Summary
Метастазы в мозг являются причиной тяжелой заболеваемости и смертности у онкологических больных. Большинство моделей метастазирования в мозг у мышей осложняются системными метастазами, смешивающими анализ смертности и результатов терапевтического вмешательства. Здесь представлен протокол внутренней каротидной инъекции раковых клеток, который продуцирует последовательные внутричерепные опухоли с минимальными системными опухолями.
Abstract
Метастазы в мозг являются причиной тяжелой заболеваемости и смертности у онкологических больных. Критические аспекты метастатических заболеваний, такие как сложное нервное микроокружение и взаимодействие стромальных клеток, не могут быть полностью воспроизведены с помощью анализов in vitro ; таким образом, животные модели имеют решающее значение для исследования и понимания эффектов терапевтического вмешательства. Тем не менее, большинство методов ксенотрансплантации опухолей головного мозга не производят метастазы в мозг последовательно с точки зрения временных рамок и опухолевой нагрузки. Модели метастазирования в мозг, генерируемые внутрисердечной инъекцией раковых клеток, могут привести к непреднамеренной экстракраниальной опухолевой нагрузке и привести к метастатической заболеваемости и смертности вне мозга. Хотя внутричерепная инъекция раковых клеток может ограничить образование экстракраниальной опухоли, она имеет несколько предостережений, таких как введенные клетки часто образуют единичную опухолевую массу в месте инъекции, высокое поражение лептоменингеала и повреждение сосудистой системы мозга во время проникновения иглы. Этот протокол описывает мышиную модель метастазирования в мозг, генерируемого инъекцией внутренней сонной артерии. Этот метод последовательно продуцирует внутричерепные опухоли без участия других органов, что позволяет оценить терапевтические агенты для метастазирования в мозг.
Introduction
Метастазирование в мозг является распространенным злокачественным новообразованием, связанным с очень плохим прогнозом 1,2. Стандартом лечения пациентов с метастазами в мозг является мультимодальный подход, состоящий из нейрохирургии, лучевой терапии всего мозга и / или стереотаксической радиохирургии в зависимости от общего состояния здоровья пациентов, бремени экстракраниальных заболеваний, а также количества и расположения опухолей в головном мозге 3,4. Пациенты с тремя внутричерепными поражениями имеют право на хирургическую резекцию или стереотаксическую радиохирургию, в то время как лучевая терапия всего мозга рекомендуется для пациентов с множественными поражениями, чтобы избежать риска инфекции, связанной с хирургическим вмешательством, и отека5. Однако лучевая терапия всего мозга может нанести ущерб радиочувствительным структурам мозга, способствуя низкому качеству жизни6.
Системная терапия является неинвазивным альтернативным и логическим подходом к лечению пациентов с множественными поражениями7. Тем не менее, это менее рассматривается из-за давнего представления о том, что системная терапия имеет низкую эффективность, потому что пассивная доставка цитотоксических препаратов через кровоток не может достичь терапевтических уровней в мозге без риска небезопасной токсичности8. Эта парадигма начинает меняться с недавно одобренной Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) системной терапией (тукатиниб с трастузумабом и капецитабином, показанным для метастатического метастазирования рака молочной железы HER2 + в мозг)9,10,11,12 и обновлением руководящих принципов лечения, чтобы включить рассмотрение вариантов системной терапии для пациентов с метастазами в мозг13,14.
В этом контексте разработки в области молекулярной таргетной терапии, иммунотерапии и альтернативных систем доставки лекарств, таких как целевой нанопрепарат, могут потенциально преодолеть проблемы лечения метастазов в мозг 15,16,17,18. Кроме того, химические и механические подходы к улучшению доставки лекарств путем пермеабилизации барьера опухоли головного мозга также исследуются19,20. Чтобы изучить и оптимизировать такие подходы, чтобы они соответствовали цели, крайне важно использовать доклинические модели, которые не только отражают сложную физиологию метастазирования в мозг, но и позволяют объективно анализировать внутричерепную реакцию на лекарства.
В целом, современные подходы к моделированию метастазирования в мозг in vivo включают внутрисердечную (левый желудочек), внутривенную (обычно хвостовую вену), внутричерепную или внутрикаротидную (общая сонная артерия) инъекцию раковых клеток у мышей 21,22,23,24,25,26,27 . Помимо стратегий приживления опухоли, генетически модифицированные мышиные модели, где образование опухоли запускается удалением генов-супрессоров опухолей или активацией онкогенов, полезны для моделирования опухолей. Тем не менее, только несколько генетически модифицированных моделей мышей, как сообщается, производят вторичные опухоли и еще меньше, которые надежно производят метастазы в мозг 28,29,30.
Методы приживления, такие как внутрисердечная (левый желудочек) и внутривенная (обычно хвостовая вена) инъекции, имитируют системную диссеминацию рака. Эти модели обычно вызывают поражения в нескольких органах (например, мозге, легких, печени, почках, селезенке) в зависимости от капиллярного русла, которое захватывает большинство опухолевых клеток во время их циркуляторного «первого прохода»31. Однако непоследовательные темпы приживления мозга потребуют большего количества животных для достижения размера выборки для желаемой статистической мощности. Количество опухолевых клеток, которые в конечном итоге устанавливаются в мозге с помощью этих внутрисердечных и внутривенных методов инъекций, варьируется. Следовательно, метастазна в мозг опухолевая нагрузка может варьироваться между животными, и разница в прогрессировании может сделать стандартизацию экспериментальной временной шкалы и интерпретацию результатов проблемой. Экстракраниальная опухолевая нагрузка может привести к смертности от метастазов вне мозга, что делает эти модели непригодными для оценки внутричерепной эффективности. Линии клеток мозг-тропики были установлены с использованием искусственных процессов клонального отбора для уменьшения экстракраниального учреждения, но показатели приема были непоследовательными, и процесс клонального отбора может уменьшить гетерогенность, обычно встречающуюся в опухолях человека32.
Специфические для мозга методы приживления, такие как внутричерепная и внутрикаротидная инъекция, позволяют более последовательно и эффективно моделировать метастазы в мозг. В внутричерепном методе33 раковые клетки обычно вводят в лобную кору головного мозга, которая генерирует быстрый и воспроизводимый рост опухоли с низким системным участием. Хотя процедура хорошо переносится с низкой смертностью33, предостережения заключаются в том, что это относительно грубый подход, который быстро вводит (локализованный) болюс клеток в мозг и не моделирует патогенез ранних метастазов в мозг. Игла повреждает сосудистую ткань мозга, что затем вызывает локализованное воспаление 5,34. По опыту, существует тенденция к инъекции опухолевых клеток к рефлюксу во время удаления иглы, что приводит к лептоменингеальному вовлечению. Альтернативно, внутрикаротидный метод доставляет клетки в общую сонную артерию с микроциркуляторным руслом мозга в качестве первого капиллярного русла, с которым можно столкнуться, моделируя выживание в циркуляции, экстравазацию и колонизацию24. В соответствии с другими25, наш опыт работы с этим методом показал, что он может привести к опухолям лица из-за непреднамеренной доставки раковых клеток через наружную сонную артерию в капиллярные ложа в этих тканях (неопубликованные данные). Предотвратить опухоли лица можно, предварительно перевязав наружную сонную артерию перед инъекцией общей сонной артерии (рисунок 1). В остальной части статьи этот метод упоминается как «инъекция внутренней сонной артерии». Исходя из опыта, метод инъекции внутренней сонной артерии последовательно генерирует метастазы в мозг с очень небольшим количеством системных событий и был успешным в создании моделей метастазирования в мозг различных первичных видов рака (например, меланомы, рака молочной железы и легких) (рисунок 1). Недостатки заключаются в том, что это технически сложно, трудоемко, инвазивно и требует тщательной оптимизации количества клеток и графика мониторинга. Таким образом, как внутричерепные, так и внутренние методы инъекций сонной артерии создают мышиные модели, подходящие для оценки терапевтического воздействия на выживаемость, связанную с опухолью головного мозга.
Этот протокол описывает метод инъекции внутренней сонной артерии для получения мышиной модели метастазирования в мозг почти без системного участия и, следовательно, подходит для доклинической оценки распределения лекарств и эффективности экспериментальных терапевтических средств.
Рисунок 1: Схематическое изображение протокола инъекции внутренней сонной артерии для метастазирования в мозг. Инъекция внутренней сонной артерии с перевязкой наружной сонной артерии может надежно производить модель метастазирования в мозг от различных первичных видов рака. В этом протоколе три лигатуры помещаются на сонную артерию (на рисунке аннотируется как L1-L3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике животных Университета Квинсленда (UQCCR/186/19) и Австралийским кодексом по уходу за животными и их использованию в научных целях.
1. Подготовка раковых клеток к инъекциям
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовалась клеточная линия рака молочной железы человека, BT-474 (BT474). BT474 культивировали в полной питательной среде, содержащей среду RPMI 1640, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% инсулином. Клетки поддерживали в инкубаторе при 37 °C с 5% углекислого газа в атмосфере воздуха. Аутентифицировать клеточную линию с помощью спутникового тандема повторяет тестирование35, подтвердить экспрессию репортерного белка (например, люциферазы), если таковой имеется, и проверить на микоплазменную инфекцию.
- Семена раковых клеток BT474 при плотности посева 2,0 х 106 клеток в колбу T75 с использованием 10 мл полной питательной среды и культуры (при 37 °C с 5% CO2) до 70%-80% конфлюции до инъекции.
- В день инъекции отбросьте питательную среду и дважды промывайте клеточный монослой фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
- Добавляют 5 мл реагента диссоциации предварительной клеточной культуры (см. Таблицу материалов) и инкубируют при 37 °C в течение 5 мин или до тех пор, пока клетки не отделятся. Через 5 минут осторожно постучите по колбе, чтобы помочь отсоединению клеток.
- Добавьте 5 мл полной питательной среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, чтобы погасить активность реагента диссоциации.
- Осторожно повторно суспендируйте клетки путем пипетирования, чтобы уменьшить сгустки клеток.
- Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл и центрифугу при 180 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте гранулу клетки в 10 мл сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS) без кальция и магния, чтобы свести к минимуму слипание клеток.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 180 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Декантировать супернатант для удаления остаточного реагента сыворотки/диссоциации и повторного суспендирования клеточной гранулы в 3 мл HBSS.
- Поместите клеточный ситечко 100 мкм на свежую коническую трубку объемом 50 мл и пропустите клеточную суспензию, чтобы удалить клеточные сгустки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одноклеточная суспензия необходима для минимизации окклюзии кровеносных сосудов и риска инсульта при инъекции. - Рассчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью исключения Trypan Blue и гемоцитометра стандартными методами.
- Разбавляют клеточную суспензию HBSS до клеточной концентрации 2,5 х 106 клеток/мл.
- Держите трубку горизонтально на льду и осторожно периодически раскачивайте трубку, чтобы свести к минимуму слипание. Клеточная суспензия может храниться на льду не более 6 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раскачивание было сделано вручную, но это также может быть сделано с помощью шейкера на низких оборотах.
2. Подготовка мыши к процедуре
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании в возрасте 4-5 недель использовались самки мышей NOD scid. Введите мягкую диетическую восстановительную пищу (например, диетический гель, гидрогель, пюре из мышиного чау) мышам за 3 дня до процедуры, чтобы стимулировать кормление после процедуры.
- Автоклавные хирургические инструменты. Распылите и протрите хирургическую область и оборудование дезинфицирующим средством для поверхности, а затем 70% этанолом.
- Поместите тепловой коврик животного под хирургическую доску, чтобы предотвратить переохлаждение. Включите его за 30 минут до операции. Распылите и протрите хирургическую доску дезинфицирующим средством для поверхности, а затем 70% этанолом.
- Подготовьте чистую клетку для содержания животных и теплую грелку для восстановления.
- Наденьте чистые средства индивидуальной защиты (халат, маску, сетку для волос, перчатки). Поддерживайте стерильность на протяжении всей процедуры, используя чистые смотровые перчатки и технику «только наконечники инструментов».
- Обезболивают мышь анестезирующей камерой с использованием 5% изофлурана с потоком кислорода 2 л/мин до тех пор, пока мышь не потеряет педальный рефлекс.
- Выньте животное из камеры и поместите его в носовой конус, доставляющий 2% изофлурана при потоке кислорода 2 л /мин для оставшейся хирургической процедуры.
- Ушной перфоратор мыши для идентификации и использования электрических кусачек для бритья меха из области шеи. Очистите лишние волосы от открытой кожи с помощью ленты.
- Взвесьте мышь для расчета необходимых доз анестетика и анальгетика. Вводят бупренорфин и мелоксикам по 50 мкг/кг и 1 мг/кг соответственно через подкожную инъекцию.
- Перенесите мышь на теплую хирургическую доску и закрепите носовой конус скотчем.
- Нанесите глазную смазку на глаза, чтобы предотвратить пересыхание.
- Осторожно закрепите мышь, сначала зацепив верхние резцовые зубы с помощью резьбы, приклеенной к хирургической доске, а затем заклеив передние и задние ноги. Этот шаг расширяет тело и держит шею прямой во время процедуры.
- Выполните предоперационную подготовку кожи, как описано ниже.
- Протрите шею местным антисептиком (повидон-йод) для снижения нагрузки микрофлоры кожи и удаления распущенных волос. Очищайте от центра кожи, действуя наружу, чтобы предотвратить повторное загрязнение места разреза. Повторите процесс, используя 70% этанола. Выполните три чередующихся раунда йода и этанола для дезинфекции.
- Наложите хирургическую драпировку на животное. Это вырезано и изготовлено из куска стерильного бумажного полотенца или автоклавного пакета.
- Разложите стерильные бумажные полотенца или автоклавные пакеты для хирургических инструментов.
- Проверьте рефлекс с помощью «Пинч-теста», чтобы обеспечить достаточную анестезию перед продолжением процедуры.
3. Внутренний впрыск сонной артерии
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте для облегчения процедуры инъекции использовалась инфузионная канюля весом 31 г и активированная ногами установка драйвера шприца (дополнительный рисунок 1). Эта настройка является необязательной, и пользователь может использовать шприц инсулина 31 G и пропустить шаги 3.11 и 3.12. Чтобы приготовить инфузионную канюлю, потяните и отделите часть иглы от шприцевой части иглы весом 31 г с помощью двух пар шовных зажимов. Затем прикрепите часть иглы к одному концу тонкой инфузионной трубки длиной около 10 см.
- Поместите рассеченный микроскоп над мышью.
- С помощью ножниц сделайте вертикальный разрез 15 мм вдоль средней линии в области шеи, начиная с 5 мм ниже челюсти до грудного входа.
- Используя две пары угловых щипцов, разделите кожу и подлежащие слюнные железы и нанесите ретракторы, чтобы держать трахею открытой. Следующим шагом будет обнажена сонная оболочка, которая лежит параллельно трахее.
- Используя две пары тонкоугольных щипцов, тупо рассекают мышечную и жировую ткань, прилегающую к трахее, чтобы обнажить правую сонную оболочку. Сонная оболочка представляет собой фиброзный слой, покрывающий общую сонную артерию, вену и блуждающий нерв, и этот пучок можно визуализировать ярко-красной общей сонной артерией. В этом исследовании инъекция выполнялась в правую сонную артерию.
- Очистите сегмент общей сонной артерии каудально до каротидной бифуркации окружающей фасции и отделите ее от блуждающего нерва и вен.
- Изолируют и очищают бифуркацию сонной артерии (соединение, которое соединяет наружные и внутренние сонные артерии) от окружающих нервов и фасций. Расположите тонкие щипцы под наружной сонной артерией и проведите шелковый шов (5-0 толщины) под артерией. Завяжите узел и затяните шов и отрежьте лишнюю линию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта лигатура (L1) предотвратит прохождение инъекции через наружную сонную артерию. - Расположите тонкие щипцы под общей сонной артерией и пройдите шелковым швом (5-0 толщины) под артерией. Завяжите узел и затяните шов в положении, близком к предполагаемому месту инъекции. Отрежьте лишний шов, оставив около 10 мм линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта вторая лигатура (L2) будет ограничивать кровоток и кровотечение после инъекции. Он также используется для позиционирования и удержания сонной артерии во время инъекции. - Вырежьте и смочите полоску (автоклавных) низковорсовых одноразовых стеклоочистителей (см. Таблицу материалов) размером около 10 мм х 5 мм. Сложите полоску в 4 мм х 5 мм, толщиной 2-3 мм, и поместите ее под сонную артерию в предполагаемом месте инъекции. Это будет поддерживать сосуд во время инъекции.
- На ростральную к предполагаемому месту инъекции общую сонную артерию поместить третью перевязку (L3) со рыхлым узлом. Это затягивается только после инъекции (на шаге 3.16).
- Осторожно перемешайте клеточную суспензию и втяните 200 мкл клеточной суспензии в инсулиновый шприц (с иглой 31 г).
- Загрузите шприц в драйвер шприца, который подключен к активирующей ножной педали.
- Прикрепите к шприцу тонкую канюлю с иглой 31 G и загрунтуйте линию.
- Проверьте, хорошо ли расположена сонная артерия и находится под давлением.
- Используя два тонкоугольных щипца, один из которых мягко натягивается на конец первой лигатуры, а другой удерживает иглу 31 G, медленно вставьте иглу со скосом вверх в просвет кровеносного сосуда, стараясь не проколоть ее.
- Медленно вводят 100 мкл клеточной суспензии (со стадии 1.13) в общую сонную артерию со скоростью 10 мкл/с. Это доставит 2,5 х 105 клеток в кровеносный сосуд. Успешная инъекция визуализируется через очистку крови от сонного кровеносного сосуда.
- Осторожно поднимите и затяните свободную лигатуру (L3) (с шага 3.9) сразу после извлечения иглы, чтобы предотвратить обратный поток и кровотечение. Обрежьте лишний шов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормально наблюдать небольшое количество брызг крови после снятия иглы. Тем не менее, не должно быть никакого активного кровотечения после того, как третья лигатура будет подтянута. - Снимите кусок увлажненных низковорсовых одноразовых стеклоочистителей.
- Используя пипетку P200, дважды промойте хирургическую полость 150-200 мкл стерильной воды или физиологического раствора.
- Проверьте еще раз кровотечение, а затем удалите втягивающие устройства.
- Перепозиция мягких тканей, слюнных желез и кожи над сонной артерией и трахеей.
- Закройте слой кожи разреза с помощью держателя шовной иглы, щипцов и рассасывающегося или нерассасывающегося монофиламентного шва 6/0 в непрерывном режиме.
- Выбросьте шприц из иглы канюли и подготовьте новую установку для следующей мыши. Использование нового шприца гарантирует, что количество клеток, вводимых в каждую мышь, будет постоянным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные снимки процедуры приведены на дополнительном рисунке 2. Если сосуд проколот или разорван иглой, о чем свидетельствует утечка инъекционного препарата или кровотечение, процедура считается неудачной. После этого иглу необходимо изъять, а третью лигатуру немедленно подтянуть, чтобы предотвратить дальнейшее кровотечение. Если кровотечение является стойким после затягивания шва, животное необходимо усыпить пентобарбиталом.
4. Восстановление после инъекции
- Инъекции бупренорфина (50 мкг/кг) и мелоксикама (1 мг/кг) через подкожную инъекцию в качестве послеоперационного обезболивания.
- Переместите животное в теплую и чистую клетку, чтобы восстановиться после анестезии. Для животного нормально иметь приглушенную активность (сгрудившуюся и неактивную или медленно перемещающуюся) после пробуждения.
- Через 30-45 мин переведите мышей в учреждение длительного содержания.
- Обеспечьте мышам мягкую диету (диетический гель, гидрогель, пюре) в течение не менее недели после операции и ежедневно проверяйте физическое состояние с особым вниманием на наличие признаков инсульта, инфекции, кровотечения вокруг места раны.
- Через два дня после операции для животного характерно снижение активности, легкая взъерошенная шерсть и потеря 15% предоперационной массы тела. Вводите анальгетик (мелоксикам) ежедневно в течение 2-3 дней после операции, чтобы справиться с болью и помочь восстановлению.
- Начиная с 3-го дня, животные должны восстановить активность, увеличить частоту кормления и ухода, а также восстановить вес. Усыпляйте животных с сохраняющимся дефицитом физического состояния (боль, сгрудивание, неактивность, потеря веса) через 4 дня после операции путем введения пентобарбитала натрия в 200 мг / кг через внутрибрюшинную инъекцию.
- Приживление и прогрессирование опухоли можно контролировать с помощью анестезии и методов визуализации по выбору, таких как биолюминесцентная визуализация, МРТ или ПЭТ / МРТ. Потребность и способность проводить такую визуализацию будут по своей сути зависеть от индивидуальных целей проекта и объекта, в рамках которого она осуществляется, и в зависимости от типа репортерной метки используемых клеточных линий, доступности соответствующих установок радиохимии и ядерной визуализации36,37
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые животные могут плохо реагировать и испытывать инсульт, несмотря на успешную процедуру. После процедуры животные, у которых присутствуют какие-либо симптомы неврологического дистресса (поворот головы и потягивание в одну сторону, круговое поведение, перекатывание, метание, потеря двигательной функции), должны быть немедленно усыплены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сравнение общей инъекции сонной артерии с перевязкой наружной сонной артерии или без нее
Когда раковые клетки вводили через общую сонную артерию без предварительного перевязки наружной сонной артерии24, опухоли лица были обнаружены у 77,8% трансплантированных мышей (n = 7/9 животных). Пример опухоли лица проиллюстрирован на дополнительном рисунке 3. Метод, описанный в этом протоколе, предотвращает непреднамеренное метастазирование в лицо путем перевязки наружной сонной артерии перед общей сонной артерией.
Чтобы сравнить два метода, лектин вводили в общую сонную артерию выбракованных мышей с перевязкой наружной сонной артерии или без нее. Затем лицевая ткань и мозг фиксировались, обрабатывались и наблюдались под флуоресцентным микроскопом. Снижение лектина наблюдалось при иммунофлуоресцентном анализе в тканях щек при перевязке наружной сонной артерии (рисунок 2А-В). Результаты также показывают, что перевязка наружной сонной артерии не повлияла на доставку мозга, потому что лектин можно наблюдать в мозговой ткани мышей, которые подверглись общей инъекции сонной артерии с перевязкой наружной сонной артерии (рисунок 2C-D). Таким образом, этот дополнительный шаг может направить доставку раковых клеток через внутреннюю сонную артерию в мозг с минимальным посевом в лицевую ткань.
Рисунок 2: Внутрикаротидный трансплантат с перевязкой наружной сонной артерии и без нее. Флуоресцентная визуализация правой щечной мышцы (A,B) и мозга (C,D) мышей с лектином (зеленым), доставленным в общую сонную артерию, либо с (A,C), либо без (B,D) внешней перевязки сонной артерии. Щека и мозг были изображены при 20-кратном и 5-кратном увеличении, а шкала представляет собой 50 и 200 мкм соответственно. Ядра (синие) были окрашены DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Биолюминесцентный мониторинг
HER2-амплифицированная клеточная линия рака молочной железы, BT474, которая была генетически модифицирована для экспрессии люциферазы, использовалась в этом исследовании, чтобы обеспечить еженедельный мониторинг прогрессирования опухоли путем введения люциферина и выполнения биолюминесцентной визуализации in vivo . В этой модели метастазирования BT474 в мозг биолюминесцентные сигналы могут наблюдаться на 5-й неделе после инъекции внутренней сонной артерии и постепенно увеличивались по интенсивности с течением времени (рисунок 3).
Рисунок 3: Биолюминесцентный мониторинг и количественная оценка сигнала биолюминесценции. Репрезентативные еженедельные биолюминесцентные изображения с 0-й по 7-ю неделю показывают растущую интенсивность, исходящую от головы. На графике показана количественная оценка биолюминесцентных сигналов у мышей. Данные являются средствами ± стандартной погрешности (n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Магнитно-резонансная томография (МРТ)
Модель метастазирования в мозг на животных была получена с использованием Т2-взвешенной МРТ на 2, 5 и 8 неделе для оценки прогрессирования внутричерепной опухоли. С 5 по 8 неделю может наблюдаться область с гетерогенной интенсивностью сигнала, что указывает на внутричерепную опухоль со сложной перфузией жидкости, предположительно из нарушенной сосудистой системы опухоли (рисунок 4А). Гематоэнцефалический барьер в модели метастазирования в мозг нарушается и напоминает клиническое метастазирование в мозг. Это оценивалось с использованием усиления контраста гадолиния с последующей Т1-взвешенной последовательностью МРТ. Концентрация гадолиния в области опухоли увеличивается по мере его утечки из кровообращения в опухолевую ткань. Это иллюстрируется затемненной областью, представляющей сокращение времени релаксации Т1 (рисунок 4B). Полученные данные могут быть использованы для корреляции доступа препарата к гематоэнцефалическому барьеру. Кроме того, объем и площадь поверхности внутричерепной опухоли могут быть получены путем выполнения объемной сегментации с использованием программного обеспечения для анализа изображений 3D Slicer (рисунок 4C). Это может быть нанесено на график со временем, чтобы отслеживать рост опухоли головного мозга.
Рисунок 4: Характеристика модели метастазирования в мозг на животных с использованием магнитно-резонансной томографии. (A) Т2-взвешенное поперечное, корональное и сагиттальное сканирование модели на 1, 5 и 8 неделях. На 5-й неделе на сагиттальном снимке (красная стрелка) можно увидеть слабую пятнистую область, которая к 8-й неделе превратилась в гиперинтенсивную и гетерогенную область. (B) Динамическая контрастно-усиленная Т1-взвешенная МРТ, показывающая опухоль головного мозга (область красного цвета) до и после инъекции агента контрастного усиления гадолиния (CE). Темные области указывают на утечку и поглощение гадолиния. (C) Опухоль, визуализированная на корональной, поперечной и сагиттальной плоскостях, была аннотирована и сегментирована с использованием программного обеспечения для анализа изображений 3D Slicer для получения внутричерепного объема опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
ПЭТ/МР визуализация для определения биораспределения наномедицины
Сочетание нарушенного гематоэнцефалического барьера и протекающей сосудистой системы опухоли облегчает пассивное поглощение и накопление наноразмерных терапевтических средств за счет повышения проницаемости и эффектаудержания 36,37. Поскольку модель метастазирования в мозг BT474 чрезмерно экспрессирует HER2, было выполнено поглощение мозгом цирконий-89-таргетной наномедицины, нацеленной на HER2, с использованием позитронно-эмиссионной томографии / магнитно-резонансной томографии (ПЭТ / МРТ) (рисунок 5). В когорте мышей BT474 BM наномедицина, обнаруженная в области опухоли, была выше, чем в невовлеченных областях мозга, что подтверждает накопление наномедицины в метастазах в мозг.
Рисунок 5: Репрезентативное ПЭТ/МР изображение циркония-89 с маркировкой HER2-таргетной наномедицины (89Zr-HER2-NM) у мышей с метастазами в мозг BT474. (A) На левом изображении Т2-весовая МРТ (корональный вид), показывающая опухоль головного мозга (красная область) и невовлеченный мозг (синяя область). На двух смежных изображениях изображены изображения МРТ (корональный и поперечный вид), наложенные наложенным ПЭТ-наложением. Цветное наложение ПЭТ показывает, что опухолевая область имеет более высокое поглощение наномедицины (белый, красный, желтый) по сравнению с невовлеченными областями (синий / зеленый). (B) График иллюстрирует увеличение интенсивности сигнала ПЭТ и поглощения наномедицины (введенная доза на грамм, ID/ г) в опухолях головного мозга по сравнению с невовлеченным мозгом (n = 12). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Выживаемость и физическое состояние моделей БМ
Модель метастазирования в мозг BT474 пережила в среднем 9 недель после инъекции (рисунок 6). По мере прогрессирования метастазов в мозг животные начали терять до 20% массы тела, что затем требовало эвтаназии (между 6-9 неделей). При поздних стадиях метастазов в мозг общие проявления включают взъерошенный мех и выпуклые и куполообразные черепа. Животные часто были неактивны, сгрудились и демонстрировали функциональный дефицит моторики и силы.
Рисунок 6: Кривая Каплана Мейера модели метастазирования в мозг BT474 мыши. Медиана выживаемости составила 9 недель после инъекции (n = 18). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Гистология
После эвтаназии животных перфузили 4% раствором параформальдегида для сохранения архитектуры гистологии мозга40. Впоследствии мозг и другие органы были обработаны, разделены и окрашены гематоксилином и эозином (H & E). В этой модели метастазирования в мозг опухоли были расположены в одностороннем порядке, что соответствует стороне инъекции сонной артерии (рисунок 7A). Опухоли BT474 появились в основном в виде твердых одиночных масс, в некоторых случаях затрагивающих почти половину полушария головного мозга (рисунок 7B). Часто наблюдались карманы пустых пространств, состоящие из некротических клеток (рисунок 7C). Более мелкие выросты также присутствовали у некоторых животных (рисунок 7E). Иммуногистохимическое окрашивание показывает, что метастазы в мозг BT474 экспрессируют сильные HER2 и HER3, предполагая, что эта модель подходит для HER2- и HER3-таргетной терапии (рисунок 7F).
Рисунок 7: Гистология головного мозга модели метастазирования в мозг BT474. (A) Репрезентативный участок мозга мыши BT474 BM; цветные поля обозначали увеличенные области интереса. Шкала бара = 2 мм. (B) Твердая опухоль, содержащая массу эпителиоидных клеток. (C) Некротические клетки в пространстве. (D) Интерфейс опухоль-мозг (E) Небольшие выросты, известные как микрометастазы. (Шкала B-E = 200 мкм). (F) Иммуногистохимические изображения, показывающие положительность HER2 и HER3 и соответствующие гематоксилин и эозин (H&E). Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Системное вовлечение
Опухолей в срезах тканей других органов не наблюдалось (рисунок 8). Этот вывод согласуется с биолюминесцентными данными, где биолюминесценция была обнаружена только у голов животных. Вместе результаты показали, что эта модель не связана с обнаруживаемыми системными опухолями.
Рисунок 8: Гистология других органов. Не было явного поражения опухоли в обследованных органах: кости, печень, почки, поджелудочная железа, легкие, сердце, селезенка, кишечник и яичники. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Канюля-шприц для инъекций внутренней сонной артерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Снимки процесса инъекции внутренней сонной артерии. Описание изображения приведено в дополнительной таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Т2-взвешенная МРТ, показывающая большую внутримышечную опухоль в правой ткани лица (очерченная красным цветом). H&E-окрашенный участок ткани обнаруживает плотно упакованные опухолевые клетки. Шкала = 2 мм (в центре) и 100 мкм (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Пошаговое описание инъекции внутренней сонной артерии на дополнительном рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метастазирование в мозг представляет собой сложный процесс распространения раковых клеток от их первичного участка к мозгу. Доступны различные модели на животных, которые отражают определенные этапы этого многоступенчатого процесса, и существуют физиологические и практические соображения для разработки доклинических исследований метастазирования41,42. В большинстве опубликованных исследований, изучающих использование наномедицины для лечения метастазов в мозг, использовались внутрисердечные 43,44 и внутричерепные 45,46,47,48,49 модели. Пересадка раковых клеток через сонную артерию может лучше рекапитулировать метастатический процесс и патобиологию метастазов в мозг.
Однако, исходя из опыта, обычная техника инъекций сонной артерии привела к тому, что у нескольких животных были значительные опухоли лица в ранние моменты времени. У животных с активными опухолями головного мозга и лица наблюдалось, что опухоли лица растут быстрее в размерах, чем опухоли головного мозга. Это может быть связано с более васкуляризированным микросредой, которая поддерживает рост опухоли (дополнительный рисунок 3).
Общая сонная артерия поставляет кровь в лицевую область и мозг через наружные и сонные артерии соответственно. Следовательно, по согласованию с другими25, инъекция раковых клеток через общую сонную артерию приведет к посеву в обеих областях. Можно предотвратить опухоли лица, сначала перевязав наружную сонную артерию перед общей инъекцией сонной артерии.
Описанный здесь метод инъекции внутренней сонной артерии имитирует метастазирование в мозг путем введения раковых клеток в первичный кровеносный сосуд, который снабжает мозг. Эта модель повторяет размещение циркулирующих раковых клеток в сосудистом русле мозга, позволяя их трансмиграции и образованию метастатического роста мозга. Результаты показывают, что инъекция в сонную артерию ограничивает посев рака другими органами, связанными с такими методами, как внутрисердечная инъекция.
Существуют некоторые критические соображения и сведения об устранении неполадок для протокола. Во-первых, клеточные сгустки могут закупоривать внутричерепные кровеносные сосуды и вызывать инсульт. Это может быть смягчено путем пропускания клеточной суспензии через клеточный ситечко, чтобы обеспечить бескупорную клеточную суспензию. Затем введение избыточной жидкости в мозг может привести к воспалительному отеку и препятствовать латерализации сосудов. Этого можно избежать, используя инъекционный объем менее 100 мкл. Использование шва с потертыми концами и наличие фасции или фиброзно-жировой ткани могут препятствовать зацикливанию шва вокруг наружной сонной артерии. Рекомендуется сначала очистить фасцию или фиброзную ткань, нанеся мягкое протирающее движение вдоль артерии щипцами и удалить износостойкие концы, разрезав конец шва. Наконец, линии раковых клеток имеют уникальные темпы роста, и, таким образом, важно оптимизировать концентрацию клеток для инъекций. По опыту, в моделях метастазирования легких и меланомы головного мозга, которые включали агрессивные линии раковых клеток человека NCI-H1975 и A2058 соответственно, было введено меньше клеток (1 х 105 клеток в 100 мкл) для предотвращения быстрого прогрессирования заболевания.
Наиболее сложным этапом в этом протоколе является введение иглы в сонную артерию и инъекция клеток. Рекомендуется использовать новую иглу для каждого животного для стерильности, потому что использование тупых игл увеличивает риск прокола или разрыва кровеносных сосудов. Также рекомендуется использовать шприц-драйвер для процедуры, чтобы уменьшить начальный рывок инъекции и дрожащую иглу во время инъекции. Драйвер шприца также имеет дополнительное преимущество, чтобы сопоставить скорость инъекции с физиологической скоростью кровотока.
Этот протокол не лишен ограничений. Процедура является технически сложной, и существует риск того, что животные погибнут от инсульта от неудачи латерализации, несмотря на успешную процедуру. По нашему опыту, частота инсульта составляет 11,4% (n = 21/168 животных). Следовательно, начальный размер выборки должен учитывать этих животных, которые умрут от инсульта. Поскольку этот метод доставляет раковые клетки непосредственно к мозгу, он снижает системную опухолевую нагрузку и, следовательно, не идеален для изучения системного распространения.
Таким образом, протокол позволит генерировать мышиную модель метастазов в мозг, подходящую для скрининга лекарств и оценки терапевтического профиля лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования; в сборе, анализе или интерпретации данных; при написании рукописи или при принятии решения о публикации статьи.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Австралийским национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC), номер гранта APP1162560. ML финансировался исследовательской стипендией UQ для аспирантов. Мы хотели бы поблагодарить всех, кто помогал с животноводством и визуализацией животных in vivo . Мы благодарим Королевскую брисбенскую и женскую больницу за пожертвование аликвот циркония для этого исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100µm cell strainer | Corning | CLS431752 | |
| 30G Microlance needle | BD | 23748 | |
| 31G Ultra-Fine II insulin syringe | BD | 326103 | |
| Angled forceps | Proscitech | T67A-SS | Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm |
| Animal heat mat | |||
| Antibiotic and antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Autoclave bags | |||
| BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line | ATCC | HTB-20 | |
| Buprenorphine (TEMGESIC) | |||
| Countess cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Diet-76A | ClearH2O | 72-07-5022 | |
| Dissection microscope | |||
| Ear puncher | |||
| Electric clippers | |||
| Fine angled forceps | Proscitech | DEF11063-07 | Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm |
| Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in | Cole Parmer | EW-06419-00 | |
| Foetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium | ThermoFisher Scientific | 14170120 | |
| Hydrogel | ClearH2O | 70-01-5022 | |
| Isoflurane | |||
| Kimwipes Low lint disposable wipers | Kimberly Clark- Kimwipes | Z188964 | |
| Mashed mouse chow | |||
| Meloxicam (METACAM) | |||
| Nose cone | Fashioned out of a microfuge tube | ||
| PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g) | Bausch and lomb | ||
| Povidone-iodine solution | Betadine | 2505692 | |
| PPE (glove, mask, gown, hairnet) | |||
| Retractors | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| RPMI 1640 Media | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm | Ethicon | JJ-640G | |
| Sterile normal saline | ThermoFisher Scientific | TM4469 | |
| Sticky tape | |||
| Surgical board | A chopping board wrapped with autoclavable bag. | ||
| Surgical scissors | Proscitech | T104 | Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm |
| Suture forcep/ Curved Brophy forceps | Proscitech | T113C | Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm |
| Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder) | Proscitech | TC1322-180 | length 190 mm, ratchet clamp |
| Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump | World Precision Instruments | UMP3-3 | |
| T75 tissue culture flask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Thread | |||
| Trigene II surface disinfectant | Ceva | ||
| Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| TrypLE Express dissociating medium | ThermoFisher Scientific | 12605010 |
References
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Reports. 14 (1), 48-54 (2012).
- Australian Institute of Health and Welfare. Cancer in Australia. , Canberra: AIHW. (2017).
- Maher, E. A., Mietz, J., Arteaga, C. L., DePinho, R. A., Mohla, S. Brain metastasis: opportunities in basic and translational research. Cancer Research. 69 (15), 6015-6020 (2009).
- Lin, N. U. Breast cancer brain metastases: new directions in systemic therapy. Ecancermedicalscience. 7, (2013).
- Zimmer, A. S., Van Swearingen, A. E. D., Anders, C. K. HER2-positive breast cancer brain metastasis: A new and exciting landscape. Cancer Reports. 5 (4), (2020).
- Brown, P. D., et al. Postoperative stereotactic radiosurgery compared with whole brain radiotherapy for resected metastatic brain disease (NCCTG N107C/CEC·3): a multicentre, randomised, controlled, phase 3 trial. Lancet Oncology. 18 (8), 1049-1060 (2017).
- Murrell, J., Board, R. The use of systemic therapies for the treatment of brain metastases in metastatic melanoma: Opportunities and unanswered questions. Cancer Treatment Reviews. 39 (8), 833-838 (2013).
- Stemmler, H. J., et al. Ratio of trastuzumab levels in serum and cerebrospinal fluid is altered in HER2-positive breast cancer patients with brain metastases and impairment of blood-brain barrier. Anticancer Drugs. 18 (1), 23-28 (2007).
- Venur, V. A., Leone, J. P. Targeted therapies for brain metastases from breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1543 (2016).
- Murthy, R., et al. Tucatinib with capecitabine and trastuzumab in advanced HER2-positive metastatic breast cancer with and without brain metastases: a non-randomised, open-label, phase 1b study. The Lancet Oncology. 19 (7), 880-888 (2018).
- Murthy, R. K., et al. trastuzumab, and capecitabine for HER2-positive metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 382 (7), 597-609 (2019).
- Shah, M., et al. FDA approval summary: Tucatinib for the treatment of patients with advanced or metastatic HER2-positive breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (5), 1220-1226 (2021).
- Vogelbaum, M. A., et al. Treatment for brain metastases: ASCO-SNO-ASTRO guideline. Journal of Clinical Oncology. 40 (5), 492-516 (2021).
- Ramakrishna, N., et al. Management of advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer and brain metastases: ASCO guideline update. Journal of Clinical Oncology. 10, (2022).
- Li, J., et al. A multifunctional polymeric nanotheranostic system delivers doxorubicin and imaging agents across the blood-brain barrier targeting brain metastases of breast cancer. ACS Nano. 8 (10), 9925-9940 (2014).
- Mittapalli, R. K., et al. Paclitaxel-hyaluronic nanoconjugates prolong overall survival in a preclinical brain metastases of breast cancer model. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (11), 2389-2399 (2013).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), 991-1001 (2015).
- Patil, R., et al. MRI virtual biopsy and treatment of brain metastatic tumors with targeted nanobioconjugates: nanoclinic in the brain. ACS Nano. 9 (5), 5594-5608 (2015).
- Brighi, C., et al. MR-guided focused ultrasound increases antibody delivery to non-enhancing high-grade glioma. Neuro-Oncology Advances. 2 (1), (2020).
- Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14 (5), 862-870 (1994).
- Priego, N., et al. Abstract 2746: Stat3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Cancer Research. 79, 2746 (2019).
- Wyatt, E. A., Davis, M. E. Method of establishing breast cancer brain metastases affects brain uptake and efficacy of targeted, therapeutic nanoparticles. Bioengineering & Translational Medicine. 4 (1), 30-37 (2018).
- Nakayama, J., et al. The in vivo selection method in breast cancer metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1886 (2021).
- Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. Intracarotid cancer cell injection to produce mouse models of brain metastasis. Journal of Visualized Experiments. 120, 55085 (2017).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Hu, X., Villodre, E. S., Woodward, W. A., Debeb, B. G. Modeling brain metastasis via tail-vein injection of inflammatory breast cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 168, (2021).
- Cho, J. H., et al. AKT1 activation promotes development of melanoma metastases. Cell Reports. 13 (5), 898-905 (2015).
- Meuwissen, R., et al. Induction of small cell lung cancer by somatic inactivation of both Trp53 and Rb1 in a conditional mouse model. Cancer Cell. 4 (3), 181-189 (2003).
- Kato, M., et al. Transgenic mouse model for skin malignant melanoma. Oncogene. 17 (14), 1885-1888 (1998).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Sulaiman, A., Wang, L. Bridging the divide: preclinical research discrepancies between triple-negative breast cancer cell lines and patient tumors. Oncotarget. 8 (68), 113269-113281 (2017).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. 91, 52017 (2014).
- Geisler, J. A., et al. Modeling brain metastases through intracranial injection and magnetic resonance imaging. Journal of Visualized Experiments. 160, (2020).
- Reid, Y., Storts, D., Riss, T., Minor, L., et al. in Assay Guidance Manual. eds Markossian, S. et al.) Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
- Janowicz, P. W., et al. Understanding nanomedicine treatment in an aggressive spontaneous brain cancer model at the stage of early blood brain barrier disruption. Biomaterials. , 283 (2022).
- Houston, Z. H., et al. Understanding the Uptake of Nanomedicines at Different Stages of Brain Cancer Using a Modular Nanocarrier Platform and Precision Bispecific Antibodies. ACS Cent Sci. 6 (5), 727-738 (2020).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46, 6387-6392 (1986).
- Clemons, T. D., et al. Distinction between active and passive targeting of nanoparticles dictate their overall therapeutic efficacy. Langmuir. 34 (50), 15343-15349 (2018).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), (2021).
- Masmudi-Martín, M., et al. Brain metastasis models: What should we aim to achieve better treatments. Advanced Drug Delivery Reviews. 169 (20), 79-99 (2021).
- Carney, C. P., et al. Harnessing nanomedicine for enhanced immunotherapy for breast cancer brain metastases. Drug Delivery and Translational Research. 11 (6), 2344-2370 (2021).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), Berlin, Germany. 991-1001 (2015).
- Bao, Y., et al. Synergistic chemotherapy for breast cancer and breast cancer brain metastases via paclitaxel-loaded oleanolic acid nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 17 (4), 1343-1351 (2020).
- Kotb, S., et al. Gadolinium-based nanoparticles and radiation therapy for multiple brain melanoma metastases: Proof of concept before phase I trial. Theranostics. 6 (3), 418-427 (2016).
- Zhang, T., et al. Multitargeted nanoparticles deliver synergistic drugs across the blood-brain barrier to brain metastases of triple negative breast cancer cells and tumor-associated macrophages. Advanced Healthcare Materials. 8 (18), 1900543 (2019).
- He, C., et al. Blood-brain barrier-penetrating amphiphilic polymer nanoparticles deliver docetaxel for the treatment of brain metastases of triple negative breast cancer. Journal of Controlled Release. 246, 98-109 (2017).
- Wang, X., et al. Enhanced anti-brain metastasis from non-small cell lung cancer of osimertinib and doxorubicin co-delivery targeted nanocarrier. International Journal of Nanomedicine. 15, 5491-5501 (2020).
- Gries, M., et al. Multiscale selectivity and in vivo biodistribution of NRP-1-targeted theranostic AGuIX nanoparticles for PDT of glioblastoma. International Journal of Nanomedicine. 15, 8739-8758 (2020).
