Summary

Messung der Kompressibilität von Zelle und Zellkern mittels akustofluidischem Mikrogerät

Published: July 14, 2022
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Summary

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um ein schnelles und zerstörungsfreies System zur Messung der Zell- oder Kernkompressibilität basierend auf akustofluidischen Mikrogeräten aufzubauen. Veränderungen der mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen nach epithelial-mesenchymalem Übergang oder ionisierender Strahlung wurden untersucht, was die Anwendungsperspektive dieser Methode in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Praxis aufzeigt.

Abstract

Die Zellmechanik spielt eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung, der malignen Transformation von Zellen und der Strahlenempfindlichkeit. Während dieser Prozesse ist die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften der Zellen oft eine Herausforderung. Konventionelle Messmethoden, die auf Kontakt basieren, wie Kompression oder Dehnung, neigen dazu, Zellschäden zu verursachen, was die Messgenauigkeit und die anschließende Zellkultur beeinträchtigt. Messungen im adhärenten Zustand können auch die Genauigkeit beeinträchtigen, insbesondere nach der Bestrahlung, da ionisierende Strahlung Zellen abflacht und die Adhäsion verbessert. Hier wurde ein zellmechanisches Messsystem entwickelt, das auf einer akustofluidischen Methode basiert. Die Zellkompressibilität kann durch Aufzeichnung der Zellbewegungsbahn unter Einwirkung der akustischen Kraft erreicht werden, wodurch eine schnelle und zerstörungsfreie Messung im suspendierten Zustand realisiert werden kann. In diesem Artikel werden die Protokolle für Chipdesign, Probenvorbereitung, Trajektorienaufzeichnung, Parameterextraktion und -analyse ausführlich beschrieben. Anhand dieser Methode wurde die Kompressibilität verschiedener Tumorzelltypen gemessen. Die Messung der Kompressibilität des Kerns wurde ebenfalls durch Anpassung der Resonanzfrequenz der piezoelektrischen Keramik und der Breite des Mikrokanals erreicht. In Kombination mit der molekularen Verifikation von Immunfluoreszenzexperimenten wurde die Zellkompressibilität vor und nach dem medikamenteninduzierten epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT) verglichen. Weiterhin wurde die Veränderung der Zellkompressibilität nach Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Dosen aufgedeckt. Die in dieser Arbeit vorgeschlagene zellmechanische Messmethode ist universell und flexibel und hat breite Anwendungsperspektiven in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Praxis.

Introduction

Zellmechanische Eigenschaften spielen eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung, der malignen Transformation von Zellen und der Strahlenempfindlichkeit 1,2. Um ein tiefes Verständnis der Rolle der zellmechanischen Eigenschaften in dem oben genannten Prozess zu erlangen, ist eine genaue Messung der Zellmechanik von entscheidender Bedeutung, und die Messung sollte keine Schäden an den Zellen für die anschließende Kultur und Analyse verursachen. Der Messprozess sollte so schnell wie möglich sein, da sonst die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigt werden kann, wenn Zellen für längere Zeit aus der Kultivierungsumgebung entfernt werden.

Bestehende zellmechanische Messmethoden stoßen auf einige Einschränkungen. Einige Methoden, wie die magnetische Drehzytometrie, die Magnetpinzette und die Partikelverfolgungsmikrorheologie, verursachen Zellschäden durch die Einführung von Partikeln in Zellen 3,4,5. Methoden, die durch Kontakt mit Zellen messen, wie Rasterkraftmikroskop (AFM), Mikropipettenaspiration, Mikrokonstriktion und Parallelplattentechnik, sind ebenfalls anfällig für Zellschäden und der Durchsatz ist schwer zu erhöhen 6,7,8. Darüber hinaus wird ionisierende Strahlung Zellen abflachen und ihre Adhäsion erhöhen9; Es ist daher notwendig, die Ganzzellmechanik in Suspension zu messen.

Als Antwort auf die oben genannten Herausforderungen wurde ein zellmechanisches Messsystem entwickelt, das auf der akustofluidischen Methode 10,11,12,13,14 basiert. Die Kanalbreite ist auf die akustische Halbwellenlänge abgestimmt, wodurch ein stehender Wellenknoten an der Mittellinie des Mikrokanals entsteht. Unter Einwirkung der akustischen Strahlungskraft können sich die Zellen oder Standardperlen zum akustischen Druckknoten bewegen. Da die physikalischen Eigenschaften der Standardkügelchen (Größe, Dichte und Kompressibilität) bekannt sind, kann die akustische Energiedichte bestimmt werden. Dann kann die Zellkompressibilität durch Aufzeichnung der Bewegungsbahnen von Zellen im akustischen Feld erhalten werden. Eine zerstörungsfreie Hochdurchsatzmessung von Zellen im Suspensionszustand kann erreicht werden. In diesem Beitrag werden das Design des mikrofluidischen Chips, der Aufbau des Systems und die Messschritte vorgestellt. Es wurden verschiedene Arten von Tumorzellen gemessen, um die Genauigkeit der Methode zu überprüfen. Der Anwendungsbereich dieser Methode wurde durch Anpassung der Resonanzfrequenz der piezoelektrischen Keramik und der Breite des Mikrokanals auf subzelluläre Strukturen (z.B. Kern) erweitert. Darüber hinaus wurden die Veränderungen der Zellkompressibilität nach medikamenteninduzierter EMT- oder Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Dosen untersucht. Die Ergebnisse zeigen die breite Anwendbarkeit dieser Methode als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Korrelation zwischen biochemischen Veränderungen und zellulären mechanischen Eigenschaften.

Protocol

1. Herstellung und Montage des akustofluidischen Mikrogeräts Herstellung des mikrofluidischen Chips.Entwerfen Sie einen Einkanalchip mit nur einem Ein- und Auslass, wie in Abbildung 1 dargestellt. Für Messzellen ist der rechteckige Querschnitt des Mikrokanals bei 740 μm Breite und 100 μm Tiefe zu halten. Um den Zellkern zu messen, ändern Sie die Breite und Tiefe des Mikrokanals auf 250 μm bzw. 100 μm. Bereiten Sie den Mikrokanal auf Silizi…

Representative Results

Hier stellte die Arbeit ein Protokoll für den Aufbau eines schnellen und zerstörungsfreien Zellkompressibilitätsmesssystems auf Basis eines akustofluidischen Mikrogeräts vor und demonstrierte dessen Vorteile für die Messung von Zelle und Kern unter verschiedenen Situationen. Abbildung 1 zeigt das Schema des mikrofluidischen Kanals. Die Komponenten und der Aufbau des akustofluidischen Mikrogeräts sind in Abbildung 2 dargestellt. Abbildu…

Discussion

Häufig verwendete zellmechanische Messmethoden sind AFM, Mikropipettenaspiration, mikrofluidische Methoden, Parallelplattentechnik, optische Pinzette, optische Trage und akustische Methoden20. Mikrofluidik-Methoden können mit drei Ansätzen arbeiten: Mikroverengung, Dehnströmung und Scherströmung. Unter ihnen sind optische Stretcher, optische Pinzetten, akustische Methoden, Dehnströmung und Scherströmungsansätze berührungslose Messungen. Im Gegensatz zu Kontaktmessungen können berührungs…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Förderkennzeichen 12075330 und U1932165) und der Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, China (Förderkennzeichen 2020A1515010270) unterstützt.

Materials

0.25% trypsin(1x) GIBCO 15050-065
502 glue Evo-bond cyanoacrylate glue
A549 ATCC CCL-185 lung adenocarcinoma
Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit Beyotime P0027 Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  corning 10-013-CVRC
Fetal Bovine Srum(FBS) AUSGENEX FBS500-S
HCT116 ATCC CCL247 colorectal carcinoma
Heat-resistant glass Pyrex
Leibovitz’s L-15 medium  GIBCO 11415-064
MCF-7 ATCC HTB-22  breast Adenocarcinoma
MDA-MB-231 ATCC HTB-26  breast Adenocarcinoma
Minimum Essential Medium (MEM) corning 10-010-CV
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15140-122
Phosphate buffer corning 21-040-cvc
PMSF Beyotime ST506 100mM
Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere  polysciences 15714 The diameter of microshpere is 6.00µm
propidium iodide(PI) Sigma-Aldrich P4170
SYLGARD 184Silicone ELASTOMER Dow-Corning 1673921 Contains prepolymers and curing agents
Trypan Blue Beyotime C0011

References

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Cite This Article
Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu, Y. Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice. J. Vis. Exp. (185), e64225, doi:10.3791/64225 (2022).

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