Summary
Mevcut protokol, bağırsak geçirgenliğini belirlemek için apikal-dışarı enteroid modelinde lusifer sarısı kullanan bir yöntemi özetlemektedir. Bu yöntem, nekrotizan enterokolit gibi inflamatuar bağırsak hastalıklarını modelleyen enteroidlerde parasellüler geçirgenliği belirlemek için kullanılabilir.
Abstract
Enteroidler, nekrotizan enterokolit (NEC) gibi enflamatuar bağırsak hastalıklarının incelenmesinde ortaya çıkan bir araştırma aracıdır. Geleneksel olarak, epitel hücresinin apikal yüzeyinin iç lümene baktığı bazolateral çıkış (BO) konformasyonunda yetiştirilirler. Bu modelde, tedavi ve deney için enteroidlerin luminal yüzeyine erişim zordur, bu da konakçı-patojen etkileşimlerini inceleme yeteneğini sınırlar. Bunu atlatmak için, nekrotizan enterokolit için bir yenidoğan apikal-out (AO) modeli oluşturuldu. İntestinal epitel hücre geçirgenliği değişiklikleri NEC için patognomonik olduğundan, bu protokol parasellüler geçirgenliğin bir belirteci olarak lusifer sarısı (LY) kullanımını özetlemektedir. LY, bağırsak epitel bariyerini üç ana parasellüler yolun hepsinden geçirir : gözenek, sızıntı ve kısıtlamasız. Bir AO modelinde LY kullanmak, NEC'de geçirgenliğin daha geniş bir çalışmasına izin verir. IRB onayı ve ebeveyn onayını takiben, insan preterm yenidoğanlardan bağırsak dokusunun cerrahi örnekleri toplandı. Bağırsak kök hücreleri kript izolasyonu yoluyla toplandı ve enteroidleri büyütmek için kullanıldı. Enteroidler olgunluğa erişti ve daha sonra AO'yu dönüştürdü veya BO konformasyonunda bırakıldı. Bunlar ya tedavi edilmedi (kontrol) ya da lipopolisakkarit (LPS) ile tedavi edildi ve in vitro NEC'nin indüksiyonu için hipoksik koşullara maruz bırakıldı. Geçirgenliği değerlendirmek için LY kullanıldı. Apikal protein zonula oklüdens-1 ve bazolateral protein β-kateninin immünofloresan boyanması AO konformasyonunu doğruladı. LPS ve hipoksi ile tedavi edilen AO ve BO enteroidleri, kontrollere kıyasla önemli ölçüde artmış parasellüler geçirgenlik göstermiştir. Hem AO hem de BO enteroidleri, kontrollere kıyasla tedavi edilen enteroidlerin lümenine LY'nin alımının arttığını göstermiştir. Bir AO enteroid modelinde LY'nin kullanılması, parasellüler geçirgenliğin üç ana yolunun hepsinin araştırılmasına izin verir. Ek olarak, konakçı-patojen etkileşimlerinin araştırılmasına ve bunun BO enteroid modeline kıyasla geçirgenliği nasıl etkileyebileceğine izin verir.
Introduction
Enteroidler, organ kısıtlı insan bağırsak kök hücrelerinden türetilen üç boyutlu (3D) yapılardır 1,2. Tamamen epitel soyundan oluşurlar ve tüm farklılaşmış intestinal epitel hücre tipleriniiçerirler 2. Enteroidler ayrıca bir iç bölme oluşturan apikal bir luminal yüzeyden ve çevredeki ortama bakan bazolateral bir yüzeyden oluşan hücresel polariteyi korurlar. Enteroidler, üretildikleri konakçının özelliklerini korudukları için benzersiz bir modeldir3. Bu nedenle, prematüre insan bebeklerinden üretilen enteroidler, nekrotizan enterokolit (NEC) gibi öncelikle bu popülasyonu etkileyen hastalıkları araştırmak için yararlı olan bir modeli temsil eder.
Geleneksel enteroid model, enteroidin bir bazal membran matrisi (BMM) kubbesi içine alındığı bir bazolateral çıkış (BO) konformasyonunda yetiştirilir. BMM, enteroidin dışarıdaki bazolateral yüzey ile 3D bir yapıyı korumasını sağlar. BO enteroidleri, iki boyutlu (2D) birincil insan hücre hatları ile in vivo hayvan modelleri 2,4 arasındaki boşluğu dolduran NEC için uygun bir modeldir. NEC, enteroidleri çevreleyen ortama LPS veya bakteri gibi patojenlerin yerleştirilmesiyle enteroidlerde indüklenir, ardından hipoksik koşullara maruz kalır 2,3. BO enteroid NEC modeli ile ilgili zorluk, apikal yüzeyde in vivo olarak meydana gelen konakçı-patojen etkileşimlerinin etkili bir şekilde çalışılmasına izin vermemesidir. Bağırsak geçirgenliğindeki değişiklikler bu konakçı-patojen etkileşimlerinden kaynaklanmaktadır. Geçirgenliğin hastalığın patofizyolojik temelini nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için, apikal yüzeyin tedavisini içeren bir model oluşturulmalıdır.
Co ve ark., olgun BO enteroidlerinin, BMM kubbelerini çıkararak ve bunları medya5'te yeniden askıya alarak apikal-out (AO) konformasyonu oluşturmaya indüklenebileceğini gösteren ilk kişilerdir. Bu makalede, AO enteroidlerinin doğru epitel polaritesini koruduğu, tüm intestinal hücre tiplerini içerdiği, intestinal epitel bariyerini desteklediği ve apikal yüzeye erişime izin verdiğigösterilmiştir 5. AO enteroidlerinin bir NEC modeli olarak kullanılması, hastalık sürecinin fizyolojik bir üremesini ve konakçı-patojen etkileşimlerinin incelenmesini sağlar.
NEC'nin patofizyolojisine önemli bir katkıda bulunanlardan biri artmış bağırsak geçirgenliğidir6. İn vitro7 bağırsak geçirgenliğini test etmenin bir yolu olarak birkaç molekül önerilmiştir. Bunlar arasında, lusifer sarısı (LY), sırasıyla 428 nm ve 540 nm'de uyarma ve emisyon zirvelerine sahip hidrofilik bir boyadır. Tüm ana parasellüler yollardan geçerken, kan-beyin ve bağırsak epitel bariyerleri 8,9 dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda parasellüler geçirgenliği değerlendirmek için kullanılmıştır. LY'nin geleneksel uygulaması, yarı geçirgen bir yüzey10 üzerinde tek katmanlı olarak yetiştirilen hücreleri kullanır. LY apikal yüzeye uygulanır ve bazolateral tarafta toplanmak için parasellüler sıkı bağlantı proteinlerinden geçer. Bazolateral bölmedeki daha yüksek LY konsantrasyonları, daha sonra bağırsak epitel hücre bariyeri parçalanması ve artan geçirgenlik10 ile birlikte sıkı bağlantı proteinlerinin azaldığını gösterir. Ayrıca, LY'nin medyaya eklendiği ve LY'nin lümen11'e alımı için bireysel enteroidlerin görüntülendiği 3D BO enteroid modellerinde de tanımlanmıştır. Bu, LY alımının görselleştirilmesi yoluyla nitel analize izin vermesine rağmen, nicel analiz sınırlıdır. Bu protokol, AO enteroidlerinde in vitro NEC enteroid modeli kullanarak parasellüler geçirgenliği değerlendirmek için LY kullanan ve 3D oryantasyonunu koruyan benzersiz bir tekniği özetlemektedir. Bu yöntem, geçirgenliğin hem kalitatif hem de nicel analizi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırma, Oklahoma Üniversitesi'nde Kurumsal İnceleme Kurulu onayına (IRB, #11610, 11611) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. IRB spesifikasyonlarına göre insan cerrahi örneklerini toplamadan önce ebeveyn onayı gerekiyordu. IRB onayı ve ebeveyn onayını takiben, NEC veya ostomi alımı veya atrezi onarımı gibi diğer bağırsak rezeksiyonu için ameliyat geçiren bebeklerden (düzeltilmiş gebelik yaşı (GA), hepsi 25-34 haftalık, tahmini GA'da erken doğum öyküsü olan, 2: 1 M: F olan) insan ince bağırsak dokusu elde edildi. Enteroidler jejunum veya ileumdan elde edilen dokudan üretildi.
1. İnsan bebek kaynaklı enteroid kültürler: tüm dokudan kript izolasyonu ve kaplama
- Önceki rapor4'ü takiben kültür medyası, şelatlama arabelleği #1 ve şelatlama arabelleği #2 (Tablo 1) hazırlayın. Şelatlama tamponlarını 4 °C'de saklayın ve 48 saat içinde kullanın.
- İnsan minigut medyasını hazırlayın (Tablo 1). Stoğu -20 ° C'de saklayın ve kullanmadan önce 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
- %50 L-WRN şartlandırılmış ortam (CM) hazırlayın (Tablo 1). Stoğu 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
NOT: Şartlandırılmış ortam için% 100 L-WRN tabanı, Miyoshi ve ark.12 tarafından bir protokolde tanımlanmıştır. - Bir önceki rapor4'ü takiben cerrahi örneklerden elde edilen ince bağırsak dokusu örneklerinden enteroidler üretin. 0.75-2.5 g'lık bir bağırsak dokusundan 24 delikli bir plakada dört kuyucuk enteroid plakası.
NOT: Enteroidler, 30 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamında, 4 ° C'de 50 mL'lik bir konik tüpte 48 saate kadar saklanan dokudan başarıyla üretilebilir. - BMM kubbelerinin polimerizasyonuna izin vermek için 24 kuyucuklu plakayı 37 °C, %5 CO2 inkübatöre 15-20 dakika baş aşağı yerleştirin4.
- Her bir kuyucuğa 0.5 μL Y-27632, ROCK inhibitörü (RI, Malzeme Tablosuna bakınız) ile 500 μL% 50 L-WRN CM (adım 1.3'te açıklandığı gibi) ekleyin. 2-3 gün sonra, RI olmadan% 50 L-WRN CM ile değiştirin.
2. AO enteroidlerinin üretimi
- BMM'ye gömülü enteroidleri% 50 L-WRN CM4 ile 7-10 gün boyunca büyütün.
- Ortamı çıkarın ve bir kutucuğa 500 μL hücre kurtarma çözeltisi (CRS , bkz. Kubbeyi kazıyın, pipeti birkaç kez yukarı ve aşağı kazıyın, ardından CRS / enteroid / BMM çözeltisini bir sonraki kuyucuğa ekleyin.
- Kubbeyi kazıyın, pipeti birkaç kez yukarı ve aşağı kazıyın ve çözeltiyi bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. İkinci kutucuğa 500 μL CRS ekleyin, yukarı ve aşağı pipet verin, ardından ilk oyuğa ekleyin. Bu çözeltiyi aynı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Adım 2.3'ü tekrarlayın, tüm kuyu içeriği CRS'de olana kadar iki kuyuyu bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
NOT: İkiden fazla kuyu, büyük miktarlarda AO enteroidleri üretiyorsa, daha büyük bir 15 mL konik tüp içinde toplanabilir. Kuyu başına 500 μL CRS oranının korunması, BMM'nin tam çözünürlüğünü sağlamak için önemlidir. - BMM'yi çözündürmek için mikrosantrifüj tüplerini (adım 2.3) havuzlanmış CRS / enteroid / BMM çözeltisi ile 4 ° C'de 1 saat boyunca bir rotatör üzerine yerleştirin.
- Çözeltiyi 4 ° C'de 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin, ardından süpernatantı bir mikropipetle çıkarın ve peleti geride bırakın.
- Enteroid peleti, mikrosantrifüj tüpü başına% 50 L-WRN CM'lik 1 mL'de (adım 1.3'te hazırlandığı gibi) yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan enteroid/ortam çözeltisinin 500 μL'sini ultra düşük ataşmanlı 24 delikli doku kültürü plakalarının her bir kuyucuğuna nazikçe pipetleyin (bkz.
- Denemeden önceki 3 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
3. AO enteroid konformasyonunun tam montajlı immünofloresan boyama ile doğrulanması
- Enteroidlerin 3 gün boyunca ortam süspansiyonunda inkübasyonunu takiben, enteroid / medya süspansiyonunu bir kuyucuktan bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
- Enteroid/ortam süspansiyonunu 200 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı bir mikropipetle çıkarın.
- Enteroidleri 20 μL BMM'de yeniden askıya alın. Pipet 10 μL enteroid süspansiyonu mikroskop üzerine kaydırır ve yaklaşık 1 cm x 1 cm kare ince bir tabaka halinde yayar. Kalan 10 μL enteroid süspansiyonu ile aynı slaytın ayrı bir bölümünde tekrarlayın, böylece iki enteroid / BMM süspansiyonu lekesi olur.
- Enteroid/BMM yaymalarının oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca katılaşmasına izin verin.
- Duman davlumbazında çalışırken, sürgüyü bir boyama kavanozuna yerleştirin ve enteroid / BMM yaymasını örtene kadar% 4 paraformaldehit ile doldurun (10 slayt kapasiteli bir cam vitray kavanoz kullanılıyorsa bir slayt için ~ 30 mL). Fiksasyonun gerçekleşmesi için 30 dakika (oda sıcaklığında) bekleyin.
DİKKAT: %4 paraformaldehit tehlikelidir ve göz hasarına/tahrişine, cilt tahrişine ve kansere neden olabilir. Kullanırken daima bir duman başlığı altında çalışın. Kullanırken koruyucu eldiven ve kişisel koruyucu ekipman giyin. Onaylı bir atık imha kabına atın. - % 4 paraformaldehiti uygun bir atık kabına atın. Boyama kavanozuna veya PBS enteroid/BMM yaymalarını kaplayana kadar 30 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. RT'de 3 dakika bekletin ve ardından PBS'yi paraformaldehit atık şişesine atın. Toplam üç yıkama için bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
- PBS'de seyreltilmiş 30 mL'lik %0,5 Triton X-100 ile yeni bir boyama kavanozunu doldurun. Enteroid/BMM yaymalı slaytı Triton çözeltisine yerleştirin ve RT'de 20 dakika geçirgenleşmesine izin verin.
- PBS'de seyreltilmiş %0,5 Triton X-100'ü atın. Boyama kavanozuna 30 mL PBS ekleyin ve 3 dakika bekletin. PBS'yi dekantasyon yaparak atın.
- Enteroid / BMM yaymalarının etrafındaki slaytı nazikçe silin, onları bozmamaya dikkat edin. Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak (bariyerli PAP kalemi, bakınız Malzeme Tablosu), enteroid/BMM yaymalarının her birinin etrafına bir daire çizin. Sekonder antikorun yükseldiği hayvana özgü% 20'lik bir serum yapın (bakınız Malzeme Tablosu).
- Mikroskop slaytını laboratuvar tezgahına düz bir şekilde yerleştirin. Hidrofobik bariyer kalemi tarafından halkalanan enteroid/BMM yaymalarının her birine adım 3.9'dan itibaren 100 μL spesifik %20 serum pipetleyerek slaytı 4 °C'de 1 saat boyunca bloke edin.
- PBS'de seyreltilmiş sırasıyla 1:100 ve 1:200 β-katenin ve ZO-1 primer antikorlarının seyreltilmesiyle 100 μL'lik bir çözelti hazırlayın.
NOT: Her birincil antikor, görüntülendiklerinde farklı immünofloresan kanallara sahip olmalarını sağlamak için farklı bir hayvandan olmalıdır. Bu çalışmada bir fare β-katenin antikoru ve bir tavşan ZO-1 antikoru kullanılmaktadır (bakınız Malzeme Tablosu). - % 20 serumu çıkarmak için tezgahın üzerindeki slayda dokunun ve enteroid / BMM yaymalarını bozmamaya dikkat ederek yavaşça kurulayın. Enteroid/BMM yaymalarından birine 100 μL β-katenin/ZO-1 primer antikor solüsyonu pipeti. Pipet, primer antikor olmaksızın 100 μL PBS'yi negatif kontrol olarak diğer enteroid/BMM üzerine smear eder.
- Nemlendirilmiş bir kap oluşturmak için plastik bir kabın tabanını ıslak bir kağıt havluyla hizalayın. Sürgüyü kabın içine yerleştirin, enteroid/BMM yaymalarını kaplayan çözeltileri bozmamaya dikkat edin. Kapağı kapatmak için kabın üzerine yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C'de düz bir şekilde saklayın.
NOT: Kızağın kurumasına izin vermeyin. Kurulaşmayı önlemek için kabın kapalı olduğundan emin olun. - Devam etmeye hazır olduktan sonra, enteroid / BMM yaymalarından birincil antikorları ve PBS'yi çıkarmak için sayaç üzerindeki slayta dokunun.
- Slaytı bir boyama kavanozuna yerleştirip 30 mL PBS ile doldurarak veya PBS enteroid/BMM yaymalarını kaplayana kadar bir yıkama adımı uygulayın. Oda sıcaklığında 3 dakika bekletin. PBS'yi atın ve toplam üç yıkama için bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
- İki farklı immünofloresan kanal için 200 μL sekonder antikor hazırlayın, her antikor PBS'de 1:1000 seyreltmeye sahiptir (bkz. Çözümü ışıktan uzak tutun.
- Enteroid/BMM yaymalarının her birine 100 μL sekonder antikor çözeltisi pipetin. Karanlıkta yerleştirin ve RT'de 1 saat bekletin.
- İkincil antikorları çıkarmak için sayaç üzerindeki slayta dokunun. Adım 3.15'te belirtilen yıkama adımlarını tekrarlayın ve tüm yıkamaların karanlıkta yapıldığından emin olun.
- Enteroid/BMM yaymalarının her birine 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI'li Floroshield, Malzeme Tablosuna bakınız) montaj ortamı damlatın ve her iki lekenin de yeterince örtülmesini sağlamak için bir örtü slip uygulayın. Kabarcıkları kapak kapağının altına hapsetmekten kaçının. Mikroskop altında görüntülemeye hazır olana kadar slaytı karanlıkta tutun.
NOT: Slaytların anında görüntülenmesi en uygun sonuçları verir; Bununla birlikte, slaytlar 4 ° C'de nemlendirilmiş bir kapta düz bir şekilde saklanabilir ve DAPI'nin eklenmesinden sonra 1 haftaya kadar görüntülenebilir.
4. Deneysel NEC'nin indüksiyonu
- AO enteroidlerinin kullanımdan önce en az 72 saat boyunca süspansiyonda olduğundan emin olun.
- Her bir kuyucuktan gelen tüm enteroid/ortam süspansiyonunu nazikçe bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
NOT: Çok sayıda kuyu işlendiğinde birden fazla kuyu 15 mL'lik bir konik tüp halinde toplanabilir. Bu protokol için tedavi grubu başına en az üç kuyu önerilir. - RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
- Kuyucuk başına 500 μL %50 LWRN CM'ye 10 μL 5 mg/mL lipopolisakkarit (LPS, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin (son konsantrasyon 100 μg/mL LPS).
- Tedavi grubu olarak belirlenen AO enteroidleri% 50 LWRN + LPS ve aliquot 500 μL süspansiyonda 24 kuyucuklu ultra düşük bir bağlantı plakasına yeniden askıya alın. Tedavi edilmemiş kontroller olarak belirlenen AO enteroidlerini, kuyu başına% 50 LWRN CM'nin 500 μL'sinde yeniden askıya alın. Bu süspansiyonun Aliquot 500 μL'si ayrı bir 24 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasına.
- LPS ile muamele edilmiş AO enteroidlerinde, üreticinin talimatlarına göre% 1O2,% 5 CO 2 ve% 94N 2 ile modüler bir inkübatör odası (MIC) aracılığıyla hipoksi indükleyin (bkz. Enteroidleri 24 saat boyunca hipoksi ve LPS ile tedavi edin.
- Tedavi edilmemiş ve LPS + hipoksi ile tedavi edilmiş kültürleri, hala MIC odasında, 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
5. LY kullanılarak parasellüler geçirgenliğin ölçülmesi
- Her bir kuyucuktan enteroid/ortam süspansiyonunu nazikçe bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. 37 °C su banyosunda sıcak DPBS ve %50 LRWN CM.
- Enteroid/ortam süspansiyonunu RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
- Medyayı kaldırın. Enteroidleri ılık 500 μL DPBS ile yıkayın.
- RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatantı bir mikropipetle çıkarın.
- 5.3-5.4 arasındaki adımları toplam iki kez olmak üzere bir kez daha yineleyin.
- Yıkadıktan sonra, 450 μL sıcak% 50 LWRN CM ekleyin (adım 1.3'te hazırlandığı gibi).
- Her bir oyuğa 50 μL 2.5 mg / mL LY (son konsantrasyon 0.25 μg / μL'dir, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve karıştırmak için yavaşça döndürün. 37 °C, %5 CO 2 inkübatöre2 saat bekletin.
- Her bir kuyucuktan enteroid/ortam süspansiyonunu nazikçe bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
- RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın, ardından enteroid peleti geride bırakarak süpernatanı çıkarın.
- Enteroidleri 500 μL ılık DPBS ile yıkayın.
- RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın, ardından enteroid peleti geride bırakarak süpernatantı çıkarın.
- Toplam dört yıkama için 5.10-5.11 arasındaki adımları üç kez daha yineleyin.
- Her peleti 1.000 μL soğuk DPBS ile yeniden askıya alın ve enteroidleri ayırmak için pipeti kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı doğru kuvvetlice uygulayın.
- DPBS cinsinden seyreltilmiş LY standart eğrisi için standartlar hazırlayın (100 ng / mL; 50 ng / mL; 25 ng / mL; 12.5 ng / mL; 6.25 ng / mL; 3.13 ng / mL; 1.57 ng / mL; 0 ng / mL).
- Pipet, 96 delikli bir plaka üzerinde üçlü olarak kuyucuk başına her numunenin 150 μL'si.
- Floresansı okuyabilen bir plaka okuyucuda 428 nm'lik bir uyarma zirvesinde ve 536 nm'lik bir emisyon zirvesinde floresanı ölçün (bkz. İstatistiksel yazılım kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu), standart eğriyi enterpolasyon yaparak ve dört parametreli bir eğri kullanarak konsantrasyonları hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AO konformasyonu
72 saat boyunca %50 LWRN ortamında asılı kalan enteroidler AO konformasyonu varsayar (Şekil 1). Bu, apikal proteinin enteroid bütün montajları, zonula oklüdens-1 (ZO-1) ve bazolateral protein, β-katenin (Şekil 1) kullanılarak immünofloresan boyama ile doğrulandı. AO enteroidleri, enteroidin dış, apikal yüzeyinde ZO-1 (yeşil) gösterirken, β-katenin (kırmızı) iç, bazolateral yüzeydedir (Şekil 1A). BO enteroidleri, dış yüzeyde β-katenin (kırmızı) ve iç, luminal yüzeyde ZO-1 (yeşil) ile tersini gösterir (Şekil 1B). Bu sonuçlar, deneyden önce enteroidlerin AO olduğunu doğrulamak için beklenen polarite tersine çevrilmesini göstermektedir.
LY tahlil sonuçları
NEC6'da LY boyasının enteroid lümene artan alımı ile gösterilen artan geçirgenlik beklenmektedir. LPS ve hipoksi ile tedavi edilen BO enteroidleri, bu protokolde açıklanan tekniği kullanarak tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla anlamlı derecede artmış geçirgenlik göstermiştir (Şekil 2A, **p = 0.005). Bu, NEC 4,13'ün BO enteroid modellerinde artan geçirgenliği tanımlayan literatürle aynı fikirdedir. Benzer şekilde, LPS ve hipoksi ile tedavi edilen AO enteroidleri, bir NEC modelinde beklendiği gibi, tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla geçirgenliğin önemli ölçüde arttığını göstermiştir (Şekil 3A, * p = 0.02). Tedavi edilen AO enteroidleri, tedavi edilmemiş kontrollere kıyasla tedavi edilen enteroidlerin lümeninde (Şekil 3C) LY alımının arttığını göstermiştir (Şekil 3B). Bu, LY'nin enteroid lümende görselleştirildiği BO enteroidlerinde görülene benzer (Şekil 2B). Enteroidin lümeninde artan LY boya alımı, tedavi edilen enteroidlerde floresanın artmasına neden olur ve farklı kuyucuklardan AO enteroidlerini kullanan bir mikroplaka okuyucu aracılığıyla kantitatif analize izin verir (Şekil 3A). Bu, LY kullanan bu tekniğin, 3D enteroidlerde geçirgenliği değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Sonuçlar, tedavi gruplarının LY konsantrasyonlarını belirlemek için standart bir eğriyi interpolasyon yapabilen istatistiksel yazılım kullanılarak analiz edilebilir. Bir Öğrencinin t-testi, Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterildiği gibi, gruplar arasındaki önemi belirlemek için kullanılabilir.
Şekil 1: AO konformasyonunun doğrulanması . (A) 20x büyütmede geleneksel polarite gösteren bazolateral çıkış (BO) enteroidine kıyasla ters polarite gösteren apikal-çıkış (AO) enteroid, ölçek çubuğu 100 μm'ye ayarlanmıştır. DAPI, mavi; beta-katenin (bazolateral protein), kırmızı; zonula oklüdenleri-1 (apikal protein), yeşil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir LY testi ile ölçülen in vitro NEC indüksiyonundan sonra bir BO enteroid modelinde artan geçirgenlik. (A) LPS ve hipoksi ile tedavi edilen bazolateral-out enteroidleri, lusifer sarı testi kullanılarak tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla geçirgenliği önemli ölçüde artırmıştır; hata çubukları ortalamanın standart hatasını gösterir; **p = 0,005. (B) Ortamın 10x büyütmede, 300 μm ölçek çubuğunda lusifer sarısı boya ile işlenmesini takiben lüsifer sarısı ile bazolateral çıkışlı enteroidlerin görüntüsü, lümende görselleştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bir LY testi ile ölçülen in vitro NEC indüksiyonundan sonra bir AO enteroid modelinde artan geçirgenlik. (A) LPS ve hipoksi ile tedavi edilen apikal-out enteroidleri, lusifer sarı testi kullanılarak tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla geçirgenliği önemli ölçüde artırmıştır; hata çubukları ortalamanın standart hatasını gösterir; *p = 0,02. (B) Tedavi edilmemiş kontrol apikal-çıkışı (AO) enteroidinin 10x'te temsili bir görüntüsü; ölçek çubuğu 100 μm'ye ayarlanır. (C) Bir LPS ve hipoksi ile tedavi edilmiş AO enteroidinin LY ile temsili bir görüntüsü, lümende 10x'te görselleştirilir; ölçek çubuğu 100 μm olarak ayarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan çözeltilerin, tamponların ve ortamların bileşimi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bağırsak geçirgenliği karmaşıktır ve epitel bariyer fonksiyonunu yansıtır. Bağırsak bariyeri, transsellüler ve parasellüler transporta aracılık eden tek bir epitel hücresi tabakasından oluşur14. Parasellüler geçirgenlik, epitel hücreleri arasındaki boşluğu kapatan sıkı bağlantı proteinlerine dayanır14. Bu parasellüler taşıma içinde, moleküllerin geçebileceği üç ayrı yol vardır: gözenek, sızıntı ve sınırsız15. Gözenek yolu, küçük yüklü iyonlara geçirgenliğe izin verirken, sızıntı yolu15 boyunca daha büyük, yüksüz moleküllere izin verir. Üçüncü, sınırsız yolak, epitel hasarına veya ölüme sekonder geçirgenliği yansıtır16. Parasellüler geçirgenliği değerlendirmek için birçok molekül kullanılmasına rağmen, molekülün tipi ve boyutu, hangi geçirgenlik yolunun araştırılacağını etkiler.
Küçük, hidrofilik bir molekül olarak LY, üç parasellüler yolun hepsinden geçebilir ve bu da onu parasellüler geçirgenliği incelemek için en uygun araç haline getirir. Buna karşılık, parasellüler geçirgenliğin bir belirteci olarak kullanılan bir şeker molekülü olan 4 kDa FITC-dextran, yalnızca sızıntıyı ve sınırsız yolları geçebilir. Daha büyük, 70 kDa FITC-dextran sadece sınırsız yol ile sınırlıdır. Parasellüler geçirgenliği belirlemenin bir başka yöntemi, tek katmanlar arasında elektriksel direnci ölçen transepitelyal direnç ölçümleridir (TEER). Bu yöntem sadece gözenek yolu17'yi ölçer. Böylece, LY, üç yolun tümünü hedefleyerek genel parasellüler geçirgenlik hakkında daha fazla bilgi sağlar. Bu protokol, parasellüler geçirgenliği incelemek için LY kullanarak bundan yararlanır.
Enteroid model, çalışmak için bir 3D mini bağırsak oluşturarak in vivo koşulları daha yakından taklit ettiği için bu protokolde seçildi. Bununla birlikte, geleneksel BO enteroid modelindeki zorluk, konakçı-patojen etkileşimlerini ve sonraki geçirgenlik değişikliklerini incelemek için apikal yüzeye nasıl erişileceğidir. AO enteroid modeli, apikal yüzeyin çevreleyen ortamla temas halinde olduğu polariteyi tersine çevirerek bu zorluğun üstesinden gelir. Enteroidlerin apikal yüzeyine erişmenin birkaç alternatif yöntemi tanımlanmıştır. Bunlar arasında bağırsak-çip sistemleri, mikroenjeksiyon, parçalanma ve tek katmanlı18,19'da büyüyen enteroidler bulunur. Bağırsak-çip sistemlerindeki ilerlemeler, organoidlerin ve endotel hücrelerinin vaskülarite ve peristalsis bağlamında birlikte kültürlenmesinin bağırsak ortamını taklit etmesine izin vermiştir18. Mikroenjeksiyon, bir mikromanipülatör ve mikroenjektör19 gibi özel ekipmanların kullanılmasıyla BO enteroid lümenine enjeksiyonu içerir. Parçalanma, enteroidlerin tek hücrelere ayrışmasını kullanır ve daha sonra bir 3Dyapıyı reforme etmeden önce patojenle birlikte inkübe edilir. Enteroidlerin apikal yüzeyin daha sonra işlenmesiyle 2D monokatmanlara dönüşümü de tanımlanmıştır19. AO enteroid modeli, pahalı ekipman gerektirmeden veya enteroidin yapısal bütünlüğünden ödün vermeden apikal yüzeyi açığa çıkarmak için basit ve etkili bir yol sağlayarak bu modellerin bazı zorluklarını ele alır.
Bir AO modelinde LY kullanmak, konakçı-patojen etkileşimlerine sekonder parasellüler geçirgenliğin geniş bir çalışmasına izin vermesine rağmen, bu protokol BO enteroidleri ve LY yerine FITC-dextran ile kullanılmak üzere uyarlanabilir. BO enteroidleri için kullanılmak üzere değiştirmek için bu protokolde iki önemli değişiklik yapılması gerekmektedir. İlk olarak, BO enteroidleri, LY eklemeden önce ve sonra tüm yıkama adımları için BMM kubbelerinde muhafaza edilebilir. BMM kubbesinin çözünmesini önlemek için bu yıkama adımları için 37 ° C'ye ısıtılmış çözeltilerin kullanılması önemlidir. İkincisi, BMM kubbesinin soğuk DPBS ile bozulması ve ayrışmış enteroidlerin ve LY'nin tamamen yeniden süspansiyonuna izin vermek için tüm yıkama adımları tamamlandıktan sonra kuyunun bir pipet ucu ile kazınması gerekir. FITC-dextran LY ile değiştirilirse, üç parasellüler yoldan ikisinden geçerken 4 kDa molekülünün kullanılması önerilir.
Bu protokoldeki temel adımlar, enteroid dışındaki çözeltiden herhangi bir iz LY'yi çıkarmak için yeterli yıkamanın sağlanmasını içerir. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak nicelleştirmeye hazır olana kadar LY'nin ayrışmasını ve lümenden çevredeki çözeltiye potansiyel olarak salınmasını önlemek için enteroidlerin nazikçe yıkanması da önemlidir. Yıkama adımları sırasında ısıtılmış çözeltilerin kullanılması da enteroidler üzerindeki stresi azaltır. Soğuk çözeltiler kullanılırsa, enteroidler apoptoza uğrayabilir ve bu da yanlış sonuçlara yol açabilir.
Bu yöntemin sınırlamaları, polariteyi tersine çevirmek için gereken ek 72 saat nedeniyle AO enteroidlerinin yayılamaması ve daha uzun kültürleme sürelerini içerir. Tedavi edilen AO enteroid sayısında kontrollere göre %2-%5 oranında azalma vardır. Bu genel olarak ihmal edilebilir olsa da, sonuçların hafife alınmasına neden olabilir. LY kullanımının sınırlamaları, eser miktarların transsitoz20 yoluyla bağırsak epitel bariyerini geçebildiği 4 kDa FITC-dextran gibi diğer geçirgenlik moleküllerine benzer. Bu miktar ihmal edilebilir olmasına rağmen, sonuçları etkileyebilir. Bu bulgulara dayanarak, AO enteroidlerinin ortamına LY uygulamak, bir 3D modelde parasellüler bağırsak geçirgenliğini nicel ve nitel olarak analiz etmek için zarif ve nispeten basit bir yol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu makalede bahsedilen herhangi bir üründe veya kavramda mülkiyet veya ticari çıkar sağlamadıklarını bildirmektedir.
Acknowledgments
Rochester Üniversitesi Tıp Merkezi'nden Ashley Nelson'a enteroid modelimize verdiği araçsal yardım için teşekkür ederiz. Oklahoma Üniversitesi Çocuk Cerrahisi Bölümü'ne de bu projeye verdikleri destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Yetişkin Kök Hücre Araştırmaları Merkezi ve Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Cerrahi Bölümü'ne verilen Presbiteryen Sağlık Vakfı Hibe #20180587 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
