Summary
본 프로토콜은 장 투과성을 결정하기 위해 정점 엔터로이드 모델에서 루시퍼 옐로우를 활용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 괴사 성 장염과 같은 염증성 장 질환을 모델링하는 장내 세포에서 세포 투과성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
엔테로이드는 괴사성 장염(NEC)과 같은 염증성 장 질환 연구에서 떠오르는 연구 도구입니다. 그들은 전통적으로 상피 세포의 정점 표면이 내부 내강을 향하는 기저측(BO) 형태로 자랍니다. 이 모델에서는 치료 및 실험을 위해 엔테로이드의 내강 표면에 접근하는 것이 어려워 숙주-병원체 상호 작용을 연구하는 능력이 제한됩니다. 이를 피하기 위해 괴사성 장염에 대한 신생아 정점(AO) 모델이 만들어졌습니다. 장 상피 세포 투과성 변화는 NEC에 대한 병리학적이기 때문에 이 프로토콜은 루시퍼 옐로우(LY)를 세포 투과성의 마커로 사용하여 설명합니다. LY는 세 가지 주요 세포 간 경로(기공, 누출 및 제한되지 않음)를 통해 장 상피 장벽을 가로지릅니다. AO 모델에서 LY를 사용하면 NEC의 투과성에 대한 광범위한 연구가 가능합니다. IRB 승인 및 부모의 동의에 따라 인간 조산 신생아로부터 장 조직의 수술 샘플을 수집했습니다. 장 줄기 세포는 지하실 분리 를 통해 수확되어 장내 증식에 사용되었습니다. 엔테로이드는 성숙할 때까지 성장한 다음 AO로 변형되거나 BO 형태로 남았습니다. 이들은 치료되지 않았거나 (대조군) 또는 지질 다당류 (LPS)로 처리되었고 시험관 내 NEC의 유도를위한 저산소 조건을 받았다. 투과성을 평가하기 위해 LY를 사용하였다. 정점 단백질 zonula occludens-1 및 기저측 단백질 β-catenin의 면역형광 염색 결과 AO 형태가 확인되었습니다. LPS와 저산소증으로 치료받은 AO 및 BO 엔테로이드는 대조군에 비해 세포 주위투과성이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. AO 및 BO 엔테로이드 모두 대조군에 비해 처리된 엔테로이드의 내강으로의 LY 흡수가 증가한 것으로 나타났습니다. AO 엔테로이드 모델에서 LY를 활용하면 세포 투과성의 세 가지 주요 경로를 모두 조사할 수 있습니다. 또한 숙주-병원체 상호 작용과 이것이 BO 엔터로이드 모델과 비교하여 투과성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 조사할 수 있습니다.
Introduction
엔테로이드는 장기 제한 인간 장 줄기 세포 1,2에서 파생된 3차원(3D) 구조입니다. 그들은 전적으로 상피 계통으로 구성되어 있으며 분화 된 모든 장 상피 세포 유형2을 포함합니다. 엔테로이드는 또한 내부 구획을 형성하는 정점 내강 표면과 주변 매체를 향한 기저측 표면으로 구성된 세포 극성을 유지합니다. 엔테로이드는 생성 된 호스트의 특성을 보존한다는 점에서 고유 한 모델입니다3. 따라서 미숙아에서 생성 된 엔터 로이드는 괴사 성 장염 (NEC)과 같이이 집단에 주로 영향을 미치는 질병을 조사하는 데 유용한 모델을 나타냅니다.
전통적인 엔터로이드 모델은 엔테로이드가 기저막 매트릭스(BMM)의 돔에 둘러싸인 기저측부(BO) 형태로 재배됩니다. BMM은 엔터로이드가 외부에 기저측 표면이 있는 3D 구조를 유지하도록 유도합니다. BO 엔테로이드는 2차원(2D) 1차 인간 세포주와 생체 내 동물 모델 2,4 사이의 간극을 해소하는 NEC에 적합한 모델입니다. NEC는 LPS 또는 박테리아와 같은 병원체를 엔테로이드 주변 매체에 배치한 다음 저산소 조건 2,3에 노출시켜 엔테로이드에서 유도됩니다. BO 엔테로이드 NEC 모델의 과제는 생체 내 정점 표면에서 발생하는 숙주-병원체 상호 작용에 대한 효과적인 연구를 허용하지 않는다는 것입니다. 장 투과성의 변화는 이러한 숙주-병원체 상호 작용 때문입니다. 투과성이 질병의 병태생리학적 기초에 어떻게 영향을 미치는지 더 잘 이해하려면 정점 표면을 치료하는 모델을 만들어야 합니다.
Co 등은 성숙한 BO 엔테로이드가 BMM 돔을 제거하고 배지5에 재현탁시킴으로써 정점 (AO) 형태를 형성하도록 유도 할 수 있음을 처음으로 입증했습니다. 이 기사는 AO enteroids가 올바른 상피 극성을 유지하고, 모든 장 세포 유형을 포함하고, 장 상피 장벽을지지하고, 정점 표면5에 대한 접근을 허용한다는 것을 입증했습니다. AO 엔테로이드를 NEC 모델로 사용하면 질병 과정의 생리학적 재현과 숙주-병원체 상호 작용에 대한 연구를 달성할 수 있습니다.
NEC의 병태생리학에 대한 한 가지 주요 기여는 증가된 장 투과성입니다6. 시험관내 7에서 장 투과성을 시험하는 방법으로 여러 분자가 제안되었습니다. 이들 중에서, 루시퍼 옐로우(LY)는 각각 428nm 및 540nm에서 여기 및 방출 피크를 갖는 친수성 염료이다(8). 모든 주요 paracellular 경로를 통과하기 때문에 혈액 뇌 및 장 상피 장벽 8,9를 포함한 다양한 응용 분야에서 paracellular 투과성을 평가하는 데 사용되었습니다. LY의 전통적인 적용은 반투과성 표면10 상의 단층으로 성장한 세포를 사용한다. LY는 정점 표면에 적용되고 세포 내 단단한 접합 단백질을 통과하여 기저측에 모입니다. 기저측 구획의 LY 농도가 높을수록 후속 장 상피 세포 장벽 파괴 및 투과성 증가와 함께 단단한 접합 단백질이 감소했음을 나타냅니다10. 또한 3D BO 엔터로이드 모델에서 설명되었으며, 여기서 LY가 미디어에 추가되고 개별 엔터로이드가 내강(11) 내로 LY의 흡수를 위해 이미징되었습니다. 이를 통해 LY 흡수의 시각화를 통한 정성 분석이 가능하지만 정량 분석은 제한적입니다. 이 프로토콜은 3D 방향을 유지하면서 AO 엔테로이드에서 체외 NEC 엔터로이드 모델을 사용하여 LY를 사용하여 세포내 투과성을 평가하는 고유한 기술을 설명합니다. 이 방법은 투과성의 정성 및 정량 분석 모두에 사용할 수 있습니다.
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Protocol
본 연구는 오클라호마 대학의 기관 검토 위원회 승인(IRB, #11610, 11611)에 따라 수행되었습니다. IRB 사양에 따라 인간 수술 표본을 수집하기 전에 부모의 동의가 필요했습니다. IRB 승인 및 부모의 동의에 따라 인간 소장 조직을 NEC 또는 장루 제거 또는 폐쇄증 수리와 같은 기타 장 절제술 수술을 받는 영아(샘플 수집 당시 36-41주 범위의 교정 재태 연령(GA), 모두 25-34주의 추정 GA, 2:1 M:F)로부터 얻었습니다. 엔테로이드는 공장 또는 회장에서 얻은 조직에서 생성되었습니다.
1. 인간 유아 유래 장내 배양: 전체 조직에서 음와균 분리 및 도금
- 이전 보고4에 따라 배양 배지, 킬레이트 완충액 #1 및 킬레이트 완충액 #2(표 1)를 준비합니다. 킬레이트 완충액을 4 ° C에 보관하고 48 시간 이내에 사용하십시오.
- 인간 미니거트 미디어를 준비합니다(표 1). 스톡을 -20 ° C에서 보관하고 사용하기 전에 37 ° C 수조에서 따뜻하게하십시오.
- 50% L-WRN 조절 배지(CM)를 준비합니다(표 1). 스톡을 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.
참고: 컨디셔닝된 배지에 대한 100% L-WRN 베이스는 Miyoshi et al.12의 프로토콜에 설명되어 있습니다. - 이전 보고서4에 따라 수술 표본에서 얻은 소장 조직 샘플에서 장내 생성 0.75-2.5g의 장 조직 조각에서 24 웰 플레이트에 4 개의 엔터 로이드 웰을 플레이트합니다.
참고: 엔테로이드는 4°C에서 최대 48시간 동안 50mL 원추형 튜브에 있는 30mL 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI) 1640 배지에 보관된 조직에서 성공적으로 생성될 수 있습니다. - 24-웰 플레이트를 37°C, 5%CO2 배양기에 거꾸로 놓고 15-20분 동안 거꾸로 놓아 BMM 돔4의 중합을 허용한다.
- 500μL의 50% L-WRN CM(단계 1.3에 설명된 대로)과 0.5μL의 Y-27632, ROCK 억제제(RI, 재료 표 참조)를 각 웰에 추가합니다. 2-3 일 후 RI가없는 50 % L-WRN CM으로 교체하십시오.
2. AO 엔테로이드 생성
- BMM에 내장 된 엔터 로이드를 50 % L-WRN CM4로 7-10 일 동안 성장시킵니다.
- 배지를 제거하고 500μL의 세포 회수 용액(CRS, 재료 표 참조)을 하나의 웰에 추가합니다. 돔을 긁어내고 피펫을 여러 번 위아래로 한 다음 CRS/엔터로이드/BMM 용액을 다음 웰에 추가합니다.
- 돔을 긁어 내고 피펫을 여러 번 위아래로 돌리고 용액을 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 두 번째 웰에 500μL의 CRS를 추가하고 위아래로 피펫을 한 다음 첫 번째 웰에 추가합니다. 이 용액을 동일한 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 2.3단계를 반복하여 모든 웰 내용물이 CRS에 들어갈 때까지 두 개의 웰을 하나의 마이크로 원심분리 튜브에 풀링합니다.
알림: 많은 양의 AO 엔터로이드를 생성하는 경우 두 개 이상의 웰을 하나의 더 큰 15mL 원추형 튜브에 모을 수 있습니다. 웰당 500μL CRS 비율을 유지하는 것은 BMM의 완전한 가용화를 보장하는 데 중요합니다. - 풀링된 CRS/엔테로이드/BMM 용액이 있는 미세 원심분리 튜브(단계 2.3)를 회전 장치에 4°C에서 1시간 동안 놓아 BMM을 가용화합니다.
- 용액을 200 x g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리한 다음 마이크로피펫으로 상층액을 제거하고 펠릿을 남깁니다.
- 엔테로이드 펠릿을 미세원심분리 튜브당 50% L-WRN CM(단계 1.3에서 제조된 대로)의 1mL에 재현탁시킨다. 재현탁된 엔테로이드/배지 용액 500μL를 초저 부착 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 부드럽게 피펫팅합니다( 재료 표 참조).
- 실험 전에 3일 동안 5%CO2 와 함께 37°C에서 배양한다.
3. 전체 마운트 면역 형광 염색을 통한 AO 장내 형태 확인
- 3일 동안 배지 현탁액에서 엔테로이드를 배양한 후, 한 웰에서 장내/배지 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브로 피펫팅합니다.
- 엔테로이드/배지 현탁액을 200 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 마이크로 피펫으로 상청액을 제거하십시오.
- 20 μL의 BMM에 엔테로이드를 재현탁시킨다. 10 μL의 장내 현탁액을 현미경 슬라이드에 피펫팅하고 약 1cm x 1cm 정사각형의 얇은 층에 펴 바릅니다. 동일한 슬라이드의 별도 부분에 나머지 10μL의 장내 현탁액을 반복하여 장형/BMM 현탁액이 두 번 번지도록 합니다.
- 엔테로이드/BMM 도말이 실온(RT)에서 15분 동안 응고되도록 합니다.
- 흄 후드에서 작업하면서 슬라이드를 염색 용기에 넣고 엔테로이드/BMM 도말이 덮일 때까지 4% 파라포름알데히드로 채웁니다(30슬라이드 용량의 유리 염색 용기를 사용하는 경우 한 슬라이드에 대해 ~10mL). 고정이 이루어질 때까지 30분(실온에서)을 기다립니다.
주의: 4% 파라포름알데히드는 위험하며 눈 손상/자극, 피부 자극 및 암을 유발할 수 있습니다. 사용할 때는 항상 흄 후드 아래에서 작업하십시오. 취급 시 보호 장갑과 개인 보호 장비를 착용하십시오. 승인된 폐기물 처리 용기에 폐기하십시오. - 4% 파라포름알데히드는 적절한 폐기물 용기에 버리십시오. 30mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 염색 용기에 추가하거나 PBS가 장형/BMM 도말기를 덮을 때까지 추가합니다. RT에서 3분 동안 그대로 둔 다음 PBS를 파라포름알데히드 폐기물 병에 버립니다. 이 단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척하십시오.
- 새 염색 병에 PBS로 희석한 0.5% 트리톤 X-100 30mL를 채웁니다. 장내 / BMM 도말이있는 슬라이드를 Triton 용액에 넣고 RT에서 20 분 동안 투과되도록합니다.
- PBS에 희석된 0.5% 트리톤 X-100은 폐기한다. 염색 용기에 PBS 30mL를 넣고 3분 동안 그대로 둡니다. 디캔팅하여 PBS를 폐기하십시오.
- 엔터로이드/BMM 도말 주위의 슬라이드를 부드럽게 닦고 방해하지 않도록 주의하십시오. 소수성 배리어 펜(배리어 PAP 펜, 재료 표 참조)을 사용하여 각 엔테로이드/BMM 도말 주위에 원을 그립니다. 2 차 항체가 제기 된 동물에 특이적인 20 % 혈청을 만듭니다 ( 재료 표 참조).
- 현미경 슬라이드를 실험실 벤치에 평평하게 놓습니다. 3.9단계의 특정 20% 혈청 100μL를 소수성 배리어 펜으로 링된 각각의 엔테로이드/BMM 도말 검사에 피펫팅하여 4°C에서 1시간 동안 슬라이드를 차단합니다.
- PBS에 희석된 β-카테닌 및 ZO-1 1차 항체를 각각 1:100 및 1:200으로 희석하여 100μL 용액을 준비합니다.
참고: 각 1차 항체는 이미징 시 뚜렷한 면역형광 채널을 갖도록 하기 위해 다른 동물의 항체여야 합니다. 본 연구는 마우스 β-카테닌 항체 및 토끼 ZO-1 항체를 이용한다( 재료 표 참조). - 카운터의 슬라이드를 탭하여 20% 세럼을 제거하고 엔테로이드/BMM 번짐을 방해하지 않도록 주의하면서 부드럽게 닦아냅니다. 100μL의 β-카테닌/ZO-1 1차 항체 용액을 엔테로이드/BMM 도말 중 하나에 피펫팅합니다. 1차 항체가 없는 PBS 100μL를 다른 장내/BMM 도말에 음성 대조군으로 피펫팅합니다.
- 플라스틱 용기의 바닥에 젖은 종이 타월을 깔아 가습 용기를 만듭니다. 슬라이드를 용기에 넣고 엔테로이드/BMM 얼룩을 덮고 있는 용액을 방해하지 않도록 주의하십시오. 밀봉할 용기에 뚜껑을 덮고 4°C에서 밤새 평평하게 보관합니다.
참고: 슬라이드가 마르지 않도록 하십시오. 건조를 방지하기 위해 용기가 닫혀 있는지 확인하십시오. - 계속 진행할 준비가 되면 카운터의 슬라이드를 탭하여 엔테로이드/BMM 도말에서 1차 항체와 PBS를 제거합니다.
- 슬라이드를 염색 용기에 넣고 30mL의 PBS로 채우거나 PBS가 장내 / BMM 도말을 덮을 때까지 세척 단계를 수행하십시오. 실온에서 3분 동안 그대로 두십시오. PBS를 폐기하고 이 단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척합니다.
- 두 개의 다른 면역형광 채널에 대해 200μL의 2차 항체를 준비하고, 각 항체는 PBS에서 1:1000 희석됩니다( 재료 표 참조). 용액을 빛으로부터 멀리하십시오.
- 100μL의 2차 항체 용액을 각 엔테로이드/BMM 도말에 피펫팅합니다. 어둠 속에 놓고 RT에서 1 시간 동안 그대로 두십시오.
- 카운터의 슬라이드를 탭하여 2차 항체를 제거합니다. 3.15 단계에서 설명한 세척 단계를 반복하여 모든 세척이 어두운 곳에서 수행되도록합니다.
- 각 엔터로이드/BMM 도말에 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI가 있는 플루오로쉴드, 재료 표 참조) 장착 매체를 한 방울 추가하고 커버슬립을 적용하여 두 도말이 적절하게 덮였는지 확인합니다. 커버 슬립 아래에 기포가 끼지 않도록하십시오. 현미경으로 볼 준비가 될 때까지 슬라이드를 어두운 곳에 두십시오.
참고: 슬라이드를 즉시 이미징하면 가장 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. 그러나 슬라이드는 4 ° C의 가습 용기에 평평하게 보관할 수 있으며 DAPI를 첨가 한 후 최대 1 주일 동안 이미징 할 수 있습니다.
4. 실험적 NEC의 유도
- AO 엔테로이드가 사용 전 최소 72시간 동안 현탁 상태에 있는지 확인하십시오.
- 각 웰의 모든 엔테로이드/배지 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브에 부드럽게 피펫팅합니다.
알림: 많은 양의 웰을 처리하는 경우 여러 웰을 하나의 15mL 원뿔형 튜브에 모을 수 있습니다. 이 프로토콜에는 치료 그룹당 최소 3개의 웰이 권장됩니다. - RT에서 3분 동안 300 x g 에서 원심분리하고 상청액을 제거한다.
- 웰당 500 μL의 50% LWRN CM에 5 mg/mL의 리포폴리사카라이드(LPS, 재료 표 참조) 10 μL를 추가합니다(최종 농도 100 μg/mL LPS).
- 처리군으로 지정된 AO 엔테로이드를 50% LWRN + LPS에 재현탁하고 500μL의 현탁액을 24웰 초저 부착 플레이트에 분취합니다. 미처리 대조군으로 지정된 AO 엔테로이드를 웰당 50% LWRN CM의 500μL에 재현탁시킨다. 이 현탁액 500 μL를 별도의 24-웰 초저 부착 플레이트에 분취한다.
- 제조업체의 지침에 따라 1% O2, 5%CO2 및 94%N2의 모듈식 인큐베이터 챔버(MIC)를 통해 LPS 처리된 AO 엔테로이드에서 저산소증을 유도합니다(재료 표 참조). 장내 저산소증과 LPS로 24 시간 동안 치료하십시오.
- 미처리 및 LPS+ 저산소증-처리된 배양물을 여전히 MIC 챔버 내에, 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 둔다.
5. LY를 이용한 세포투과성 측정
- 각 웰의 엔테로이드/배지 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브에 부드럽게 피펫팅합니다. 37 ° C 수조에서 DPBS와 50 % LRWN CM을 따뜻하게합니다.
- 장용/배지 현탁액을 RT에서 3분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.
- 미디어를 제거합니다. 따뜻한 500μL DPBS로 엔테로이드를 세척합니다.
- RT에서 300 x g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 마이크로 피펫으로 상청액을 제거하십시오.
- 5.3-5.4단계를 한 번 더 반복하여 총 두 번 반복합니다.
- 세척 후, 450 μL의 따뜻한 50% LWRN CM을 첨가한다(단계 1.3에서 제조됨).
- 각 웰에 2.5mg/mL LY 50μL(최종 농도는 0.25μg/μL, 재료 표 참조)를 넣고 부드럽게 소용돌이치며 혼합합니다. 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 2시간 동안 두었다.
- 각 웰의 엔테로이드/배지 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브에 부드럽게 피펫팅합니다.
- RT에서 300 x g 에서 3분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 엔터로이드 펠릿을 남깁니다.
- 500μL의 따뜻한 DPBS로 엔테로이드를 세척합니다.
- RT에서 300 x g 에서 3분 동안 원심분리한 다음 장내 펠릿을 남겨두고 상층액을 제거합니다.
- 5.10-5.11 단계를 세 번 더 반복하여 총 4 번 세척하십시오.
- 각 펠릿에 1,000μL의 차가운 DPBS를 재현탁하고 위아래로 격렬하게 피펫팅하여 엔테로이드를 해리시킵니다.
- DPBS(100 ng/mL; 50 ng/mL; 25 ng/mL; 12.5 ng/mL; 6.25 ng/mL; 3.13 ng/mL; 1.57 ng/mL; 0 ng/mL)로 희석한 LY 표준 곡선에 대한 표준물질을 준비합니다.
- 웰당 각 시료 150μL를 96웰 플레이트에 삼중으로 피펫팅합니다.
- 형광을 읽을 수 있는 플레이트 리더에서 428nm의 여기 피크와 536nm의 방출 피크에서 형광을 측정합니다( 재료 표 참조). 통계 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 표준 곡선을 보간하고 4-모수 곡선을 사용하여 농도를 계산합니다.
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Representative Results
AO 형태
50% LWRN 배지에 72시간 동안 현탁된 엔테로이드는 AO 형태를 가정합니다(그림 1). 이것은 정점 단백질, zonula occludens-1 (ZO-1) 및 기저측 단백질 β- 카테닌의 장내 전체 마운트를 활용 한 면역 형광 염색을 통해 확인되었습니다 (그림 1). AO 엔테로이드는 엔테로이드의 바깥쪽 정점 표면에 ZO-1(녹색)을 나타내는 반면 β-카테닌(빨간색)은 내부 기저측 표면에 있습니다(그림 1A). BO 엔테로이드는 외부 표면에 β-카테닌(빨간색)이 있고 내부 내강 표면에 ZO-1(녹색)이 있는 역을 보여줍니다(그림 1B). 이 결과는 실험 전에 엔테로이드가 AO임을 확인하기 위해 예상되는 극성 반전을 보여줍니다.
LY 분석 결과
장내 내강으로의 LY 염료 흡수 증가로 입증 된 증가 된 투과성은 NEC6에서 예상됩니다. LPS 및 저산소증으로 처리된 BO 엔테로이드는 이 프로토콜에 설명된 기술을 사용하여 처리되지 않은 대조군에 비해 유의하게 증가된 투과성을 보였다(도 2A, **p=0.005). 이것은 NEC 4,13의 BO 엔테로이드 모델에서 증가된 투과성을 설명한 문헌과 일치합니다. 유사하게, LPS 및 저산소증으로 치료된 AO 엔테로이드는 NEC 모델에서 예상한 바와 같이 처리되지 않은 대조군에 비해 유의하게 증가된 투과성을 입증했습니다(그림 3A, *p = 0.02). 처리된 AO 엔테로이드는 처리되지 않은 대조군(그림 3B)에 비해 처리된 엔테로이드의 내강에서 LY 흡수가 증가한 것으로 나타났습니다(그림 3B). 이는 BO 엔터로이드에서 볼 수 있는 것과 유사하며, 여기서 LY는 엔터로이드 내강에서 시각화됩니다(그림 2B). 엔테로이드 내강에서 LY 염료 흡수가 증가하면 처리된 엔테로이드의 형광이 증가하여 다양한 웰의 AO 엔테로이드를 활용하는 마이크로플레이트 리더를 통해 정량 분석이 가능합니다(그림 3A). 이는 LY를 활용한 이 기술을 사용하여 3D 엔테로이드의 투과성을 평가할 수 있음을 보여줍니다. 결과는 치료 그룹의 LY 농도를 결정하기 위해 표준 곡선을 보간할 수 있는 통계 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다. 그림 2와 그림 3에서 볼 수 있듯이 스튜던트 t-검정을 사용하여 그룹 간의 유의성을 확인할 수 있습니다.
그림 1: AO 형태 확인. (A) 역 극성을 나타내는 정점 (AO) 엔터로이드는 20배 배율에서 기존 극성을 나타내는 기저측 아웃(BO) 엔테로이드, 스케일 바는 100μm로 설정됩니다. DAPI, 파란색; 베타 - 카테닌 (기저 측 단백질), 적색; 조눌라 폐색 -1 (정점 단백질), 녹색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: LY 분석으로 측정한 시험관 내 NEC 유도 후 BO 엔터로이드 모델에서 증가된 투과성. (A) LPS 및 저산소증으로 처리된 기저측-아웃 엔테로이드는 루시퍼 옐로우 분석을 사용하는 미처리 대조군에 비해 투과성이 유의하게 증가하였다; 오차 막대는 평균의 표준 오차를 보여줍니다. **p = 0.005. (B) 10x 배율, 300μm 스케일 바에서 루시퍼 옐로우 염료로 배지를 처리한 후 루멘에서 시각화된 루시퍼 옐로우가 있는 기저측외 엔테로이드의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: LY 분석으로 측정한 시험관 내 NEC 유도 후 AO 엔터로이드 모델에서 증가된 투과성. (a) LPS 및 저산소증-처리된 정점-아웃 엔테로이드는 루시퍼 옐로우 분석을 사용하는 미처리 대조군에 비해 유의하게 증가된 투과성을 가짐; 오차 막대는 평균의 표준 오차를 보여줍니다. *p = 0.02. (b) 10x에서 처리되지 않은 대조군 정점 (AO) 엔테로이드의 대표 이미지; 스케일 바는 100 μm로 설정됩니다. (C) LY를 사용한 LPS 및 저산소증 치료 AO 엔터 로이드의 대표 이미지는 10x에서 루멘으로 시각화됩니다. 스케일 바는 100 μm로 설정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 본 연구에 사용된 용액, 완충액 및 배지의 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
장 투과성은 복잡하고 상피 장벽 기능을 반영합니다. 장 장벽은 세포횡단 및 세포주위 수송(14)을 매개하는 상피 세포의 단일층을 포함한다. 세포부투과성은 상피 세포(14) 사이의 공간을 밀봉하는 단단한 접합 단백질에 의존한다. 이 초세포 수송 내에는 분자가 교차할 수 있는 세 가지 뚜렷한 경로가 있습니다: 기공, 누출 및 무제한15. 공극 경로는 작은 하전 이온에 대한 투과성을 허용하는 반면, 누출 경로는15에 걸쳐 더 크고 하전되지 않은 분자를 허용합니다. 세 번째, 제한되지 않은 경로는 상피 손상 또는 사망에 이차적 인 투과성을 반영합니다16. 많은 분자가 세포 투과성을 평가하는 데 사용되지만 분자의 유형과 크기는 조사 할 투과성 경로에 영향을 미칩니다.
작고 친수성 분자인 LY는 세 가지 세포주기 경로를 모두 통과할 수 있어 세포간 투과성을 연구하는 데 최적의 도구입니다. 대조적으로, 세포 투과성의 마커로 사용되는 당 분자 인 4kDa FITC- 덱스 트란은 누출 및 제한되지 않은 경로 만 통과 할 수 있습니다. 더 큰 70kDa FITC-덱스트란은 제한되지 않은 경로로만 제한됩니다. 세포 투과성을 결정하는 또 다른 방법은 단층에 걸친 전기 저항을 측정하는 경상피 저항 측정(TEER)을 사용하는 것입니다. 이 방법은 공극 경로(17)만을 측정합니다. 따라서 LY는 세 가지 경로 모두를 표적으로 하여 전체 세포 투과성에 대한 더 큰 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 LY를 사용하여 세포 투과성을 연구함으로써이를 활용합니다.
엔테로이드 모델은 연구할 3D 소장을 만들어 생체 내 조건을 보다 가깝게 모방하기 때문에 이 프로토콜에서 선택되었습니다. 그러나 전통적인 BO 엔테로이드 모델의 과제는 숙주-병원체 상호 작용 및 후속 투과성 변화를 연구하기 위해 정점 표면에 접근하는 방법입니다. AO 엔테로이드 모델은 정점 표면이 주변 매체와 접촉하는 극성을 반전시켜 이러한 문제를 극복합니다. 엔테로이드의 정점 표면에 접근하는 몇 가지 대체 방법이 설명되었습니다. 여기에는 장 칩 시스템, 미세 주입, 단편화 및 단층18,19의 엔터로이드 성장이 포함됩니다. 장 칩 시스템의 발전은 혈관 및 연동 운동의 맥락에서 오가노이드와 내피 세포를 함께 배양하여 장 환경을 모방 할 수있게했습니다18. 미세주입은 마이크로매니퓰레이터 및 마이크로인젝터(19)와 같은 특수 장비의 사용을 통해 BO 장내내로의 주입을 포함한다. 단편화는 엔테로이드를 단일 세포로 해리시킨 다음 3D 구조를 개질하기 전에 병원체와 함께 배지에서 배양하는 것을 사용합니다(19). 정점 표면의 후속 처리와 함께 2D 단층으로 엔테로이드의 변형도 설명되었습니다19. AO 엔터로이드 모델은 값비싼 장비를 요구하거나 엔터로이드의 구조적 무결성을 손상시키지 않으면서 정점 표면을 노출하는 간단하고 효과적인 방법을 제공하여 이러한 모델의 일부 어려움을 해결합니다.
AO 모델에서 LY를 사용하면 숙주-병원체 상호 작용에 이차적인 초세포 투과성에 대한 광범위한 연구가 가능하지만 이 프로토콜은 LY 대신 FITC-덱스트란뿐만 아니라 BO 엔테로이드와 함께 사용하도록 조정할 수 있습니다. BO 엔터로이드에 사용하도록 수정하려면 이 프로토콜에 대한 두 가지 주요 변경 사항이 필요합니다. 첫째, BO 엔테로이드는 LY 첨가 전후의 모든 세척 단계에 대해 BMM 돔에서 유지될 수 있다. BMM 돔의 가용화를 방지하기 위해 이러한 세척 단계에서 37°C로 가온된 용액을 사용하는 것이 중요합니다. 둘째, BMM 돔은 차가운 DPBS로 중단되고 모든 세척 단계가 완료된 후 피펫 팁으로 우물을 긁어 해리 된 장내 및 LY의 완전한 재현탁을 허용해야합니다. FITC-덱스트란이 LY를 대체하는 경우 4kDa 분자가 3개의 세포외 경로 중 2개를 통과하므로 사용하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜의 핵심 단계에는 엔테로이드 외부의 용액에서 미량 LY를 제거하기 위해 적절한 세척을 보장하는 것이 포함됩니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 정량할 준비가 될 때까지 내강에서 주변 용액으로 LIY가 해리되고 잠재적으로 방출되는 것을 방지하기 위해 장내로이드를 부드럽게 세척하는 것도 중요합니다. 세척 단계에서 데온 용액을 사용하면 장내 응력도 감소합니다. 차가운 용액을 사용하면 엔터 로이드가 세포 사멸을 겪어 부정확 한 결과를 초래할 수 있습니다.
이 방법의 한계는 AO 엔테로이드를 전파할 수 없고 극성을 역전시키는 데 추가로 72시간이 필요하기 때문에 배양 시간이 길다는 것입니다. 또한 대조군에 비해 치료된 AO 장내 수가 2%-5% 감소합니다. 이것은 전반적으로 무시할 수 있지만 결과를 과소 평가할 수 있습니다. LY 사용의 한계는 4kDa FITC-덱스트란과 같은 다른 투과성 분자와 유사하며, 여기서 미량은 transcytosis20을 통해 장 상피 장벽을 통과할 수 있습니다. 이 양은 무시할 수 있지만 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 결과를 바탕으로 AO 엔테로이드의 배지에 LY를 적용하면 3D 모델에서 반세포 장 투과성을 정량적 및 정성적으로 분석하는 우아하고 비교적 간단한 방법을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이 기사에서 논의된 제품이나 개념에 대해 독점적 또는 상업적 관심을 보고하지 않습니다.
Acknowledgments
로체스터 대학 의료 센터의 Ashley Nelson에게 엔터 로이드 모델에 대한 그녀의 도구 적 도움에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트를 지원해 주신 오클라호마 대학교 소아외과에도 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 [NIH Grant R03 DK117216-01A1], 오클라호마 성인 줄기 세포 연구 센터 및 장로교 건강 재단 보조금 # 20180587의 지원을 받아 오클라호마 대학 건강 과학 센터의 외과에 수여되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
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