Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bestämning av tarmpermeabilitet med Lucifer Yellow i en apikal-out enteroidmodell

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64215

Summary

Det nuvarande protokollet beskriver en metod som använder lucifergul i en apikal-out enteroidmodell för att bestämma tarmpermeabilitet. Denna metod kan användas för att bestämma paracellulär permeabilitet i enteroider som modellerar inflammatoriska tarmsjukdomar såsom nekrotiserande enterokolit.

Abstract

Enteroider är ett framväxande forskningsverktyg i studien av inflammatoriska tarmsjukdomar som nekrotiserande enterokolit (NEC). De odlas traditionellt i basolateral-out (BO) konformationen, där epitelcellens apikala yta vetter mot den inre lumen. I denna modell är tillgången till enteroidernas luminala yta för behandling och experiment utmanande, vilket begränsar förmågan att studera värd-patogeninteraktioner. För att kringgå detta skapades en neonatal apical-out (AO) modell för nekrotiserande enterokolit. Eftersom tarmepitelcellpermeabilitetsförändringar är patognomoniska för NEC, skisserar detta protokoll med lucifergul (LY) som en markör för paracellulär permeabilitet. LY passerar tarmepitelbarriären via alla tre stora paracellulära vägar: por, läckage och obegränsad. Att använda LY i en AO-modell möjliggör en bredare studie av permeabilitet i NEC. Efter IRB-godkännande och föräldrarnas samtycke samlades kirurgiska prover av tarmvävnad in från mänskliga för tidigt födda barn. Tarmstamceller skördades via kryptisolering och användes för att odla enteroider. Enteroider odlades till mognad och omvandlades sedan AO eller lämnades i BO-konformation. Dessa behandlades antingen inte (kontroll) eller behandlades med lipopolysackarid (LPS) och utsattes för hypoxiska tillstånd för induktion av in vitro NEC. LY användes för att bedöma permeabilitet. Immunofluorescerande färgning av det apikala proteinet zonula occludens-1 och basolateralt protein β-cateninbekräftad AO-konformation. Både AO- och BO-enteroider behandlade med LPS och hypoxi visade signifikant ökad paracellulär permeabilitet jämfört med kontroller. Både AO- och BO-enteroider visade ökat upptag av LY i lumen hos de behandlade enteroiderna jämfört med kontroller. Användningen av LY i en AO-enteroidmodell möjliggör undersökning av alla tre huvudvägarna för paracellulär permeabilitet. Det möjliggör dessutom undersökning av värd-patogeninteraktioner och hur detta kan påverka permeabiliteten jämfört med BO-enteroidmodellen.

Introduction

Enteroider är tredimensionella (3D) strukturer härledda från organbegränsade mänskliga tarmstamceller 1,2. De består helt av epitelial härstamning och innehåller alla differentierade tarmepitelcelltyper2. Enteroider upprätthåller också cellulär polaritet som består av en apikal luminal yta som bildar ett inre fack och en basolateral yta som vetter mot det omgivande mediet. Enteroider är en unik modell genom att de bevarar egenskaperna hos värden från vilken de genererades3. Således representerar enteroider som genereras från för tidigt födda barn en modell som är användbar för att undersöka sjukdomar som främst påverkar denna befolkning, såsom nekrotiserande enterokolit (NEC).

Den traditionella enteroidmodellen odlas i en basolateral-out (BO) konformation, där enteroiden är innesluten i en kupol av källarmembranmatris (BMM). BMM inducerar enteroiden att upprätthålla en 3D-struktur med den basolaterala ytan på utsidan. BO-enteroider är en lämplig modell för NEC som överbryggar klyftan mellan tvådimensionella (2D) primära mänskliga cellinjer och in vivo djurmodeller 2,4. NEC induceras i enteroider genom att placera patogener såsom LPS eller bakterier i media som omger enteroiderna, följt av exponering för hypoxiska tillstånd 2,3. Utmaningen med BO enteroid NEC-modellen är att den inte möjliggör en effektiv studie av värd-patogeninteraktioner, som uppträder vid den apikala ytan in vivo. Förändringar i tarmpermeabilitet beror på dessa värd-patogeninteraktioner. För att bättre förstå hur permeabilitet påverkar den patofysiologiska grunden för sjukdom måste en modell skapas som innebär att man behandlar den apikala ytan.

var de första som visade att mogna BO-enteroider kan induceras att bilda en apikal-out (AO) konformation genom att ta bort BMM-kupolerna och återsuspendera dem i media5. Denna artikel visade att AO-enteroider upprätthöll korrekt epitelpolaritet, innehöll alla tarmcellstyper, upprätthöll tarmepitelbarriären och tillät tillgång till den apikala ytan5. Genom att använda AO-enteroider som NEC-modell uppnås en fysiologisk reproduktion av sjukdomsprocessen och studier av värd-patogeninteraktioner.

En viktig bidragsgivare till patofysiologin hos NEC är ökad tarmpermeabilitet6. Flera molekyler har föreslagits som ett sätt att testa för tarmpermeabilitet in vitro7. Bland dessa är lucifergul (LY) ett hydrofilt färgämne med excitations- och emissionstoppar vid 428 nm respektive540 nm 8. När den korsar genom alla större paracellulära vägar har den använts för att utvärdera paracellulär permeabilitet i olika applikationer, inklusive blod-hjärn- och tarmepitelbarriärerna 8,9. Den traditionella tillämpningen av LY använder celler som odlas i monolager på en halvgenomsläpplig yta10. LY appliceras på den apikala ytan och korsar genom paracellulära täta korsningsproteiner för att samlas på den basolaterala sidan. Högre LY-koncentrationer i det basolaterala facket indikerar minskade täta korsningsproteiner med efterföljande nedbrytning av tarmepitelcellbarriären och ökad permeabilitet10. Det har också beskrivits i 3D BO-enteroidmodeller där LY lades till i media och enskilda enteroider avbildades för upptag av LY i lumen11. Även om detta möjliggör kvalitativ analys via visualisering av LY-upptag, är kvantitativ analys begränsad. Detta protokoll beskriver en unik teknik som använder LY för att bedöma paracellulär permeabilitet med hjälp av en in vitro NEC-enteroidmodell i AO-enteroider samtidigt som 3D-orientering bibehålls. Denna metod kan användas för både kvalitativ och kvantitativ analys av permeabilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den aktuella forskningen utfördes i enlighet med Institutional Review Board godkännande (IRB, #11610, 11611) vid University of Oklahoma. Föräldrarnas samtycke krävdes innan man samlade in humankirurgiska prover enligt IRB-specifikationerna. Efter IRB-godkännande och föräldrarnas samtycke erhölls mänsklig tunntarmsvävnad från spädbarn (korrigerad graviditetsålder (GA) som sträcker sig från 36-41 veckor vid tidpunkten för provinsamling, alla med en historia av för tidig födsel vid en uppskattad GA på 25-34 veckor, 2: 1 M: F) som genomgår operation för NEC eller annan tarmresektion, såsom stomiborttagning eller atresireparation. Enteroider genererades från vävnad erhållen från antingen jejunum eller ileum.

1. Mänskliga enteroidkulturer som härrör från spädbarn: kryptisolering och plätering från hela vävnaden

  1. Förbered odlingsmedia, kelaterande buffert #1 och kelaterande buffert #2 (tabell 1) efter föregående rapport4. Förvara kelaterande buffertar vid 4 °C och använd dem inom 48 timmar.
  2. Förbered humana minigutmedier (tabell 1). Förvara buljongen vid −20 °C och värm i ett 37 °C vattenbad före användning.
  3. Förbered 50% L-WRN-konditionerade medier (CM) (tabell 1). Förvara buljongen vid 4 °C i upp till 1 vecka.
    OBS: 100% L-WRN-bas för det konditionerade mediet beskrivs i ett protokoll av Miyoshi et al.12.
  4. Generera enteroider från tunntarmsvävnadsprover erhållna från kirurgiska prover efter föregående rapport4. Platta fyra brunnar av enteroider i en 24-brunnsplatta från en 0,75-2,5 g bit tarmvävnad.
    OBS: Enteroider kan framgångsrikt genereras från vävnad lagrad i 30 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium i ett 50 ml koniskt rör vid 4 ° C i upp till 48 timmar.
  5. Placera 24-brunnsplattan i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator upp och ner i 15-20 minuter för att möjliggöra polymerisation av BMM-kupoler4.
  6. Tillsätt 500 μl 50 % L-WRN CM (enligt beskrivningen i steg 1.3) med 0,5 μL Y-27632, ROCK-hämmare (RI, se materialförteckning) till varje brunn. Efter 2-3 dagar, byt ut med 50% L-WRN CM utan RI.

2. Generering av AO-enteroider

  1. Växa enteroider inbäddade i BMM i 7-10 dagar med 50% L-WRNCM 4.
  2. Ta bort mediet och tillsätt 500 μl cellåtervinningslösning (CRS, se materialförteckning) till en brunn. Skrapa kupolen, pipettera upp och ner flera gånger och tillsätt sedan CRS / enteroid / BMM-lösningen till nästa brunn.
  3. Skrapa kupolen, pipettera upp och ner flera gånger och placera lösningen i ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 500 μL CRS till den andra brunnen, pipettera upp och ner och lägg sedan till den i den första brunnen. Överför denna lösning till samma 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  4. Upprepa steg 2.3 och slå samman två brunnar i ett mikrocentrifugrör tills allt brunnsinnehåll är i CRS.
    OBS: Mer än två brunnar kan slås samman till ett större 15 ml koniskt rör om det genererar stora volymer AO-enteroider. Att upprätthålla ett 500 μL CRS per brunnsförhållande är viktigt för att säkerställa fullständig solubilisering av BMM.
  5. Placera mikrocentrifugrören (steg 2.3) med poolad CRS/enteroid/BMM-lösning på en rotator i 1 timme vid 4 °C för att solubilisera BMM.
  6. Centrifugera lösningen vid 200 x g i 3 minuter vid 4 °C, avlägsna sedan supernatanten med en mikropipett och lämna pelleten bakom dig.
  7. Återsuspendera enteroidpelleten i 1 ml 50% L-WRN CM (enligt beredningen i steg 1.3) per mikrocentrifugrör. Pipettera försiktigt 500 μl av den återsuspenderade enteroid/medialösningen i varje brunn på de ultralåga bindebandsplattorna med 24 brunnar (se materialförteckning).
  8. Inkubera vid 37 °C med 5 %CO2 i 3 dagar före experiment.

3. Verifiering av AO-enteroidkonformation via helmonterad immunofluorescerande färgning

  1. Efter inkubation av enteroiderna i mediesuspension i 3 dagar, pipettera enteroid/mediasuspensionen från en brunn till ett mikrocentrifugrör.
  2. Centrifugera enteroid/mediasuspensionen vid 200 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten med en mikropipett.
  3. Återsuspendera enteroiderna i 20 μL BMM. Pipettera 10 μL enteroidsuspension på ett mikroskopglas och sprid det i ett tunt skikt ca 1 cm x 1 cm kvadrat. Upprepa med de återstående 10 μL enteroidsuspensionen på en separat del av samma bild så att det finns två utstryk av enteroid / BMM-suspension.
  4. Låt enteroid/BMM-utstryken stelna vid rumstemperatur (RT) i 15 minuter.
  5. Arbeta i dragskåpet, placera bilden i en färgningsburk och fyll med 4% paraformaldehyd tills den täcker enteroid / BMM-utstryk (~ 30 ml för en bild om du använder en glasfärgningsburk med 10 glidkapacitet). Låt 30 min (vid rumstemperatur) för fixering ske.
    VARNING: 4% paraformaldehyd är farligt och kan orsaka ögonskador / irritation, hudirritation och cancer. Arbeta alltid under en dragskåp när du använder den. Använd skyddshandskar och personlig skyddsutrustning vid hantering av den. Kassera den i en godkänd avfallshanteringsbehållare.
  6. Kassera 4% paraformaldehyd i en lämplig avfallsbehållare. Tillsätt 30 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i färgningsbehållaren eller tills PBS täcker enteroid/BMM-utstryk. Låt den sitta i 3 min vid RT och kasta sedan PBS i paraformaldehydavfallsflaskan. Upprepa detta steg ytterligare två gånger för totalt tre tvättar.
  7. Fyll en ny färgningsburk med 30 ml 0,5% Triton X-100 utspädd i PBS. Placera bilden med enteroid/BMM-utstryk i Triton-lösningen och låt den permeabilisera i 20 minuter vid RT.
  8. Kassera 0,5% Triton X-100 utspädd i PBS. Tillsätt 30 ml PBS i färgburken och låt den sitta i 3 minuter. Kassera PBS genom dekantering.
  9. Torka försiktigt av rutschkanan runt enteroid/ BMM-utstryk, var försiktig så att du inte stör dem. Använd en hydrofob barriärpenna (barriär PAP-penna, se Materialförteckning), rita en cirkel runt var och en av enteroid/ BMM-utstryken. Gör ett 20% serum, specifikt för djuret där den sekundära antikroppen höjdes (se materialtabell).
  10. Lägg mikroskopglaset platt på labbbänken. Blockera objektsglaset i 1 timme vid 4 °C genom att pipettera 100 μl specifikt 20 % serum från steg 3.9 på var och en av de enteroid/BMM-utstryk som ringmärks av den hydrofoba barriärpennan.
  11. Bered en 100 μl lösning med 1:100 och 1:200 utspädningar av β-catenin respektive ZO-1 primära antikroppar, utspädda i PBS.
    OBS: Varje primär antikropp måste vara från ett annat djur för att säkerställa att de kommer att ha distinkta immunofluorescerande kanaler när de avbildas. Den aktuella studien använder en mus-β-catenin-antikropp och en kanin-ZO-1-antikropp (se materialförteckning).
  12. Tryck på bilden på disken för att ta bort 20% serum och torka försiktigt torrt, var försiktig så att du inte stör enteroid/ BMM-utstryk. Pipettera 100 μL primär β-catenin/ZO-1 primär antikroppslösning på en av enteroid/BMM-utstryken. Pipettera 100 μL PBS utan primär antikropp på det andra enteroid/BMM-utstryket som en negativ kontroll.
  13. Linja botten av en plastbehållare med en våt pappershandduk för att skapa en fuktad behållare. Placera bilden i behållaren och var försiktig så att du inte stör lösningar som täcker enteroid/ BMM-utstryk. Placera locket på behållaren för att täta och förvara plant vid 4 °C över natten.
    OBS: Låt inte bilden torka ut. Se till att behållaren är stängd för att undvika uttorkning.
  14. När du är redo att fortsätta trycker du på bilden på räknaren för att ta bort primära antikroppar och PBS från enteroid / BMM-utstryk.
  15. Utför ett tvättsteg genom att placera bilden i en färgningsburk och fylla med 30 ml PBS eller tills PBS täcker enteroid / BMM-utstryk. Låt den sitta i 3 min vid rumstemperatur. Kassera PBS och upprepa detta steg två gånger till för totalt tre tvättar.
  16. Bered 200 μl sekundära antikroppar för två olika immunofluorescerande kanaler, där varje antikropp har en utspädning på 1:1000 i PBS (se materialförteckning). Håll lösningen borta från ljus.
  17. Pipettera över 100 μl sekundär antikroppslösning på var och en av enteroid/BMM-utstryken. Placera den i mörkret och låt den sitta i 1 timme vid RT.
  18. Tryck på bilden på räknaren för att ta bort sekundära antikroppar. Upprepa tvättstegen som beskrivs i steg 3.15 och se till att alla tvättar utförs i mörkret.
  19. Tillsätt en droppe 4′,6-diamidino-2-fenylindol (Fluoroshield med DAPI, se materialförteckning) monteringsmedium till var och en av enteroid/BMM-utstryken och applicera ett täckglas för att säkerställa att båda utstryken är tillräckligt täckta. Undvik att fånga bubblor under täckglaset. Håll bilden i mörkret tills den är redo att ses under mikroskopet.
    OBS: Omedelbar avbildning av bilderna ger de mest optimala resultaten; Objektglas kan dock förvaras platt i en fuktad behållare vid 4 °C och avbildas i upp till 1 vecka efter tillsats av DAPI.

4. Induktion av experimentell NEC

  1. Se till att AO-enteroider har varit i suspension i minst 72 timmar före användning.
  2. Pipettera försiktigt hela enteroid/mediasuspensionen från varje brunn till ett mikrocentrifugrör.
    OBS: Flera brunnar kan slås samman till ett 15 ml koniskt rör om en stor volym brunnar behandlas. Minst tre brunnar per behandlingsgrupp rekommenderas för detta protokoll.
  3. Centrifugera vid 300 x g i 3 min vid RT och ta bort supernatanten.
  4. Tillsätt 10 μl 5 mg/ml lipopolysackarid (LPS, se materialtabell) till 500 μl 50 % LWRN CM per brunn (slutlig koncentration 100 μg/ml LPS).
  5. Återsuspendera AO-enteroider som betecknas som behandlingsgrupp i 50% LWRN + LPS och alikvot 500 μL suspension till en 24-brunns ultralåg fästplatta. Återsuspendera AO-enteroider som betecknas som obehandlade kontroller i 500 μL av 50% LWRN CM per brunn. Alikvot 500 μL av denna suspension till en separat 24-brunns ultralåg fästplatta.
  6. Inducera hypoxi i de LPS-behandlade AO-enteroiderna via en modulär inkubatorkammare (MIC) med 1% O2, 5% CO2 och 94%N2 enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell). Behandla enteroiderna med hypoxi och LPS i 24 timmar.
  7. Placera de obehandlade och LPS + hypoxibehandlade kulturerna, fortfarande i MIC-kammaren, i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator i 24 timmar.

5. Mätning av paracellulär permeabilitet med hjälp av LY

  1. Pipettera försiktigt enteroid/mediasuspensionen från varje brunn till ett mikrocentrifugrör. Varm DPBS och 50% LRWN CM i ett 37 °C vattenbad.
  2. Centrifugera enteroid/mediasuspensionen vid 300 x g i 3 minuter vid rt.
  3. Ta bort media. Tvätta enteroiderna med varma 500 μL DPBS.
  4. Centrifugera vid 300 x g i 3 min vid RT. Ta bort supernatanten med en mikropipett.
  5. Upprepa steg 5.3-5.4 en gång till i totalt två gånger.
  6. Efter tvätt, tillsätt 450 μl varm 50% LWRN CM (enligt beredningen i steg 1.3).
  7. Tillsätt 50 μl 2,5 mg/ml LY (slutlig koncentration är 0,25 μg/μl, se materialtabell) till varje brunn och virvla försiktigt för att blanda. Placera i en 37 °C, 5%CO2 inkubator i 2 timmar.
  8. Pipettera försiktigt enteroid/mediasuspensionen från varje brunn till ett mikrocentrifugrör.
  9. Centrifugera vid 300 x g i 3 minuter vid RT, ta sedan bort supernatanten och lämna enteroidpelleten bakom dig.
  10. Tvätta enteroiderna med 500 μL varm DPBS.
  11. Centrifugera vid 300 x g i 3 min vid RT och ta sedan bort supernatanten och lämna enteroidpelleten bakom sig.
  12. Upprepa steg 5.10-5.11 tre gånger till för totalt fyra tvättar.
  13. Återsuspendera varje pellet med 1 000 μl kall DPBS och pipettera kraftigt upp och ner för att dissociera enteroiderna.
  14. Förbered standarder för LY-standardkurvan utspädd i DPBS (100 ng/ml; 50 ng/ml; 25 ng/ml; 12,5 ng/ml; 6,25 ng/ml; 3,13 ng/ml; 1,57 ng/ml; 0 ng/ml).
  15. Pipettera över 150 μl av varje prov per brunn i tre exemplar på en 96-brunnsplatta.
  16. Mät fluorescensen vid en excitationstopp på 428 nm och emissionstoppen på 536 nm på en plattläsare som kan läsa fluorescens (se materialförteckning). Med hjälp av statistisk programvara (se materialförteckning) beräknar du koncentrationerna genom att interpolera standardkurvan och använda en kurva med fyra parametrar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

AO-konformation
Enteroider suspenderade i 50% LWRN-media i 72 timmar antar en AO-konformation (figur 1). Detta bekräftades via immunofluorescerande färgning med hjälp av enteroida hela fästen av det apikala proteinet, zonula occludens-1 (ZO-1) och basolateralt protein, β-catenin (Figur 1). AO-enteroider visar ZO-1 (grön) på den yttre, apikala ytan av enteroiden, medan β-catenin (röd) är på den inre, basolaterala ytan (figur 1A). BO-enteroider visar inversen med β-catenin (röd) på ytterytan och ZO-1 (grön) på den inre, luminala ytan (figur 1B). Dessa resultat visar den förväntade polaritetsomvandlingen för att bekräfta att enteroiderna är AO före experiment.

LY-analysresultat
Ökad permeabilitet, demonstrerad av det ökade upptaget av LY-färgämne i enteroidlumen, förväntas i NEC6. BO-enteroider behandlade med LPS och hypoxi visade signifikant ökad permeabilitet jämfört med obehandlade kontroller med den teknik som beskrivs i detta protokoll (figur 2A, **p = 0,005). Detta överensstämmer med litteraturen som har beskrivit ökad permeabilitet i BO-enteroidmodeller av NEC 4,13. På liknande sätt visade AO-enteroider behandlade med LPS och hypoxi också signifikant ökad permeabilitet jämfört med obehandlade kontroller, som förväntat i en NEC-modell (figur 3A, *p = 0,02). Behandlade AO-enteroider visade ökat upptag av LY i lumen hos behandlade enteroider (figur 3C) jämfört med obehandlade kontroller (figur 3B). Detta liknar vad som ses i BO-enteroider, där LY visualiseras i enteroidlumen (Figur 2B). Ökat LY-färgupptag i enteroidens lumen resulterar i ökad fluorescens i behandlade enteroider, vilket möjliggör kvantitativ analys via en mikroplattläsare som använder AO-enteroider från olika brunnar (figur 3A). Detta visar att denna teknik, som använder LY, kan användas för att bedöma permeabilitet i 3D-enteroider. Resultaten kan analyseras med hjälp av statistisk programvara som kan interpolera en standardkurva för att bestämma LY-koncentrationerna i behandlingsgrupperna. Ett Students t-test, som visas i figur 2 och figur 3, kan användas för att bestämma betydelsen mellan grupper.

Figure 1
Figur 1: Verifiering av AO-konformation . (A) Apical-out (AO) enteroid som visar omvänd polaritet jämfört med (B) basolateral out (BO) enteroid som visar traditionell polaritet vid 20x förstoring, skalstången inställd på 100 μm. DAPI, blå; beta-catenin (basolateralt protein), rött; zonula occludens-1 (apikalt protein), grönt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Ökad permeabilitet i en BO-enteroidmodell efter in vitro-NEC-induktion mätt med en LY-analys. A) LPS- och hypoxibehandlade basolaterala enteroider har signifikant ökad permeabilitet jämfört med obehandlade kontroller med lucifergul analys. felstaplar visar medelvärdets standardfel; **p = 0,005. (B) Bild av basolaterala enteroider med lucifergul visualiserad i lumen efter behandling av mediet med lucifergult färgämne vid 10x förstoring, 300 μm skala bar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Ökad permeabilitet i en AO-enteroidmodell efter in vitro NEC-induktion mätt med en LY-analys. A) LPS- och hypoxibehandlade apikala enteroider har signifikant ökad permeabilitet jämfört med obehandlade kontroller med det gula lucifer-testet. felstaplar visar medelvärdets standardfel; *p = 0,02. (B) En representativ bild av obehandlad kontroll apical-out (AO) enteroid vid 10x; skalstången är inställd på 100 μm. (C) En representativ bild av en LPS- och hypoxibehandlad AO-enteroid med LY visualiseras i lumen vid 10x; Skalstrecket är inställt på 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Sammansättning av lösningar, buffertar och medier som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tartarmpermeabilitet är komplex och reflekterar epitelbarriärfunktionen. Tarmbarriären består av ett enda lager epitelceller som förmedlar transcellulär och paracellulär transport14. Paracellulär permeabilitet är beroende av täta korsningsproteiner som tätar utrymmet mellan epitelceller14. Inom denna paracellulära transport finns det tre distinkta vägar genom vilka molekyler kan korsa: por, läckage ochobegränsad 15. Porvägen möjliggör permeabilitet för små laddade joner, medan läckagevägen tillåter större, oladdade molekyler över15. Den tredje, obegränsade vägen återspeglar permeabilitet sekundär till epitelskada eller död16. Även om många molekyler används för att bedöma paracellulär permeabilitet, påverkar molekylens typ och storlek vilken permeabilitetsväg som kommer att undersökas.

Som en liten, hydrofil molekyl kan LY korsa genom alla tre paracellulära vägar, vilket gör det till ett optimalt verktyg för att studera paracellulär permeabilitet. Däremot kan 4 kDa FITC-dextran, en sockermolekyl som används som en markör för paracellulär permeabilitet, bara korsa läckan och obegränsade vägar. Den större, 70 kDa FITC-dextran är begränsad till bara den obegränsade vägen. En annan metod för att bestämma paracellulär permeabilitet är via transepiteliala motståndsmätningar (TEER), som mäter elektriskt motstånd över monolager. Denna metod mäter endast porvägen17. Således ger LY större insikt i den övergripande paracellulära permeabiliteten genom att rikta in sig på alla tre vägarna. Detta protokoll utnyttjar detta genom att använda LY för att studera paracellulär permeabilitet.

Enteroidmodellen valdes i detta protokoll eftersom den närmare efterliknar in vivo-förhållanden genom att skapa en 3D-minitarm att studera. Utmaningen med den traditionella BO-enteroidmodellen är dock hur man kommer åt den apikala ytan för att studera värd-patogeninteraktioner och de efterföljande permeabilitetsförändringarna. AO-enteroidmodellen övervinner denna utmaning genom att vända polariteten där den apikala ytan är i kontakt med det omgivande mediet. Flera alternativa metoder för att komma åt enteroidernas apikala yta har beskrivits. Dessa inkluderar tarmchipsystem, mikroinjektion, fragmentering och växande enteroider i monolager18,19. Framsteg inom tarmchipsystem har gjort det möjligt att odla organoider och endotelceller tillsammans i samband med vaskularitet och peristaltik för att efterlikna tarmmiljön18. Mikroinjektion innebär injektion i BO-enteroidlumen via användning av specialutrustning såsom en mikromanipulator och mikroinjektor19. Fragmentering använder dissociation av enteroider i enskilda celler som sedan inkuberas i media med patogenen innan en 3D-struktur reformeras19. Omvandlingen av enteroider till 2D-monolager med efterföljande behandling av den apikala ytan har också beskrivits19. AO-enteroidmodellen adresserar några av svårigheterna med dessa modeller genom att tillhandahålla ett enkelt, effektivt sätt att exponera den apikala ytan utan att kräva dyr utrustning eller äventyra enteroidens strukturella integritet.

Även om användning av LY i en AO-modell möjliggör en bred studie av paracellulär permeabilitet sekundär till värd-patogeninteraktioner, kan detta protokoll anpassas för användning med BO-enteroider såväl som FITC-dextran istället för LY. Två viktiga ändringar av detta protokoll krävs för att ändra det för att användas för BO-enteroider. För det första kan BO-enteroider bibehållas i BMM-kupoler för alla tvättsteg före och efter tillsats av LY. Det är viktigt att använda lösningar som värmts till 37 °C för dessa tvättsteg för att förhindra solubilisering av BMM-kupolen. För det andra måste BMM-kupolen störas med kall DPBS och skrapa brunnen med en pipettspets efter att alla tvättsteg är färdiga för att möjliggöra fullständig återsuspension av de dissocierade enteroiderna och LY. Om FITC-dextran ersätts med LY, rekommenderas att använda 4 kDa-molekylen när den passerar genom två av de tre paracellulära vägarna.

De viktigaste stegen i detta protokoll inkluderar att säkerställa tillräckliga tvättar för att ta bort spår LY från lösningen utanför enteroiden. Det är också viktigt att tvätta enteroiderna försiktigt för att undvika dissociation och potentiell frisättning av LY från lumen till den omgivande lösningen tills den är redo att kvantifieras med hjälp av en mikroplattläsare. Att använda uppvärmda lösningar under tvättstegen minskar också stressen på enteroiderna. Om kalla lösningar används kan enteroider genomgå apoptos, vilket leder till felaktiga resultat.

Begränsningarna med denna metod inkluderar oförmågan att sprida AO-enteroider och längre odlingstider på grund av de ytterligare 72 timmar som krävs för att vända polariteten. Det finns också en 2% -5% minskning av antalet behandlade AO-enteroid jämfört med kontroller. Även om detta överlag är försumbart kan det leda till en underskattning av resultaten. Begränsningarna med att använda LY liknar andra permeabilitetsmolekyler, såsom 4 kDa FITC-dextran, där spårmängder kan passera tarmepitelbarriären via transcytos20. Även om detta belopp är försumbart kan det påverka resultaten. Baserat på dessa resultat ger applicering av LY på media av AO-enteroider ett elegant och relativt enkelt sätt att kvantitativt och kvalitativt analysera paracellulär tarmpermeabilitet i en 3D-modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna rapporterar inget proprietärt eller kommersiellt intresse för någon produkt som nämns eller koncept som diskuteras i den här artikeln.

Acknowledgments

Vi vill tacka Ashley Nelson från University of Rochester Medical Center för hennes instrumentella hjälp med vår enteroidmodell. Vi vill också tacka avdelningen för pediatrisk kirurgi vid University of Oklahoma för deras stöd till detta projekt. Detta arbete stöddes av National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research och Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 som tilldelades institutionen för kirurgi vid University of Oklahoma Health Sciences Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[leu] 15-gastrin 1 Millipore Sigma G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer Corning 431752
100% LWRN conditioned media Made in-house following Miyoshi et al.12
24-well tissue culture plate Corning 3526
96-well black, clear bottom plate Greiner Bio-One 655090
A-83-01 R&D Systems 2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 Invitrogen A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 Invitrogen A-11032
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 Cell Signaling #D6L1E
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 Cell Signaling #14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A Thermo Fisher Scientific 17504-044
Barrier PAP pen Scientific Device Laboratory 9804-02
BMM (Matrigel) Corning CB-40230C
Cell Recovery Solution Corning 354270
Dissecting scissors
DMEM Thermo Fisher Scientific 11-965-118
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 11320-082
DPBS Thermo Fisher Scientific 14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore Sigma GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Millipore Sigma EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system Invitrogen AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Products 100-525
Fluoroshield with DAPI Millipore Sigma F6057-20mL
Forceps
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050-061
GraphPad Prism 9 Dotmatics
Insulin Thermo Fisher Scientific 12585014
Lipopolysaccharide (LPS) Millipore Sigma L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt Invitrogen L453
Modular incubator chamber Billups Rothenberg Inc. MIC101
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) Thermo Fisher Scientific 15630-080
N-Acetylcysteine Millipore Sigma A9165-5G
Nicotinamide Millipore Sigma N0636-100G
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093
SB202190 Millipore Sigma S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader Molecular devices
Tube Revolver Rotator ThermoFisher Scientific 88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate Corning 3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI) Tocris 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
  2. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  3. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  4. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
  5. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  6. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  7. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
  8. Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
  9. Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
  10. Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
  11. Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
  12. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  13. Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
  14. Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
  15. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
  16. Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
  17. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
  19. Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
  20. Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 185
Bestämning av tarmpermeabilitet med Lucifer Yellow i en apikal-out enteroidmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liebe, H., Schlegel, C., Cai, X.,More

Liebe, H., Schlegel, C., Cai, X., Golubkova, A., Leiva, T., Berry, W. L., Hunter, C. J. Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model. J. Vis. Exp. (185), e64215, doi:10.3791/64215 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter