Summary
Denne protokollen skisserer en metode som benytter lucifer gul i en apikal-ut enteroid modell for å bestemme intestinal permeabilitet. Denne metoden kan brukes til å bestemme paracellulær permeabilitet i enteroider som modellerer inflammatoriske tarmsykdommer som nekrotiserende enterocolitt.
Abstract
Enteroider er et fremvoksende forskningsverktøy i studiet av inflammatoriske tarmsykdommer som nekrotiserende enterokolitt (NEC). De dyrkes tradisjonelt i den basolaterale ut (BO) konformasjonen, hvor den apikale overflaten av epitelcellen vender mot det indre lumen. I denne modellen er tilgang til den luminale overflaten av enteroider for behandling og eksperimentering utfordrende, noe som begrenser evnen til å studere vertspatogeninteraksjoner. For å omgå dette ble det opprettet en neonatal apikal-ut (AO) modell for nekrotiserende enterokolitt. Siden endringer i tarmepitelcellepermeabilitet er patognomoniske for NEC, skisserer denne protokollen ved bruk av lucifergul (LY) som markør for paracellulær permeabilitet. LY krysser tarmepitelbarrieren via alle de tre store paracellulære banene: pore, lekkasje og ubegrenset. Bruk av LY i en AO-modell gir mulighet for en bredere studie av permeabilitet i NEC. Etter IRB-godkjenning og foreldrenes samtykke ble kirurgiske prøver av tarmvev samlet inn fra humane premature nyfødte. Intestinale stamceller ble høstet via kryptisolasjon og brukt til å dyrke enteroider. Enteroider ble dyrket til modenhet og deretter transformert AO eller igjen i BO-konformasjon. Disse ble enten ikke behandlet (kontroll) eller ble behandlet med lipopolysakkarid (LPS) og utsatt for hypoksiske tilstander for induksjon av in vitro NEC. LY ble brukt til å vurdere permeabilitet. Immunfluorescerende farging av apikalproteinet zonula occludens-1 og basolateralt protein β-catenin bekreftet AO-konformasjon. Både AO- og BO-enteroider behandlet med LPS og hypoksi viste signifikant økt paracellulær permeabilitet sammenlignet med kontroller. Både AO- og BO-enteroider viste økt opptak av LY i lumen til de behandlede enteroidene sammenlignet med kontroller. Utnyttelsen av LY i en AO-enteroidmodell muliggjør undersøkelse av alle tre hovedveiene for paracellulær permeabilitet. Det tillater i tillegg undersøkelse av vertspatogeninteraksjoner og hvordan dette kan påvirke permeabiliteten sammenlignet med BO-enteroidmodellen.
Introduction
Enteroider er tredimensjonale (3D) strukturer avledet fra organbegrensede humane tarmstamceller 1,2. De består utelukkende av epitelavstamning og inneholder alle de differensierte tarmepitelcelletypene2. Enteroider opprettholder også cellulær polaritet som består av en apikal luminal overflate som danner et indre rom og en basolateral overflate som vender mot de omkringliggende mediene. Enteroider er en unik modell ved at de bevarer egenskapene til verten som deble generert 3. Dermed representerer enteroider generert fra premature menneskelige spedbarn en modell som er nyttig for å undersøke sykdommer som primært påvirker denne befolkningen, for eksempel nekrotiserende enterokulitt (NEC).
Den tradisjonelle enteroidmodellen dyrkes i en basolateral ut (BO) konformasjon, hvor enteroiden er innkapslet i en kuppel av kjellermembranmatrise (BMM). BMM induserer enteroiden for å opprettholde en 3D-struktur med den basolaterale overflaten på utsiden. BO enteroider er en egnet modell for NEC som bygger bro over gapet mellom todimensjonale (2D) primære humane cellelinjer og in vivo dyremodeller 2,4. NEC induseres i enteroider ved å plassere patogener som LPS eller bakterier i media rundt enteroider, etterfulgt av eksponering for hypoksiske forhold 2,3. Utfordringen med BO enteroid NEC-modellen er at den ikke tillater effektiv studie av vertspatogeninteraksjoner, som forekommer på den apikale overflaten in vivo. Endringer i intestinal permeabilitet skyldes disse vertspatogeninteraksjonene. For bedre å forstå hvordan permeabilitet påvirker det patofysiologiske grunnlaget for sykdom, må det opprettes en modell som innebærer behandling av den apikale overflaten.
Co og medarbeidere var de første som demonstrerte at modne BO-enteroider kan induseres til å danne en apikal-ut (AO) konformasjon ved å fjerne BMM-kuplene og resuspendere dem i media5. Denne artikkelen viste at AO-enteroider opprettholdt riktig epitelpolaritet, inneholdt alle tarmcelletyper, opprettholdt tarmepitelbarrieren og tillot tilgang til den apikale overflaten5. Ved å bruke AO-enteroider som en NEC-modell oppnår man en fysiologisk reproduksjon av sykdomsprosessen og studiet av vertspatogeninteraksjoner.
En viktig bidragsyter til patofysiologien til NEC er økt intestinal permeabilitet6. Flere molekyler har blitt foreslått som en måte å teste for intestinal permeabilitet in vitro7. Blant disse er lucifergult (LY) et hydrofilt fargestoff med eksitasjons- og utslippstopper på henholdsvis428 nm og 540 nm 8. Når den krysser gjennom alle de store paracellulære veiene, har den blitt brukt til å evaluere paracellulær permeabilitet i ulike applikasjoner, inkludert blod-hjerne- og tarmepitelbarrierer 8,9. Den tradisjonelle anvendelsen av LY bruker celler dyrket i monolag på en halvgjennomtrengelig overflate10. LY påføres den apikale overflaten og krysser gjennom paracellulære tette kryssproteiner for å samles på basolateral side. Høyere LY-konsentrasjoner i det basolaterale rommet indikerer reduserte tette koblingsproteiner med påfølgende nedbrytning av tarmepitelcellebarrierer og økt permeabilitet10. Det har også blitt beskrevet i 3D BO enteroidmodeller hvor LY ble lagt til media og individuelle enteroider ble avbildet for opptak av LY i lumen11. Selv om dette muliggjør kvalitativ analyse via visualisering av LY-opptak, er kvantitativ analyse begrenset. Denne protokollen skisserer en unik teknikk som bruker LY til å vurdere paracellulær permeabilitet ved hjelp av en in vitro NEC enteroidmodell i AO-enteroider samtidig som 3D-orientering opprettholdes. Denne metoden kan brukes til både kvalitativ og kvantitativ analyse av permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nåværende forskningen ble utført i samsvar med Institutional Review Board godkjenning (IRB, # 11610, 11611) ved University of Oklahoma. Foreldres samtykke var nødvendig før innsamling av menneskelige kirurgiske prøver i henhold til IRB-spesifikasjoner. Etter IRB-godkjenning og foreldrenes samtykke ble humant tarmvev innhentet fra spedbarn (korrigert svangerskapsalder (GA) fra 36-41 uker på tidspunktet for prøveinnsamling, alle med en historie med for tidlig fødsel ved en estimert GA på 25-34 uker, 2: 1 M: F) gjennomgår kirurgi for NEC eller annen intestinal reseksjon, for eksempel stomiopptak eller atresireparasjon. Enteroider ble generert fra vev oppnådd fra enten jejunum eller ileum.
1. Humane spedbarnsavledede enteroidkulturer: kryptisolering og plating fra hele vev
- Forbered kulturmedier, chelaterende buffer #1 og chelateringsbuffer #2 (tabell 1) etter forrige rapport4. Oppbevar chelateringsbuffere ved 4 °C og bruk dem innen 48 timer.
- Forbered humane minigutmedier (tabell 1). Oppbevar stamløsningen ved −20 °C og varm i et vannbad på 37 °C før bruk.
- Klargjør 50 % L-WRN-kondisjonerte medier (CM) (tabell 1). Oppbevar lageret ved 4 °C i opptil 1 uke.
MERK: 100% L-WRN base for betinget media er beskrevet i en protokoll av Miyoshi et al.12. - Generer enteroider fra små tarmvevsprøver hentet fra kirurgiske prøver etter forrige rapport4. Plate fire brønner av enteroider i en 24-brønnplate fra et 0,75-2,5 g stykke tarmvev.
MERK: Enteroider kan med hell genereres fra vev lagret i 30 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium i et 50 ml konisk rør ved 4 ° C i opptil 48 timer. - Plasser 24-brønnsplaten i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator opp-ned i 15-20 minutter for å tillate polymerisering av BMM-kupler4.
- Tilsett 500 μL 50 % L-WRN CM (som beskrevet i trinn 1.3) med 0,5 μL Y-27632, ROCK-hemmer (RI, se Materialtabell) til hver brønn. Etter 2-3 dager, erstatt med 50% L-WRN CM uten RI.
2. Generering av AO-enteroider
- Dyrk enteroider innebygd i BMM i 7-10 dager med 50% L-WRNCM 4.
- Fjern mediet og tilsett 500 μL cellegjenvinningsløsning (CRS, se Materialfortegnelse) i én brønn. Skrap kuppelen, pipetten opp og ned flere ganger, og tilsett deretter CRS/enteroid/BMM-løsningen i neste brønn.
- Skrap kuppelen, pipette opp og ned flere ganger, og legg løsningen i et mikrosentrifugerør. Tilsett 500 μL CRS til den andre brønnen, pipett opp og ned, og legg den deretter til den første brønnen. Overfør denne løsningen til det samme 1,5 ml mikrosentrifugerøret.
- Gjenta trinn 2.3, samle to brønner i ett mikrosentrifugerør til alt brønninnholdet er i CRS.
MERK: Mer enn to brønner kan samles i ett større 15 ml konisk rør hvis det genererer store mengder AO-enteroider. Å opprettholde et CRS-forhold på 500 μL per brønn er viktig for å sikre fullstendig oppløselighet av BMM. - Plasser mikrosentrifugerørene (trinn 2.3) med samlet CRS / enteroid / BMM-løsning på en rotator i 1 time ved 4 ° C for å oppløse BMM.
- Sentrifuge oppløsningen ved 200 x g i 3 minutter ved 4 °C, fjern deretter supernatant med en mikropipette, og la pelleten ligge igjen.
- Resuspender enteroidpelleten i 1 ml 50 % L-WRN CM (som fremstilt i trinn 1,3) i mikrosentrifugerør. Pipetter forsiktig 500 μL av den resuspenderte enteroid-/medieoppløsningen inn i hver brønn i de ultralave festeplatene med 24 brønner (se materialfortegnelse).
- Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 i 3 dager før eksperimentering.
3. Verifisering av AO enteroid konformasjon via helmontert immunfluorescerende farging
- Etter inkubasjon av enteroidene i mediesuspensjon i 3 dager, pipetter enteroid/mediesuspensjonen fra en brønn inn i et mikrosentrifugerør.
- Sentrifuge enteroid/mediesuspensjon ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten med en mikropipette.
- Resuspender enteroider i 20 μL BMM. Pipette 10 μL enteroid suspensjon på et mikroskop lysbilde og spre den i et tynt lag ca 1 cm x 1 cm kvadrat. Gjenta med de resterende 10 μL enteroidsuspensjon på en separat del av samme lysbilde, slik at det er to flekker av enteroid / BMM suspensjon.
- La enteroid/BMM-utstryk stivne ved romtemperatur (RT) i 15 minutter.
- Arbeid i avtrekkshetten, plasser lysbildet i en fargekanne og fyll med 4% paraformaldehyd til det dekker enteroid / BMM-smøret (~ 30 ml for ett lysbilde hvis du bruker en glassfarget krukke med 10 lysbildekapasitet). Tillat 30 minutter (ved romtemperatur) for fiksering å finne sted.
FORSIKTIG: 4% paraformaldehyd er farlig og kan forårsake øyeskader / irritasjon, hudirritasjon og kreft. Arbeid alltid under en avtrekksvifte når du bruker den. Bruk vernehansker og personlig verneutstyr når du håndterer det. Kast den i en godkjent avfallsbeholder. - Kast 4% paraformaldehyd i en passende avfallsbeholder. Tilsett 30 ml fosfatbufret saltvann (PBS) i fargekrukken eller til PBS dekker enteroid/BMM-utstrykene. La det sitte i 3 minutter på RT, og kast deretter PBS i paraformaldehyd avfallsflasken. Gjenta dette trinnet to ganger til for totalt tre vasker.
- Fyll en ny fargekanne med 30 ml 0,5% Triton X-100 fortynnet i PBS. Plasser lysbildet med enteroid/BMM-utstryk i Triton-løsningen og la det permeabilisere i 20 min ved RT.
- Kast 0,5% Triton X-100 fortynnet i PBS. Tilsett 30 ml PBS i fargekannen og la den sitte i 3 min. Kast PBS ved dekantering.
- Tørk forsiktig lysbildet rundt enteroid / BMM-smørene, vær forsiktig så du ikke forstyrrer dem. Bruk en hydrofob barrierepenn (barriere PAP penn, se Materialfortegnelse) til å tegne en sirkel rundt hver av enteroid-/BMM-utstrykene. Lag et 20% serum, spesifikt for dyret der det sekundære antistoffet ble hevet (se Tabell over materialer).
- Legg mikroskopet flatt på laboratoriebenken. Blokker lysbildet i 1 time ved 4 °C ved pipettering av 100 μL spesifikt 20 % serum fra trinn 3,9 på hver av enteroid-/BMM-utstrykene som omringes av den hydrofobe barrierepennen.
- Forbered en 100 μL-løsning med henholdsvis 1:100 og 1:200 fortynninger av β-catenin- og ZO-1 primære antistoffer fortynnet i PBS.
MERK: Hvert primære antistoff må være fra et annet dyr for å sikre at de vil ha forskjellige immunfluorescerende kanaler når de avbildes. Denne studien benytter et mus β-catenin antistoff og en kanin ZO-1 antistoff (se tabell over materialer). - Trykk på lysbildet på telleren for å fjerne 20% serum og tørk forsiktig tørt, vær forsiktig så du ikke forstyrrer enteroid / BMM-utstrykene. Pipette 100 μL β-catenin/ZO-1 primær antistoffløsning på en av enteroid/BMM-utstrykene. Pipette 100 μL PBS uten primært antistoff på den andre enteroid/BMM-utstryk som negativ kontroll.
- Kle bunnen av en plastbeholder med et vått papirhåndkle for å lage en fuktet beholder. Plasser lysbildet i beholderen, vær forsiktig så du ikke forstyrrer løsninger som dekker enteroid / BMM-utstryk. Plasser lokket på beholderen for å forsegle, og oppbevar flatt ved 4 °C over natten.
MERK: Ikke la lysbildet tørke ut. Forsikre deg om at beholderen er lukket for å unngå uttørking. - Når du er klar til å fortsette, trykk på lysbildet på telleren for å fjerne primære antistoffer og PBS fra enteroid / BMM-utstryk.
- Utfør et vasketrinn ved å plassere lysbildet i en fargekanne og fylle med 30 ml PBS eller til PBS dekker enteroid / BMM-smører. La det sitte i 3 min ved romtemperatur. Kast PBS og gjenta dette trinnet to ganger til i totalt tre vasker.
- Forbered 200 μL sekundære antistoffer for to forskjellige immunfluorescerende kanaler, hvor hvert antistoff har en fortynning på 1:1000 i PBS (se materialtabell). Hold løsningen borte fra lys.
- Pipette 100 μL sekundær antistoffoppløsning på hver av enteroid/BMM-utstrykene. Plasser den i mørket og la den sitte i 1 time ved RT.
- Trykk på lysbildet på telleren for å fjerne sekundære antistoffer. Gjenta vasketrinnene som er beskrevet i trinn 3.15, og sørg for at alle vasker utføres i mørket.
- Legg til en dråpe 4',6-diamidino-2-fenylindol (Fluoroshield med DAPI, se Materialtabell) monteringsmedium til hver av enteroid / BMM-smørene og påfør en deksel for å sikre at begge smørene er tilstrekkelig dekket. Unngå å fange bobler under dekselet. Hold lysbildet i mørket til det er klart til visning under mikroskopet.
MERK: Umiddelbar avbildning av lysbildene gir de mest optimale resultatene; Lysbilder kan imidlertid oppbevares flatt i en fuktet beholder ved 4 °C og avbildes i opptil 1 uke etter tilsetning av DAPI.
4. Induksjon av eksperimentell NEC
- Forsikre deg om at AO-enteroider har vært i suspensjon i minst 72 timer før bruk.
- Pipetter forsiktig all enteroid/mediesuspensjon fra hver brønn inn i et mikrosentrifugerør.
MERK: Flere brønner kan samles i ett 15 ml konisk rør hvis et stort volum brønner behandles. Minimum tre brønner per behandlingsgruppe anbefales for denne protokollen. - Sentrifuge ved 300 x g i 3 minutter ved RT og fjern supernatanten.
- Tilsett 10 μL 5 mg/ml lipopolysakkarid (LPS, se materialfortegnelse) til 500 μL 50 % LWRN CM per brønn (endelig konsentrasjon 100 μg/ml LPS).
- Resuspend AO enteroider utpekt som behandlingsgruppe i 50% LWRN + LPS og aliquot 500 μL suspensjon til en 24-brønns ultra-lav festeplate. Resuspend AO enteroider betegnet som ubehandlede kontroller i 500 μL på 50% LWRN CM per brønn. Aliquot 500 μL av denne fjæringen til en separat 24-brønns ultra-lav festeplate.
- Induser hypoksi i LPS-behandlede AO-enteroider via et modulært inkubatorkammer (MIC) med 1% O 2, 5% CO 2 og 94% N 2 i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell). Behandle enteroider med hypoksi og LPS i 24 timer.
- Plasser de ubehandlede og LPS + hypoksibehandlede kulturene, fortsatt i MIC-kammeret, i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 24 timer.
5. Måling av paracellulær permeabilitet ved bruk av LY
- Pipetter forsiktig enteroid/mediesuspensjonen fra hver brønn inn i et mikrosentrifugerør. Varm DPBS og 50 % LRWN CM i et vannbad på 37 °C.
- Sentrifuge enteroid/media suspensjon ved 300 x g i 3 min ved RT.
- Fjern mediet. Vask enteroidene med varm 500 μL DPBS.
- Sentrifuge ved 300 x g i 3 min ved RT. Fjern supernatanten med en mikropipette.
- Gjenta trinn 5,3–5,4 én gang til totalt to ganger.
- Etter vask tilsettes 450 μL varm 50 % LWRN CM (tilberedt i trinn 1.3).
- Tilsett 50 μL 2,5 mg/ml LY (endelig konsentrasjon er 0,25 μg/μL, se Materialtabell) til hver brønn og virvle forsiktig for å blande. Plasser i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator i2 timer.
- Pipetter forsiktig enteroid/mediesuspensjonen fra hver brønn inn i et mikrosentrifugerør.
- Sentrifuge ved 300 x g i 3 minutter ved RT, fjern deretter supernatanten, og la enteroidpelleten ligge igjen.
- Vask enteroidene med 500 μL varm DPBS.
- Sentrifuge ved 300 x g i 3 minutter ved RT, og fjern deretter supernatanten som forlater enteroidpelleten bak.
- Gjenta trinn 5.10-5.11 tre ganger til i totalt fire vasker.
- Resuspender hver pellets med 1000 μL kald DPBS og pipetter kraftig opp og ned for å dissosiere enteroidene.
- Utarbeide standarder for LY-standardkurven fortynnet i DPBS (100 ng / ml; 50 ng / ml; 25 ng / ml; 12,5 ng / ml; 6,25 ng / ml; 3,13 ng / ml; 1,57 ng / ml; 0 ng / ml).
- Pipette 150 μL av hver prøve per brønn i tre eksemplarer på en 96-brønns plate.
- Mål fluorescensen ved en eksitasjonstopp på 428 nm og utslippstopp på 536 nm på en plateleser som er i stand til å lese fluorescens (se materialfortegnelse). Ved hjelp av statistisk programvare (se Materialtabell) beregner du konsentrasjonene ved å interpolere standardkurven og bruke en fireparameterkurve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AO-konformasjon
Enteroider suspendert i 50 % LWRN-medier i 72 timer antar en AO-konformasjon (figur 1). Dette ble bekreftet via immunfluorescerende farging ved bruk av enteroide hele fester av apikalt protein, zonula occludens-1 (ZO-1) og basolateralt protein, β-catenin (figur 1). AO-enteroider viser ZO-1 (grønn) på den ytre, apikale overflaten av enteroiden, mens β-catenin (rød) er på den indre, basolaterale overflaten (figur 1A). BO-enteroider demonstrerer det inverse med β-catenin (rødt) på ytre overflaten og ZO-1 (grønt) på den indre, luminale overflaten (figur 1B). Disse resultatene viser forventet polaritetsreversering for å bekrefte at enteroidene er AO før eksperimentering.
LY-analyseresultater
Økt permeabilitet, demonstrert ved økt opptak av LY-fargestoff i enteroid lumen, forventes i NEC6. BO-enteroider behandlet med LPS og hypoksi viste signifikant økt permeabilitet sammenlignet med ubehandlede kontroller ved bruk av teknikken beskrevet i denne protokollen (figur 2A, **p = 0,005). Dette stemmer overens med litteraturen som har beskrevet økt permeabilitet i BO enteroidmodeller av NEC 4,13. Tilsvarende viste AO-enteroider behandlet med LPS og hypoksi også signifikant økt permeabilitet sammenlignet med ubehandlede kontroller, som forventet i en NEC-modell (figur 3A, *p = 0,02). Behandlede AO-enteroider viste økt opptak av LY i lumen hos behandlede enteroider (figur 3C) sammenlignet med ubehandlede kontroller (figur 3B). Dette ligner på det som ses i BO-enteroider, hvor LY visualiseres i enteroidlumen (figur 2B). Økt LY-fargeopptak i lumen i enteroiden resulterer i økt fluorescens i behandlede enteroider, noe som muliggjør kvantitativ analyse via en mikroplateleser som bruker AO-enteroider fra forskjellige brønner (figur 3A). Dette viser at denne teknikken, ved hjelp av LY, kan brukes til å vurdere permeabilitet i 3D-enteroider. Resultatene kan analyseres ved hjelp av statistisk programvare som er i stand til å interpolere en standardkurve for å bestemme LY-konsentrasjonene i behandlingsgruppene. En Student t-test, som vist i figur 2 og figur 3, kan brukes til å bestemme signifikansen mellom grupper.
Figur 1: Verifikasjon av AO-konformasjon . (A) Apical-out (AO) enteroid som viser omvendt polaritet sammenlignet med (B) basolateral ut (BO) enteroid som viser tradisjonell polaritet ved 20x forstørrelse, skalalinje satt til 100 μm. DAPI, blå; beta-catenin (basolateralt protein), rød; zonula occludens-1 (apikalt protein), grønn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Økt permeabilitet i en BO enteroidmodell etter in vitro NEC-induksjon målt ved en LY-analyse. (A) LPS og hypoksibehandlede basolaterale enteroider har betydelig økt permeabilitet sammenlignet med ubehandlede kontroller ved bruk av lucifergul analyse; feilfelt viser standardfeilen til gjennomsnittet; **p = 0,005. (B) Bilde av basolaterale enteroider med lucifergul visualisert i lumen etter behandling av mediet med lucifergult fargestoff ved 10x forstørrelse, 300 μm skala bar. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Økt permeabilitet i en AO enteroidmodell etter in vitro NEC-induksjon målt ved en LY-analyse. (A) LPS og hypoksibehandlede apikale enteroider har betydelig økt permeabilitet sammenlignet med ubehandlede kontroller ved bruk av lucifergul analyse; feilfelt viser standardfeilen til gjennomsnittet; *p = 0,02. (B) Et representativt bilde av ubehandlet kontroll apikal-ut (AO) enteroid ved 10x; skalalinjen er satt til 100 μm. (C) Et representativt bilde av en LPS- og hypoksibehandlet AO-enteroid med LY visualiseres i lumen ved 10x; Skalalinjen er satt til 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Sammensetning av løsninger, buffere og medier brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intestinal permeabilitet er kompleks og reflekterer epitelbarrierefunksjon. Tarmbarrieren består av et enkelt lag av epitelceller som formidler transcellulær og paracellulær transport14. Paracellulær permeabilitet er avhengig av tette kryssproteiner som forsegler rommet mellom epitelceller14. Innenfor denne paracellulære transporten er det tre forskjellige veier som molekyler kan krysse: pore, lekkasje og ubegrenset15. Poreveien tillater permeabilitet for små ladede ioner, mens lekkasjeveien tillater større, uladet molekyler over15. Den tredje, ubegrensede banen gjenspeiler permeabilitet sekundært til epitelskade eller død16. Selv om mange molekyler brukes til å vurdere paracellulær permeabilitet, påvirker molekylets type og størrelse hvilken permeabilitetsvei som vil bli undersøkt.
Som et lite, hydrofilt molekyl kan LY krysse gjennom alle tre paracellulære veier, noe som gjør det til et optimalt verktøy for å studere paracellulær permeabilitet. I motsetning til dette kan 4 kDa FITC-dextran, et sukkermolekyl som brukes som markør for paracellulær permeabilitet, bare krysse lekkasjen og ubegrensede veier. Den større, 70 kDa FITC-dextran er begrenset til bare den ubegrensede banen. En annen metode for å bestemme paracellulær permeabilitet er via transepiteliale motstandsmålinger (TEER), som måler elektrisk motstand over monolag. Denne metoden måler bare poreveien17. Dermed gir LY større innsikt i den generelle paracellulære permeabiliteten ved å målrette mot alle tre banene. Denne protokollen utnytter dette ved å bruke LY til å studere paracellulær permeabilitet.
Enteroidmodellen ble valgt i denne protokollen da den nærmere etterligner in vivo-forhold ved å lage en 3D mini-tarm for å studere. Utfordringen med den tradisjonelle BO-enteroidmodellen er imidlertid hvordan man får tilgang til den apikale overflaten for å studere vertspatogeninteraksjoner og de påfølgende permeabilitetsendringene. AO-enteroidmodellen overvinner denne utfordringen ved å reversere polariteten der den apikale overflaten er i kontakt med de omkringliggende mediene. Flere alternative metoder for å få tilgang til den apikale overflaten av enteroider er beskrevet. Disse inkluderer gut-chip-systemer, mikroinjeksjon, fragmentering og voksende enteroider i monolag18,19. Fremskritt i tarmbrikkesystemer har gjort det mulig å dyrke organoider og endotelceller sammen i sammenheng med vaskularitet og peristaltikk for å etterligne tarmmiljøet18. Mikroinjeksjon innebærer injeksjon i BO enteroid lumen ved bruk av spesialutstyr som en mikromanipulator og mikroinjektor19. Fragmentering bruker dissosiasjon av enteroider i enkeltceller som deretter inkuberes i media med patogenet før reformering av en 3D-struktur19. Transformasjonen av enteroider til 2D-monolag med påfølgende behandling av den apikale overflaten er også beskrevet19. AO-enteroidmodellen løser noen av vanskelighetene med disse modellene ved å gi en enkel og effektiv måte å eksponere den apikale overflaten uten å kreve dyrt utstyr eller kompromittere den strukturelle integriteten til enteroiden.
Selv om bruk av LY i en AO-modell muliggjør en bred studie av paracellulær permeabilitet sekundært til vertspatogeninteraksjoner, kan denne protokollen tilpasses bruk med BO-enteroider så vel som FITC-dextran i stedet for LY. To viktige endringer i denne protokollen er nødvendig for å endre den som skal brukes til BO-enteroider. For det første kan BO-enteroider vedlikeholdes i BMM-kupler for alle vasketrinnene før og etter tilsetning av LY. Det er viktig å bruke oppløsninger oppvarmet til 37 °C for disse vasketrinnene for å forhindre oppløsning av BMM-kuppelen. For det andre må BMM-kuppelen forstyrres med kald DPBS og skrape brønnen med en pipettespiss etter at alle vasketrinnene er fullført for å tillate fullstendig resuspendering av dissosierte enteroider og LY. Hvis FITC-dextran erstattes av LY, anbefales det å bruke 4 kDa-molekylet når det krysser gjennom to av de tre paracellulære banene.
De viktigste trinnene i denne protokollen inkluderer å sikre tilstrekkelig vask for å fjerne spor LY fra løsningen utenfor enteroiden. Det er også viktig å vaske enteroidene forsiktig for å unngå dissosiasjon og potensiell frigjøring av LY fra lumen til den omkringliggende løsningen til den er klar til å kvantifiseres ved hjelp av en mikroplateleser. Bruk av oppvarmede løsninger under vasketrinnene reduserer også stress på enteroider. Hvis kalde løsninger brukes, kan enteroider gjennomgå apoptose, noe som fører til unøyaktige resultater.
Begrensningene i denne metoden inkluderer manglende evne til å forplante AO-enteroider og lengre dyrkingstider på grunn av de ekstra 72 timene som kreves for å reversere polariteten. Det er også en 2% -5% reduksjon i antall behandlede AO enteroid sammenlignet med kontroller. Selv om dette generelt er ubetydelig, kan det føre til en underestimering av resultatene. Begrensningene ved bruk av LY ligner andre permeabilitetsmolekyler, for eksempel 4 kDa FITC-dextran, hvor spormengder kan krysse tarmepitelbarrieren via transcytose20. Selv om dette beløpet er ubetydelig, kan det påvirke resultatene. Basert på disse funnene gir bruk av LY til media av AO-enteroider en elegant og relativt enkel måte å kvantitativt og kvalitativt analysere paracellulær tarmpermeabilitet i en 3D-modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen proprietær eller kommersiell interesse i noe produkt som er nevnt eller konsept diskutert i denne artikkelen.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Ashley Nelson fra University of Rochester Medical Center for hennes instrumentelle hjelp med vår enteroidmodell. Vi vil også takke Divisjon for pediatrisk kirurgi ved University of Oklahoma for deres støtte til dette prosjektet. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research, og Presbyterian Health Foundation Grant # 20180587 tildelt Department of Surgery ved University of Oklahoma Health Sciences Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
