Summary
Hjärnmetastaser är en orsak till svår sjuklighet och dödlighet hos cancerpatienter. De flesta hjärnmetastaseringsmusmodeller kompliceras av systemiska metastaser som förvirrar analys av dödlighet och terapeutiska interventionsresultat. Här presenteras ett protokoll för intern karotisinjektion av cancerceller som producerar konsekventa intrakraniella tumörer med minimala systemiska tumörer.
Abstract
Hjärnmetastaser är en orsak till svår sjuklighet och dödlighet hos cancerpatienter. Kritiska aspekter av metastatiska sjukdomar, såsom den komplexa neurala mikromiljön och stromacellinteraktionen, kan inte helt replikeras med in vitro-analyser ; Således är djurmodeller avgörande för att undersöka och förstå effekterna av terapeutisk intervention. De flesta hjärntumörxenografteringsmetoder producerar dock inte hjärnmetastaser konsekvent när det gäller tidsramen och tumörbördan. Hjärnmetastaseringsmodeller som genereras av intrakardiell injektion av cancerceller kan resultera i oavsiktlig extrakraniell tumörbörda och leda till icke-hjärnmetastatisk sjuklighet och dödlighet. Även om intrakraniell injektion av cancerceller kan begränsa extrakraniell tumörbildning, har den flera försiktighetsåtgärder, såsom de injicerade cellerna bildar ofta en singulär tumörmassa vid injektionsstället, hög leptomeningeal involvering och skador på hjärnvaskulatur under nålpenetration. Detta protokoll beskriver en musmodell av hjärnmetastaser som genereras av intern halspulsåderinjektion. Denna metod producerar intrakraniella tumörer konsekvent utan inblandning av andra organ, vilket möjliggör utvärdering av terapeutiska medel för hjärnmetastaser.
Introduction
Hjärnmetastaser är en utbredd malignitet i samband med en mycket dålig prognos 1,2. Vårdstandarden för hjärnmetastaseringspatienter är multimodal och består av neurokirurgi, strålbehandling i hela hjärnan och/eller stereotaktisk radiokirurgi beroende på patienternas allmänna hälsotillstånd, extrakraniell sjukdomsbörda och antalet och placeringen av tumörer i hjärnan 3,4. Patienter med upp till tre intrakraniella lesioner är berättigade till kirurgisk resektion eller stereotaktisk radiokirurgi, medan strålbehandling i hela hjärnan rekommenderas för patienter med flera lesioner för att undvika risken för kirurgirelaterad infektion och ödem5. Strålbehandling av hela hjärnan kan dock orsaka skador på radiokänsliga hjärnstrukturer, vilket bidrar till dålig livskvalitet6.
Systemisk terapi är ett icke-invasivt alternativt och logiskt tillvägagångssätt för att behandla patienter med flera lesioner7. Det är dock mindre övervägt på grund av den långvariga uppfattningen att systemiska terapier har dålig effekt eftersom passiv leverans av cytotoxiska läkemedel via blodomloppet inte kan uppnå terapeutiska nivåer i hjärnan utan risk för osäker toxicitet8. Detta paradigm börjar förändras med den nyligen godkända systemiska behandlingen av U.S. Food and Drug Administration (FDA) (tucatinib med trastuzumab och capecitabin indicerat för metastaserande HER2+ bröstcancerhjärnmetastaser)9,10,11,12 och uppdateringen av behandlingsriktlinjerna för att inkludera övervägande av systemiska terapialternativ för hjärnmetastaseringspatienter13,14.
I detta sammanhang kan utvecklingen inom molekylär riktad terapi, immunterapi och alternativa läkemedelsleveranssystem, såsom en riktad nano-läkemedelsbärare, potentiellt övervinna utmaningarna med hjärnmetastasbehandling15,16,17,18. Dessutom undersöks kemiska och mekaniska metoder för att förbättra läkemedelsleverans via permeabilisering av hjärntumörbarriären19,20. För att studera och optimera sådana tillvägagångssätt för att vara lämpliga för ändamålet är det viktigt att använda prekliniska modeller som inte bara speglar den komplexa fysiologin för hjärnmetastaser utan också möjliggör objektiv analys av intrakraniellt läkemedelssvar.
I stort sett involverar de nuvarande metoderna för modellhjärnmetastaser in vivo intrakardiell (vänster ventrikel), intravenös (vanligtvis svansven), intrakraniell eller intrakarotis (vanlig halspulsåder) injektion av cancerceller hos möss 21,22,23,24,25,26,27 . Förutom tumörengraftmentstrategier är genetiskt modifierade musmodeller där tumörbildning utlöses genom avlägsnande av tumörsuppressorgener eller aktivering av onkogener användbara för tumörmodellering. Men endast ett fåtal genetiskt modifierade musmodeller rapporteras producera sekundära tumörer och ännu färre som på ett tillförlitligt sätt producerar hjärnmetastaser28,29,30.
Engraftmentmetoder som intrakardiell (vänster ventrikel) och intravenös (vanligtvis svansven) injektion efterliknar den systemiska spridningen av cancer. Dessa modeller producerar vanligtvis lesioner i flera organ (t.ex. hjärna, lungor, lever, njurar, mjälte) beroende på kapillärbädden som fångar de flesta tumörceller under deras cirkulationspass "första pass"31. Inkonsekventa nivåer av hjärningraftment kommer dock att kräva fler djur för att uppnå provstorleken för önskad statistisk kraft. Antalet tumörceller som så småningom etablerar sig i hjärnan via dessa intrakardiella och intravenösa injektionsmetoder varierar. Därför kan hjärnmetastaseringstumörbördan variera mellan djur och skillnaden i progression kan göra standardisering av den experimentella tidslinjen och tolkningen av resultat till en utmaning. Den extrakraniella tumörbördan kan leda till dödlighet utan hjärnmetastaser, vilket gör dessa modeller olämpliga för utvärdering av intrakraniell effekt. Hjärn-tropiska cellinjer har etablerats med hjälp av artificiella klonala selektionsprocesser för att minska extrakraniell etablering, men upptagningshastigheterna har varit inkonsekventa och den klonala urvalsprocessen kan minska heterogeniteten som normalt finns i mänskliga tumörer32.
Hjärnspecifika engraftmentmetoder som intrakraniell och intrakarotisinjektion möjliggör mer konsekvent och effektiv hjärnmetastaseringsmodellering. I den intrakraniella metoden33 injiceras cancerceller vanligtvis i den främre hjärnbarken, vilket genererar snabb och reproducerbar tumörutväxt med lågt systemiskt engagemang. Även om proceduren tolereras väl med låg dödlighet33, är försiktighetsåtgärderna att det är ett relativt grovt tillvägagångssätt som snabbt introducerar en (lokaliserad) bolus av celler i hjärnan och inte modellerar tidig hjärnmetastaseringspatogenes. Nålen skadar hjärnvävnadskärlen, som då orsakar lokaliserad inflammation 5,34. Av erfarenhet finns det en tendens att tumörcellinjektat återflöde under avlägsnande av nålen, vilket leder till leptomeningeal involvering. Alternativt levererar intracarotidmetoden celler till den gemensamma halspulsådern med hjärnmikrovaskulatur som den första kapillärbädden som påträffas, modelleringsöverlevnad i cirkulation, extravasation och kolonisering24. I överensstämmelse med andra25 fann vår erfarenhet av denna metod att den kan resultera i ansiktstumörer på grund av oavsiktlig leverans av cancerceller via den yttre halspulsådern till kapillärbäddar i dessa vävnader (opublicerade data). Det är möjligt att förhindra ansiktstumörer genom att först ligera den yttre halspulsådern före vanlig halspulsåderinjektion (figur 1). I resten av artikeln kallas denna metod för "inre halspulsåderinjektion". Av erfarenhet genererar den inre halspulsåderinjektionsmetoden konsekvent hjärnmetastaser med mycket få systemiska händelser och har lyckats generera hjärnmetastaseringsmodeller av olika primära cancerformer (t.ex. melanom, bröst- och lungcancer) (Figur 1). Nackdelarna är att det är tekniskt utmanande, tidskrävande, invasivt och kräver noggrann optimering av cellnummer och en övervakningstidslinje. Sammanfattningsvis producerar både intrakraniella och interna halspulsåderinjektionsmetoder musmodeller som är lämpliga för att utvärdera terapeutisk inverkan på hjärntumörrelaterad överlevnadsfördel.
Detta protokoll beskriver den interna halspulsåderinjektionsmetoden för att producera en musmodell av hjärnmetastaser med nästan ingen systemisk inblandning och därför lämplig för preklinisk utvärdering av läkemedelsdistribution och effekt av experimentella terapier.
Figur 1: Schematisk representation av internt halspulsåderinjektionsprotokoll för hjärnmetastaser. Intern halspulsåderinjektion med extern halspulsåderligering kan på ett tillförlitligt sätt producera en hjärnmetastaseringsmodell från olika primära cancerformer. I detta protokoll placeras tre ligaturer på halspulsådern (kommenterad som L1-L3 i figuren). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier genomfördes inom riktlinjerna för djuretikkommittén vid University of Queensland (UQCCR/186/19) och den australiska koden för vård och användning av djur för vetenskapligt ändamål.
1. Beredning av cancerceller för injektion
OBS: I denna studie användes den mänskliga bröstcancercellinjen, BT-474 (BT474). BT474 odlades i fullständigt tillväxtmedium bestående av RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% insulin. Cellerna hölls i en inkubator vid 37 °C med 5% koldioxid i luftatmosfären. Autentisera cellinjen med satellittandemupprepningar testning35, bekräfta uttrycket av reporterproteinet (t.ex. luciferas) om något finns och kontrollera om det finns mykoplasmainfektion.
- Frö BT474 cancerceller med en sådddensitet på 2,0 x 106 celler i en T75-kolv med användning av 10 ml komplett tillväxtmedium och odling (vid 37 ° C med 5% CO2) till 70% -80% sammanflöde före injektion.
- På injektionsdagen, kassera tillväxtmedia och tvätta cellmonolagret med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger.
- Tillsätt 5 ml förvärmt cellodlingsdissociationsreagens (se materialtabell) och inkubera vid 37 °C i 5 minuter eller tills cellerna har lossnat. Efter 5 minuter ska du försiktigt trycka på kolven för att underlätta cellavskiljningen.
- Tillsätt 5 ml komplett tillväxtmedium innehållande 10% fetalt bovint serum för att släcka dissociationsreagensaktiviteten.
- Återsuspendera försiktigt cellerna genom pipettering för att minska cellklumpar.
- Överför cellsuspensionen till ett 50 ml rör och centrifugera vid 180 x g i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml av Hanks balanserade saltlösning (HBSS) utan kalcium och magnesium för att minimera cellklumpning.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 180 x g i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Dekantera supernatanten för att avlägsna kvarvarande serum/dissociationsreagens och återsuspendera cellpelleten i 3 ml HBSS.
- Placera en 100 μm cellsil på ett nytt 50 ml koniskt rör och passera cellsuspensionen för att avlägsna cellklumpar.
OBS: En enda cellsuspension är avgörande för att minimera blodkärlsacklusion och risken för stroke vid injektion. - Beräkna antalet livskraftiga celler med hjälp av Trypan Blue uteslutning och en hemocytometer med standardmetoder.
- Späd cellsuspensionen med HBSS till en cellkoncentration på 2,5 x 106 celler/ml.
- Håll röret horisontellt på is och gunga försiktigt röret regelbundet för att minimera klumpar. Cellsuspensionen kan förvaras på is i högst 6 timmar.
OBS: Gungning gjordes manuellt men detta kan också göras med en shaker vid låga varvtal.
2. Förberedelse av musen för proceduren
OBS: I denna studie användes 4-5 veckor gamla, kvinnliga NOD-scidmöss. Introducera mjuk diet återhämtningsmat (t.ex. dietgel, hydrogel, mosad mus chow) till möss 3 dagar före proceduren för att uppmuntra utfodring efter proceduren.
- Autoklav kirurgiska verktyg. Spraya och torka av operationsområdet och utrustningen med ytdesinfektionsmedel, följt av 70% etanol.
- Placera en djurvärmematta under operationskortet för att förhindra hypotermi. Slå på detta 30 min före operationen. Spraya och torka av operationskortet med ytdesinfektionsmedel följt av 70% etanol.
- Förbered en ren djurhållningsbur och en varm värmepanna för återhämtning.
- Ta på dig ren personlig skyddsutrustning (klänning, mask, hårnät och handskar). Behåll steriliteten under hela proceduren genom att använda rena undersökningshandskar och en "endast instrumentspetsar" -teknik.
- Bedöva musen med en bedövningskammare med 5% isofluran med ett syreflöde på 2 L/min tills musen tappar pedalreflexen.
- Ta ut djuret ur kammaren och placera det i en näskon som levererar 2% isofluran vid ett syreflöde på 2 L/min för det återstående kirurgiska ingreppet.
- Öronstansmus för identifiering och använd elektriska klippare för att raka pälsen från halsområdet. Rengör överflödigt hår från exponerad hud med tejp.
- Väg musen för att beräkna de narkos- och smärtstillande läkemedelsdoser som krävs. Administrera buprenorfin och meloxikam med 50 μg/kg respektive 1 mg/kg via subkutan injektion.
- Överför musen till ett varmt kirurgiskt kort och säkra näskonen med tejp.
- Applicera okulärt smörjmedel på ögonen för att förhindra torkning.
- Säkra musen försiktigt genom att först haka fast de övre framtänderna med tråd tejpad på operationskortet, följt av tejpning av fram- och bakbenen. Detta steg sträcker ut kroppen och håller nacken rak under proceduren.
- Utför preoperativ hudberedning enligt beskrivningen nedan.
- Torka av nacken med aktuella antiseptiska medel (povidon-jod) för att minska hudens mikroflorabelastning och ta bort löst hår. Rengör från mitten av huden, arbeta utåt för att förhindra återkontaminering av snittstället. Upprepa processen med 70% etanol. Utför tre alternerande rundor jod och etanol för desinfektion.
- Lägg ett kirurgiskt draperi över djuret. Detta skärs och formas av en bit steril pappershandduk eller autoklavpåse.
- Lägg ut sterila pappershanddukar eller autoklavpåsar för kirurgiska verktyg.
- Kontrollera reflex via "Pinch test" för att säkerställa tillräcklig anestesi innan du fortsätter med proceduren.
3. Intern halspulsåderinjektion
OBS: I detta experiment användes en 31 G infusionskanul och fotaktiverad sprutdrivrutinsinställning för att underlätta injektionsproceduren (kompletterande figur 1). Denna inställning är valfri och användaren kan använda en 31 G insulinspruta och hoppa över steg 3.11 och 3.12. För att förbereda infusionskanulen, dra och separera nåldelen från sprutmonteringsdelen av en 31 G nål med två par suturklämmor. Fäst sedan nåldelen i ena änden av en fin infusionsslang som är cirka 10 cm lång.
- Placera dissektionsmikroskopet över musen.
- Använd sax och gör ett vertikalt 15 mm snitt längs mittlinjen vid nackområdet från 5 mm under käken till bröstinloppet.
- Använd två par vinklade tångar, dela huden och underliggande spottkörtlar och applicera retraktorer för att hålla luftstrupen exponerad. Nästa steg kommer att exponera halshinnans mantel som ligger parallellt med luftstrupen.
- Använd två par finvinklade tångar, dissekera helt enkelt muskeln och fettvävnaden intill luftstrupen för att exponera rätt halspulsåda. Halspulsådern är det fibrösa skiktet som täcker den gemensamma halspulsådern, venen och vagusnerven, och detta bunt kan visualiseras av den ljusröda gemensamma halspulsådern. I denna studie utfördes injektionen på den högra halspulsådern.
- Rensa ett segment av den gemensamma halspulsådern caudal till carotid bifurcation av den omgivande fascia och separera den från vagusnerven och venerna.
- Isolera och rensa karotisbifurkationen (korsningen som förenar de yttre och inre halspulsåderna) från de omgivande nerverna och fascia. Placera fina pincett under den yttre halspulsådern och passera en silkesutsutur (5-0 tjocklek) under artären. Knut och dra åt suturen och skär överflödig linje.
OBS: Denna ligatur (L1) kommer att förhindra att injicera från att passera genom den yttre halspulsådern. - Placera fina pincett under den gemensamma halspulsådern och passera en silkesutsutur (5-0 tjocklek) under artären. Knyt en knut och dra åt suturen i ett läge proximalt till det föreslagna injektionsstället. Skär överskottet av sutur och lämna ca 10 mm linje.
OBS: Denna andra ligatur (L2) kommer att begränsa blodflödet och blödningen efter injektion. Det används också för att placera och hålla halspulsådern under injektionen. - Skär och fukta en remsa av (autoklaverade) engångstorkare med låg ludd (se materialtabell) ca 10 mm x 5 mm. Vik remsan i 4 mm x 5 mm, 2-3 mm tjock, och placera den under halspulsådern på det föreslagna injektionsstället. Detta kommer att stödja kärlet under injektionen.
- På den gemensamma halspulsådern rostral till det föreslagna injektionsstället, placera en tredje ligering (L3) med en lös knut. Detta dras åt först efter injektionen (i steg 3.16).
- Agitera försiktigt cellsuspensionen och dra 200 μl cellsuspension till en insulinspruta (med 31 G nål).
- Ladda sprutan i sprutdrivrutinen som är ansluten till en aktiverande fotpedal.
- Fäst en fin kanyl med en 31 G nål på sprutan och grunda linjen.
- Kontrollera om halspulsådern är väl placerad och trycksatt.
- Använd två finvinklade tångar, den ena som försiktigt spänner på änden av den första ligaturen och den andra håller 31 G-nålen, för långsamt in nålen med avfasning upp i blodkärlets lumen och var noga med att inte punktera den.
- Injicera långsamt 100 μl cellsuspension (från steg 1.13) i den gemensamma halspulsådern vid 10 μl/s. Detta kommer att leverera 2,5 x 105 celler i blodkärlet. Framgångsrik injektion visualiseras via rensning av blod från halspulsådret.
- Lyft och dra åt den lösa ligaturen (L3) (från steg 3.9) omedelbart efter att nålen dragits ut för att förhindra återflöde och blödning. Trimma överskott av sutur.
OBS: Det är normalt att observera en liten mängd blod som sprutar efter att nålen har dragits tillbaka. Det får dock inte finnas någon aktiv blödning efter att den tredje ligaturen har dragits åt. - Ta bort biten av fuktade engångstorkar med låg ludd.
- Skölj kirurghålan två gånger med en P200-pipett med 150-200 μL sterilt vatten eller saltlösning.
- Kontrollera igen för blödning och ta sedan bort retraktorerna.
- Placera mjukvävnaden, spottkörtlarna och huden över halspulsådern och luftstrupen.
- Stäng snittets hudskikt med en suturnålhållare, pincett och en absorberbar eller icke-absorberbar 6/0 monofilament sutur i ett kontinuerligt mönster.
- Kassera kanylnålssprutan och förbered en ny installation för nästa mus. Att använda en ny spruta säkerställer att antalet celler som injiceras i varje mus är konsekvent.
OBS: Representativa ögonblicksbilder av förfarandet finns i kompletterande figur 2. Om kärlet punkteras eller slits av nålen, indikerat av läckage av injektat eller blödning, anses proceduren misslyckad. Efter detta måste nålen dras tillbaka och den tredje ligaturen måste omedelbart dras åt för att förhindra ytterligare blödning. Om blödningen är ihållande efter åtdragning av suturen måste djuret avlivas med pentobarbital.
4. Återhämtning efter injektion
- Injicera buprenorfin (50 μg/kg) och meloxikam (1 mg/kg) via subkutan injektion som postkirurgisk smärtlindring.
- Flytta djuret till en varm och ren bur för att återhämta sig från anestesi. Det är normalt att ett djur har dämpad aktivitet (kramad och inaktiv eller rör sig långsamt) efter att ha vaknat.
- Efter 30-45 min, överför möss till en långsiktig anläggning.
- Ge möss en mjuk diet (dietgel, hydrogel, mos) i minst en vecka efter operationen och kontrollera fysisk status dagligen med särskild uppmärksamhet för tecken på stroke, infektion, blödning runt sårplatsen.
- Två dagar efter operationen är det typiskt för djuret att ha minskad aktivitet, mild rufsig päls och förlorat 15% av preoperativ kroppsvikt. Administrera smärtstillande (meloxikam) dagligen i 2-3 dagar efter operationen för att hantera smärta och hjälpa till att återhämta sig.
- Från dag 3 och framåt måste djuren ha återfått aktiviteten, ökat i utfodrings- och skötselfrekvens och återfått vikt. Avliva djur med ihållande fysiska tillståndsunderskott (smärta, huddled, inaktiv, viktminskning) efter 4 dagar efter operationen genom att injicera natriumpentobarbital vid 200 mg / kg via intraperitoneal injektion.
- Tumöringraftment och progression kan övervakas med hjälp av anestesi och valfri avbildningsmodalitet, såsom bioluminescerande avbildning, MR eller PET / MR. Kravet på och förmågan att genomföra sådan avbildning kommer till sin natur att vara beroende av de enskilda projektmålen och den anläggning inom vilken den genomförs, och beroende på vilken typ av rapportör som används de cellinjer som används, tillgängligheten till relevanta radiokemi- och kärnavbildningsanläggningar36,37
OBS: Vissa djur kanske inte svarar bra och upplever en stroke trots ett framgångsrikt förfarande. Efter proceduren måste djur som uppvisar några symtom på neurologisk nöd (vrida huvudet och dra åt sidan, cirklande beteende, rullande, thrashing, förlust av motorisk funktion) avlivas omedelbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jämförelse av vanlig halspulsåderinjektion med eller utan yttre halspulsåderligering
När cancerceller injicerades via den gemensamma halspulsådern utan att först ligera yttre halspulsåder24, hittades ansiktstumörer hos 77,8% av de ympade mössen (n = 7/9 djur). Ett exempel på ansiktstumör illustreras i kompletterande figur 3. Metoden som beskrivs i detta protokoll förhindrar oavsiktlig ansiktsmetastasering genom att ligera den yttre halspulsådern före den gemensamma halspulsådern.
För att jämföra de två metoderna injicerades lektin i den gemensamma halspulsådern hos utgallrade möss med eller utan yttre halspulsåderligering. Därefter fixerades, bearbetades och observerades ansiktsvävnaden och hjärnan under fluorescerande mikroskop. En minskning av lektin observerades vid immunofluorescensanalys i kindvävnaderna när den yttre halspulsådern ligerades (figur 2A-B). Resultaten visar också att extern halspulsåderligering inte påverkade hjärnans leverans eftersom lektin kan observeras i hjärnvävnaden hos möss som genomgick vanlig halspulsåderinjektion med extern halspulsåderligering (Figur 2C-D). Därför kan detta ytterligare steg styra leveransen av cancerceller via den inre halspulsådern in i hjärnan med minimal sådd till ansiktsvävnad.
Figur 2: Intracarotid transplantatleverans med och utan extern halspulsåderligering. Fluorescerande avbildning av höger kindmuskel (A,B) och hjärnor (C,D) hos möss med lektin (grönt) levererat till den gemensamma halspulsådern, antingen med (A,C) eller utan (B,D) yttre halspulsåder. Kind och hjärna avbildades vid 20x och 5x förstoring och skalstänger representerar 50 respektive 200 μm. Kärnor (blå) färgades med DAPI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bioluminescerande övervakning
En HER2-förstärkt bröstcancercellinje, BT474, som var genetiskt modifierad för att uttrycka luciferas användes i denna studie för att möjliggöra veckovis övervakning av tumörprogression genom att administrera luciferin och utföra in vivo bioluminescerande avbildning. I denna BT474-modell för hjärnmetastaser kan bioluminescerande signaler observeras från vecka 5 efter intern halspulsåderinjektion och gradvis ökat i intensitet över tiden (figur 3).
Figur 3: Bioluminescerande övervakning och kvantifiering av bioluminescenssignal. Representativa bioluminescerande bilder varje vecka från vecka 0 till vecka 7 som visar ökande intensitet från huvudet. Grafen visar kvantifieringen av bioluminescerande signaler hos möss. Data betyder ± standardfel (n = 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Magnetisk resonanstomografi (MRI)
Hjärnmetastaseringsdjurmodellen avbildades med hjälp av T2-viktad MR vid vecka 2, 5 och 8 för att bedöma intrakraniell tumörprogression. Från vecka 5 till vecka 8 kan en region med heterogen signalintensitet observeras, vilket indikerar en intrakraniell tumör med komplex vätskeperfusion, förmodligen från störd tumörvaskulatur (Figur 4A). Blod-hjärnbarriären i hjärnmetastaseringsmodellen störs och liknar den för klinisk hjärnmetastasering. Detta utvärderades med hjälp av gadoliniumkontrastförbättring följt av en T1-viktad MR-sekvens. Gadoliniumkoncentrationen inom tumörregionen ökar när den läcker från blodcirkulationen till tumörvävnad. Detta illustreras av det mörkare området som representerar förkortningen av T1-avslappningstiden (figur 4B). Data som erhållits kan användas för att korrelera läkemedelstillgång till blod-hjärnbarriärpermeabilitet. Dessutom kan intrakraniell tumörvolym och ytarea härledas genom att utföra volymetrisk segmentering med hjälp av 3D Slicer-bildanalysprogramvaran (figur 4C). Detta kan plottas på en graf mot tiden för att spåra hjärntumörtillväxt.
Figur 4: Karakterisering av hjärnmetastaseringsdjurmodell med hjälp av magnetisk resonansavbildning . (A) T2-viktade tvärgående, koronala och sagittala skanningar av modellen vid vecka 1, 5 och 8. Vid vecka 5 kan ett svagt fläckigt område ses på sagittalvyn (röd pil), som utvecklades till en hyperintense och heterogen region vid vecka 8. (B) Dynamisk kontrastförstärkt T1-viktad MRI som visar en hjärntumör (region i rött) vid före och efter injektion av gadoliniumkontrastförbättring (CE) -medel. Mörka områden indikerar gadoliniumläckage och upptag. (C) Tumör visualiserad på koronala, tvärgående och sagittala plan kommenterades och segmenterades med hjälp av 3D Slicer-bildanalysprogramvaran för att härleda intrakraniell tumörvolym. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
PET/MR-avbildning för att bestämma biodistributionen av nanomedicin
Kombinationen av störd blod-hjärnbarriär och den läckande tumörvaskulaturen underlättar passivt upptag och ackumulering av terapier i nanoskala, via förbättrad permeabilitet och retentionseffekt36,37. När BT474-hjärnmetastaseringsmodellen överuttrycker HER2 utfördes hjärnupptag av en zirkonium-89-märkt HER2-riktad nanomedicin med positronemissionstomografi / magnetisk resonans (PET / MR) -avbildning (figur 5). I en kohort av BT474 BM-möss var nanomedicinen som upptäcktes inom tumörregionen högre än den i oengagerade hjärnregioner, vilket bekräftade ackumuleringen av nanomedicin i hjärnmetastaser.
Figur 5: Representativ PET / MR-bild av zirkonium-89 märkt HER2-riktad nanomedicin (89Zr-HER2-NM) hos BT474 hjärnmetastasmöss. (A) Den vänstra bilden visar T2-vikt MRI (koronal vy) som visar hjärntumör (röd region) och oengagerad hjärna (blå region). De två intilliggande bilderna visar MR-bilder (koronal och tvärgående vy) överlagrade med PET-överlägg. Det färgade PET-överlägget visar att tumörregionen har högre upptag av nanomedicinen (vit, röd, gul) jämfört med de oengagerade regionerna (blå/grön). (B) Diagrammet illustrerar ökningen av PET-signalintensiteten och upptaget av nanomedicin (injicerad dos per gram, ID/g) i hjärntumörer i förhållande till den oengagerade hjärnan (n = 12). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Överlevnad och fysisk status för BM-modeller
BT474-hjärnmetastaseringsmodellen överlevde en median på 9 veckor efter injektionen (figur 6). När hjärnmetastaserna utvecklades började djuren förlora upp till 20% kroppsvikt, vilket sedan krävde eutanasi (mellan vecka 6-9). I sena hjärnmetastaser inkluderar de vanliga presentationerna rufsig päls och utbuktande och kupolformade kranier. Djuren var ofta inaktiva, kramade och visade funktionella brister i motorik och styrka.
Figur 6: Kaplan Meier-kurva av BT474-hjärnmetastaseringsmusmodellen. Medianöverlevnaden var 9 veckor efter injektionen (n = 18). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Histologi
Efter eutanasi perfuserades djuren med en 4% paraformaldehydlösning för att bevara hjärnans histologiarkitektur40. Därefter bearbetades, sektionerades och färgades hjärnorna och andra organ med hematoxylin och eosin (H&E). I denna hjärnmetastaseringsmodell var tumörerna ensidiga placerade och matchade sidan av halspulsåderinjektionen (figur 7A). BT474-tumörerna uppträdde mestadels som fasta ensamma massor, i vissa fall involverade nästan hälften av hjärnhalvan (figur 7B). Fickor med tomma utrymmen observerades ofta och bestod av nekrotiska celler (figur 7C). Mindre utväxter förekom också hos vissa djur (figur 7E). Immunohistokemifärgning visar att BT474 hjärnmetastaser uttrycker starka HER2 och HER3, vilket tyder på att denna modell är lämplig för HER2- och HER3-riktade terapier (Figur 7F).
Figur 7: Hjärnhistologi av BT474 hjärnmetastaseringsmodell. (A) Representativ hjärnsektion av en BT474 BM-mus; färgade rutor markerade förstorade områden av intresse. Skalstång = 2 mm. (B) Fast tumör innefattande en massa epiteloidceller. (C) Nekrotiska celler inom ett utrymme. (D) Tumör-hjärngränssnitt (E) Små utväxter som kallas mikrometastaser. (B-E Skala bar = 200 μm). (F) Immunohistokemiska bilder som visar HER2- och HER3-positivitet och matchade hematoxylin och eosin (H&E). Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Systemiskt engagemang
Inga tumörer observerades i vävnadssektioner från andra organ (figur 8). Detta fynd överensstämmer med bioluminescerande data, där bioluminescens endast detekterades från djurens huvuden. Tillsammans visade resultaten att denna modell är associerad med inga detekterbara systemiska tumörer.
Figur 8: Histologi av andra organ. Det fanns ingen uppenbar tumörinvolvering i de screenade organen: ben, lever, njure, bukspottkörtel, lunga, hjärta, mjälte, tarm och äggstock. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Kanylspruta för inre halspulsåderinjektion. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Ögonblicksbilder av den inre halspulsåderinjektionsprocessen. Bildbeskrivning finns i tilläggstabell 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: T2-viktad MR som visar en stor intramuskulär tumör i höger ansiktsvävnad (skisserad röd). H&E-färgad vävnadssektion avslöjar tätt packade tumörceller. Skalstång = 2 mm (mitten) och 100 μm (höger). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 1: Steg-för-steg-beskrivning av den inre halspulsåderinjektionen i tilläggsfigur 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjärnmetastaser är en komplex process av cancerceller som sprider sig från deras primära plats till hjärnan. Olika djurmodeller finns tillgängliga som speglar vissa stadier i denna flerstegsprocess och det finns fysiologiska och praktiska överväganden för att utforma prekliniska metastaseringsstudier41,42. De flesta publicerade studier som undersöker användningen av nanomedicin för behandling av hjärnmetastaser har använt intrakardiella43,44 och intrakraniella 45,46,47,48,49 modeller. Ympning av cancerceller via halspulsådern kan bättre rekapitulera den metastatiska processen och hjärnmetastasering patobiologi.
Men av erfarenhet resulterade den vanliga halspulsådringsinjektionstekniken i att flera djur uppvisade signifikanta ansiktstumörer vid tidiga tidpunkter. Hos djur med både aktiva hjärn- och ansiktstumörer observerades växa snabbare i storlek än hjärntumörerna. Detta kan bero på den mer vaskulära mikromiljön som stöder tumörtillväxt (kompletterande figur 3).
Den gemensamma halspulsådern levererar blod till ansiktsregionen och hjärnan via de yttre respektive halspulsådrorna. Därför, i samförstånd med andra25, skulle injektion av cancerceller via den gemensamma halspulsådern leda till sådd i båda regionerna. Det är möjligt att förhindra ansiktstumörer genom att först ligera den yttre halspulsådern före vanlig halspulsåderinjektion.
Den inre halspulsåderinjektionsmetoden som beskrivs här simulerar hjärnmetastaser genom att införa cancercellerna i det primära blodkärlet som försörjer hjärnan. Denna modell rekapitulerar placeringen av cirkulerande cancerceller i hjärnans vaskulära säng, vilket möjliggör deras transmigration och bildning av metastatisk hjärnutväxt. Resultaten visar att halspulsåderinjektion begränsar sådden av cancer till andra organ som är associerade med metoder som intrakardiell injektion.
Det finns några kritiska överväganden och felsökningsinformation för protokollet. För det första kan cellklumpar ockludera intrakraniella blodkärl och utlösa en stroke. Detta kan mildras genom att leda cellsuspensionen genom en cellsil för att säkerställa en klumpfri cellsuspension. Sedan, injicera överskott av vätska i hjärnan kan resultera i inflammatoriskt ödem och hindra vaskulär lateralisering. Detta kan undvikas genom att använda injektionsvolym mindre än 100 μl. Att använda en sutur med slitna ändar och närvaron av fascia eller fibrofettvävnad kan hindra looping av sutur runt den yttre halspulsådern. Det rekommenderas att först rensa fascia eller fibrofettvävnad genom att applicera en mild torkningsrörelse längs artären med pincetten och ta bort slitna ändar genom att skära änden av suturen. Slutligen har cancercellinjer unika tillväxthastigheter, och därför är det viktigt att optimera cellkoncentrationen för injektion. Av erfarenhet, i lung- och melanomhjärnmetastaseringsmodeller som involverade de aggressiva humana cancercellinjerna NCI-H1975 respektive A2058, injicerades färre celler (1 x 105 celler i 100 μl) för att förhindra snabb sjukdomsprogression.
Det mest utmanande steget i detta protokoll är införandet av nål i halspulsådern och injektion av celler. Det rekommenderas att använda en ny nål per djur för sterilitet eftersom användning av trubbiga nålar ökar risken för punktering eller rivning av blodkärl. Det rekommenderas också att använda en sprutdrivrutin för proceduren för att minska den initiala sprutan av injicerat och skakig nål under injektionen. Sprutföraren har också den extra fördelen att matcha injektionshastigheten till fysiologisk blodflödeshastighet.
Detta protokoll är inte utan begränsningar. Förfarandet är tekniskt krävande och det finns risk för att djur ger efter för stroke från lateraliseringsfel trots att de genomgår ett framgångsrikt förfarande. Från vår erfarenhet är strokefrekvensen 11, 4% (n = 21/168 djur). Därför bör startprovstorleken ta hänsyn till dessa djur som kommer att dö av stroke. Eftersom denna metod levererar cancerceller direkt mot hjärnan har den minskat systemisk tumörbörda och är därför inte idealisk för att studera systemisk spridning.
Sammanfattningsvis kommer protokollet att möjliggöra generering av hjärnmetastaseringsmusmodell som är lämplig för läkemedelsscreening och utvärdering av läkemedlets terapeutiska profil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien; vid insamling, analys eller tolkning av data; i skrivandet av manuskriptet eller i beslutet att publicera papperet.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av The Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC), bidragsnummer APP1162560. ML finansierades av ett UQ-forskarutbildningsstipendium. Vi vill tacka alla som hjälpt till med djurhållning och in vivo-avbildning av djuren. Vi tackar Royal Brisbane and Women's Hospital för att ha donerat alikvoter av zirkonium för denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100µm cell strainer | Corning | CLS431752 | |
| 30G Microlance needle | BD | 23748 | |
| 31G Ultra-Fine II insulin syringe | BD | 326103 | |
| Angled forceps | Proscitech | T67A-SS | Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm |
| Animal heat mat | |||
| Antibiotic and antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Autoclave bags | |||
| BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line | ATCC | HTB-20 | |
| Buprenorphine (TEMGESIC) | |||
| Countess cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Diet-76A | ClearH2O | 72-07-5022 | |
| Dissection microscope | |||
| Ear puncher | |||
| Electric clippers | |||
| Fine angled forceps | Proscitech | DEF11063-07 | Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm |
| Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in | Cole Parmer | EW-06419-00 | |
| Foetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium | ThermoFisher Scientific | 14170120 | |
| Hydrogel | ClearH2O | 70-01-5022 | |
| Isoflurane | |||
| Kimwipes Low lint disposable wipers | Kimberly Clark- Kimwipes | Z188964 | |
| Mashed mouse chow | |||
| Meloxicam (METACAM) | |||
| Nose cone | Fashioned out of a microfuge tube | ||
| PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g) | Bausch and lomb | ||
| Povidone-iodine solution | Betadine | 2505692 | |
| PPE (glove, mask, gown, hairnet) | |||
| Retractors | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| RPMI 1640 Media | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm | Ethicon | JJ-640G | |
| Sterile normal saline | ThermoFisher Scientific | TM4469 | |
| Sticky tape | |||
| Surgical board | A chopping board wrapped with autoclavable bag. | ||
| Surgical scissors | Proscitech | T104 | Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm |
| Suture forcep/ Curved Brophy forceps | Proscitech | T113C | Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm |
| Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder) | Proscitech | TC1322-180 | length 190 mm, ratchet clamp |
| Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump | World Precision Instruments | UMP3-3 | |
| T75 tissue culture flask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Thread | |||
| Trigene II surface disinfectant | Ceva | ||
| Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| TrypLE Express dissociating medium | ThermoFisher Scientific | 12605010 |
References
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Reports. 14 (1), 48-54 (2012).
- Australian Institute of Health and Welfare. Cancer in Australia. , Canberra: AIHW. (2017).
- Maher, E. A., Mietz, J., Arteaga, C. L., DePinho, R. A., Mohla, S. Brain metastasis: opportunities in basic and translational research. Cancer Research. 69 (15), 6015-6020 (2009).
- Lin, N. U. Breast cancer brain metastases: new directions in systemic therapy. Ecancermedicalscience. 7, (2013).
- Zimmer, A. S., Van Swearingen, A. E. D., Anders, C. K. HER2-positive breast cancer brain metastasis: A new and exciting landscape. Cancer Reports. 5 (4), (2020).
- Brown, P. D., et al. Postoperative stereotactic radiosurgery compared with whole brain radiotherapy for resected metastatic brain disease (NCCTG N107C/CEC·3): a multicentre, randomised, controlled, phase 3 trial. Lancet Oncology. 18 (8), 1049-1060 (2017).
- Murrell, J., Board, R. The use of systemic therapies for the treatment of brain metastases in metastatic melanoma: Opportunities and unanswered questions. Cancer Treatment Reviews. 39 (8), 833-838 (2013).
- Stemmler, H. J., et al. Ratio of trastuzumab levels in serum and cerebrospinal fluid is altered in HER2-positive breast cancer patients with brain metastases and impairment of blood-brain barrier. Anticancer Drugs. 18 (1), 23-28 (2007).
- Venur, V. A., Leone, J. P. Targeted therapies for brain metastases from breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1543 (2016).
- Murthy, R., et al. Tucatinib with capecitabine and trastuzumab in advanced HER2-positive metastatic breast cancer with and without brain metastases: a non-randomised, open-label, phase 1b study. The Lancet Oncology. 19 (7), 880-888 (2018).
- Murthy, R. K., et al. trastuzumab, and capecitabine for HER2-positive metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 382 (7), 597-609 (2019).
- Shah, M., et al. FDA approval summary: Tucatinib for the treatment of patients with advanced or metastatic HER2-positive breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (5), 1220-1226 (2021).
- Vogelbaum, M. A., et al. Treatment for brain metastases: ASCO-SNO-ASTRO guideline. Journal of Clinical Oncology. 40 (5), 492-516 (2021).
- Ramakrishna, N., et al. Management of advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer and brain metastases: ASCO guideline update. Journal of Clinical Oncology. 10, (2022).
- Li, J., et al. A multifunctional polymeric nanotheranostic system delivers doxorubicin and imaging agents across the blood-brain barrier targeting brain metastases of breast cancer. ACS Nano. 8 (10), 9925-9940 (2014).
- Mittapalli, R. K., et al. Paclitaxel-hyaluronic nanoconjugates prolong overall survival in a preclinical brain metastases of breast cancer model. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (11), 2389-2399 (2013).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), 991-1001 (2015).
- Patil, R., et al. MRI virtual biopsy and treatment of brain metastatic tumors with targeted nanobioconjugates: nanoclinic in the brain. ACS Nano. 9 (5), 5594-5608 (2015).
- Brighi, C., et al. MR-guided focused ultrasound increases antibody delivery to non-enhancing high-grade glioma. Neuro-Oncology Advances. 2 (1), (2020).
- Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14 (5), 862-870 (1994).
- Priego, N., et al. Abstract 2746: Stat3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Cancer Research. 79, 2746 (2019).
- Wyatt, E. A., Davis, M. E. Method of establishing breast cancer brain metastases affects brain uptake and efficacy of targeted, therapeutic nanoparticles. Bioengineering & Translational Medicine. 4 (1), 30-37 (2018).
- Nakayama, J., et al. The in vivo selection method in breast cancer metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1886 (2021).
- Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. Intracarotid cancer cell injection to produce mouse models of brain metastasis. Journal of Visualized Experiments. 120, 55085 (2017).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Hu, X., Villodre, E. S., Woodward, W. A., Debeb, B. G. Modeling brain metastasis via tail-vein injection of inflammatory breast cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 168, (2021).
- Cho, J. H., et al. AKT1 activation promotes development of melanoma metastases. Cell Reports. 13 (5), 898-905 (2015).
- Meuwissen, R., et al. Induction of small cell lung cancer by somatic inactivation of both Trp53 and Rb1 in a conditional mouse model. Cancer Cell. 4 (3), 181-189 (2003).
- Kato, M., et al. Transgenic mouse model for skin malignant melanoma. Oncogene. 17 (14), 1885-1888 (1998).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Sulaiman, A., Wang, L. Bridging the divide: preclinical research discrepancies between triple-negative breast cancer cell lines and patient tumors. Oncotarget. 8 (68), 113269-113281 (2017).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. 91, 52017 (2014).
- Geisler, J. A., et al. Modeling brain metastases through intracranial injection and magnetic resonance imaging. Journal of Visualized Experiments. 160, (2020).
- Reid, Y., Storts, D., Riss, T., Minor, L., et al. in Assay Guidance Manual. eds Markossian, S. et al.) Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
- Janowicz, P. W., et al. Understanding nanomedicine treatment in an aggressive spontaneous brain cancer model at the stage of early blood brain barrier disruption. Biomaterials. , 283 (2022).
- Houston, Z. H., et al. Understanding the Uptake of Nanomedicines at Different Stages of Brain Cancer Using a Modular Nanocarrier Platform and Precision Bispecific Antibodies. ACS Cent Sci. 6 (5), 727-738 (2020).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46, 6387-6392 (1986).
- Clemons, T. D., et al. Distinction between active and passive targeting of nanoparticles dictate their overall therapeutic efficacy. Langmuir. 34 (50), 15343-15349 (2018).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), (2021).
- Masmudi-Martín, M., et al. Brain metastasis models: What should we aim to achieve better treatments. Advanced Drug Delivery Reviews. 169 (20), 79-99 (2021).
- Carney, C. P., et al. Harnessing nanomedicine for enhanced immunotherapy for breast cancer brain metastases. Drug Delivery and Translational Research. 11 (6), 2344-2370 (2021).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), Berlin, Germany. 991-1001 (2015).
- Bao, Y., et al. Synergistic chemotherapy for breast cancer and breast cancer brain metastases via paclitaxel-loaded oleanolic acid nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 17 (4), 1343-1351 (2020).
- Kotb, S., et al. Gadolinium-based nanoparticles and radiation therapy for multiple brain melanoma metastases: Proof of concept before phase I trial. Theranostics. 6 (3), 418-427 (2016).
- Zhang, T., et al. Multitargeted nanoparticles deliver synergistic drugs across the blood-brain barrier to brain metastases of triple negative breast cancer cells and tumor-associated macrophages. Advanced Healthcare Materials. 8 (18), 1900543 (2019).
- He, C., et al. Blood-brain barrier-penetrating amphiphilic polymer nanoparticles deliver docetaxel for the treatment of brain metastases of triple negative breast cancer. Journal of Controlled Release. 246, 98-109 (2017).
- Wang, X., et al. Enhanced anti-brain metastasis from non-small cell lung cancer of osimertinib and doxorubicin co-delivery targeted nanocarrier. International Journal of Nanomedicine. 15, 5491-5501 (2020).
- Gries, M., et al. Multiscale selectivity and in vivo biodistribution of NRP-1-targeted theranostic AGuIX nanoparticles for PDT of glioblastoma. International Journal of Nanomedicine. 15, 8739-8758 (2020).
