ubegrænsede vej afspejler permeabilitet sekundært til epitelskader eller død16. Selvom mange molekyler bruges til at vurdere paracellulær permeabilitet, påvirker molekylets type og størrelse, hvilken permeabilitetsvej der vil blive undersøgt.

Som et lille, hydrofilt molekyle kan LY krydse gennem alle tre paracellulære veje, hvilket gør det til et optimalt værktøj til at studere paracellulær permeabilitet. I modsætning hertil kan 4 kDa FITC-dextran, et sukkermolekyle, der anvendes som markør for paracellulær permeabilitet, kun krydse lækagen og ubegrænsede veje. Den større, 70 kDa FITC-dextran er begrænset til kun den ubegrænsede vej. En anden metode til bestemmelse af paracellulær permeabilitet er via transepitelresistensmålinger (TEER), som måler elektrisk modstand på tværs af monolag. Denne metode måler kun porevejen17. Således giver LY større indsigt i den samlede paracellulære permeabilitet ved at målrette mod alle tre veje. Denne protokol udnytter dette ved at bruge LY til at studere paracellulær permeabilitet.

Enteroidmodellen blev valgt i denne protokol, da den nærmere efterligner in vivo-forhold ved at skabe en 3D-minitarm til undersøgelse. Udfordringen med den traditionelle BO enteroidmodel er imidlertid, hvordan man får adgang til den apikale overflade for at studere værtspatogeninteraktioner og de efterfølgende permeabilitetsændringer. AO enteroid-modellen overvinder denne udfordring ved at vende polariteten, hvor den apikale overflade er i kontakt med de omgivende medier. Flere alternative metoder til at få adgang til den apikale overflade af enteroider er blevet beskrevet. Disse omfatter tarmchipsystemer, mikroinjektion, fragmentering og voksende enteroider i monolag18,19. Fremskridt inden for tarmchipsystemer har gjort det muligt at dyrke organoider og endotelceller sammen i forbindelse med vaskularitet og peristaltik for at efterligne tarmmiljøet18. Mikroinjektion involverer injektion i BO enteroid lumen ved hjælp af specialudstyr såsom en mikromanipulator og mikroinjektor19. Fragmentering bruger dissociation af enteroider i enkeltceller, der derefter inkuberes i medier med patogenet, før de reformerer en 3D-struktur19. Omdannelsen af enteroider til 2D-monolag med efterfølgende behandling af den apikale overflade er også beskrevet19. AO enteroid-modellen løser nogle af vanskelighederne ved disse modeller ved at give en enkel, effektiv måde at udsætte den apikale overflade uden at kræve dyrt udstyr eller kompromittere enteroidens strukturelle integritet.

Selvom brug af LY i en AO-model giver mulighed for en bred undersøgelse af paracellulær permeabilitet sekundært til værtspatogeninteraktioner, kan denne protokol tilpasses til brug med BO-enteroider såvel som FITC-dextran i stedet for LY. To vigtige ændringer i denne protokol er nødvendige for at ændre den til brug for BO-enteroider. For det første kan BO-enteroider opretholdes i BMM-kupler til alle vasketrin før og efter tilsætning af LY. Det er vigtigt at bruge opløsninger opvarmet til 37 °C til disse vasketrin for at forhindre opløselighed af BMM-kuplen. For det andet skal BMM-kuplen forstyrres med kold DPBS og skrabning af brønden med en pipettespids, efter at alle vasketrin er afsluttet for at muliggøre fuldstændig resuspension af de dissocierede enteroider og LY. Hvis FITC-dextran erstattes af LY, anbefales det at bruge 4 kDa-molekylet, da det krydser gennem to af de tre paracellulære veje.

De vigtigste trin i denne protokol inkluderer at sikre tilstrækkelige vaske til at fjerne ethvert spor LY fra opløsningen uden for enteroiden. Det er også vigtigt at vaske enteroiderne forsigtigt for at undgå dissociation og potentiel frigivelse af LY fra lumen til den omgivende opløsning, indtil de er klar til at kvantificere ved hjælp af en mikropladelæser. Brug af opvarmede opløsninger under vasketrinnene reducerer også stresset på enteroiderne. Hvis der anvendes kolde opløsninger, kan enteroider gennemgå apoptose, hvilket fører til unøjagtige resultater.

Begrænsningerne ved denne metode inkluderer manglende evne til at udbrede AO-enteroider og længere dyrkningstider på grund af de yderligere 72 timer, der kræves for at vende polariteten. Der er også et fald på 2%-5% i antallet af behandlede AO enteroid sammenlignet med kontroller. Selv om dette generelt er ubetydeligt, kan det føre til en undervurdering af resultaterne. Begrænsningerne ved at bruge LY ligner andre permeabilitetsmolekyler, såsom 4 kDa FITC-dextran, hvor spormængder kan krydse tarmepitelbarrieren via transcytose20. Selvom dette beløb er ubetydeligt, kan det påvirke resultaterne. Baseret på disse fund giver anvendelse af LY på medierne af AO-enteroider en elegant og relativt enkel måde at kvantitativt og kvalitativt analysere paracellulær tarmpermeabilitet i en 3D-model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen proprietær eller kommerciel interesse i noget produkt, der er nævnt eller koncept, der diskuteres i denne artikel.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Ashley Nelson fra University of Rochester Medical Center for hendes instrumentale hjælp med vores enteroidmodel. Vi vil også gerne takke Division of Pediatric Surgery ved University of Oklahoma for deres støtte til dette projekt. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research og Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 tildelt Department of Surgery ved University of Oklahoma Health Sciences Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[leu] 15-gastrin 1 Millipore Sigma G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer Corning 431752
100% LWRN conditioned media Made in-house following Miyoshi et al.12
24-well tissue culture plate Corning 3526
96-well black, clear bottom plate Greiner Bio-One 655090
A-83-01 R&D Systems 2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 Invitrogen A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 Invitrogen A-11032
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 Cell Signaling #D6L1E
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 Cell Signaling #14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A Thermo Fisher Scientific 17504-044
Barrier PAP pen Scientific Device Laboratory 9804-02
BMM (Matrigel) Corning CB-40230C
Cell Recovery Solution Corning 354270
Dissecting scissors
DMEM Thermo Fisher Scientific 11-965-118
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 11320-082
DPBS Thermo Fisher Scientific 14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore Sigma GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Millipore Sigma EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system Invitrogen AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Products 100-525
Fluoroshield with DAPI Millipore Sigma F6057-20mL
Forceps
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050-061
GraphPad Prism 9 Dotmatics
Insulin Thermo Fisher Scientific 12585014
Lipopolysaccharide (LPS) Millipore Sigma L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt Invitrogen L453
Modular incubator chamber Billups Rothenberg Inc. MIC101
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) Thermo Fisher Scientific 15630-080
N-Acetylcysteine Millipore Sigma A9165-5G
Nicotinamide Millipore Sigma N0636-100G
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093
SB202190 Millipore Sigma S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader Molecular devices
Tube Revolver Rotator ThermoFisher Scientific 88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate Corning 3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI) Tocris 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
  2. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  3. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  4. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
  5. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  6. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  7. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
  8. Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
  9. Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
  10. Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
  11. Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
  12. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  13. Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
  14. Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
  15. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
  16. Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
  17. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
  19. Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
  20. Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).

Tags

Immunologi og infektion udgave 185
Bestemmelse af tarmpermeabilitet ved hjælp af Lucifer Yellow i en apikal enteroidmodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liebe, H., Schlegel, C., Cai, X.,More

Liebe, H., Schlegel, C., Cai, X., Golubkova, A., Leiva, T., Berry, W. L., Hunter, C. J. Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model. J. Vis. Exp. (185), e64215, doi:10.3791/64215 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter