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Biology

重组和表征具有可调电机驱动动力学和力学的肌动蛋白-微管复合材料

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64228
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1, 1
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College, 3Department of Physics, Syracuse University

ERRATUM NOTICE

Summary

本文提出了用于工程和表征共纠缠肌动蛋白丝和微管的可调谐三维复合网络的协议。复合材料在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下经历主动重组和弹道运动，并由肌动蛋白、微管、运动蛋白和被动交联剂的相对浓度进行调整。

Abstract

复合细胞骨架由半柔性肌动蛋白丝和刚性微管的相互作用网络组成，使用肌球蛋白II和驱动蛋白等运动蛋白重组并产生力，以驱动迁移，细胞分裂，粘附和机械传感等关键过程。虽然肌动蛋白 - 微管相互作用是细胞骨架多功能性和适应性的关键，但对它们与肌球蛋白和驱动蛋白活性相互作用的理解仍然处于起步阶段。这项工作描述了如何设计共缠缠的肌动蛋白丝和微管的可调谐三维复合网络，这些网络在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下进行主动重组和弹道运动，并由肌动蛋白，微管，运动蛋白和被动交联剂的相对浓度进行调整。还详细介绍了微管和肌动蛋白丝的荧光标记方案，以使用多光谱共聚焦成像最有效地可视化复合材料重组和运动。最后，给出了可用于定量表征非平衡结构、动力学和力学的数据分析方法的结果。重新创建和研究这种可调谐仿生平台为耦合运动活动、复合力学和细丝动力学如何导致从有丝分裂到极化再到机械感觉的无数细胞过程提供了有价值的见解。

Introduction

细胞骨架是相互作用的生物聚合物的动态复合网络，为细胞提供结构和机械支持。相关的分子马达和结合蛋白重组和调整细胞骨架，使细胞生长、改变形状、变硬、移动甚至自我修复，从而实现从迁移和分裂到机械传感的无数细胞过程1，2。除了在细胞生物物理学中的重要性之外，细胞骨架也是活性物质的典型例子，其潜在材料应用范围从伤口愈合和药物输送到过滤和软机器人1，3，4，5，6，7，8，9。

赋予细胞骨架独特的结构和机械多样性以及多功能性的两个关键特征是：1）其复合性质，包括多种相互作用的蛋白质丝，例如半柔性肌动蛋白丝和刚性微管，以及它们相关的结合和交联蛋白3，5，10;2）它能够通过肌球蛋白和驱动蛋白等耗能电机连续重组、移动、粗化和执行工作，推动和拉动丝状蛋白1，7，11，12，13。虽然这种优雅的复杂性使细胞骨架能够介导细胞运动、细胞分裂和伤口愈合等多种过程3，6，7，11，但它阻碍了研究人员在体外重建系统中重现细胞骨架体内特征的能力。

目前的前沿重建工作集中在缠结和交联的肌动蛋白丝和微管3，10，14，15，16，17，产生力的肌动蛋白网络2，8，18，19，20，21的复合物，以及由驱动蛋白 - 微管驱动的活性向列相互作用22，23，24，25，26。稳态肌动蛋白-微管复合材料已被证明具有紧急机械性能15，16，27，例如与单组分系统相比，灯丝流动性增强和刚度增加27。对体外肌动肌蛋白系统的研究报告了广泛的结构和动力学特性，这些特性取决于肌动蛋白、肌球蛋白和交联剂的浓度28，29，30，31。例如，在充分交联的情况下，肌动球蛋白网络经历大规模收缩和粗化2，28，30，32，33，34，35，36，而没有交联剂，网络表现出快速，不稳定的流动和破裂19，29.据报道，使用驱动蛋白马达簇交联和拉动微管束的基于微管的重组主动向列具有持久的湍流、延伸、屈曲、破裂和愈合12，22，23，24，25，37，38，39，40，41， 42，43，44，45，46，47.

最近，与无交联剂的肌动球蛋白网络表现出17，26，48的无序流动和网络破裂相比，由肌球蛋白II微丝驱动的肌动蛋白-微管复合材料已被证明会导致更有序的收缩和网络完整性。此外，当肌动蛋白和微管以相当的浓度存在时，复合材料稳健性和力生成的组合得到优化。配方空间这一区域的关键新兴特征包括增强的机械强度26，肌动蛋白和微管的协调运动26，稳定的持续收缩和中尺度重组17。

在这里，描述了设计和调整微管和肌动蛋白丝的共纠缠和交联复合材料，这些微管和肌动蛋白丝分别被肌球蛋白II迷你丝和驱动蛋白簇推出平衡，分别作用于肌动蛋白丝和微管（图1）。这类复合材料的动力学、结构和力学可以通过灯丝、电机和交联剂的相对浓度进行调整，以表现出丰富的平流和湍流、各向同性收缩、加速、减速、解混、硬化、松弛和破裂的相空间。这项工作的重点是制备和调整这类活性细胞骨架复合材料。然而，为了帮助研究人员对所描述的活性复合材料进行基准测试和表征，还详细介绍了使用多光谱共聚焦显微镜的有效成像方法。最后，介绍了可用于测量复合材料动力学、结构和力学的关键计算分析方法的结果。鼓励研究人员采用这些方法，包括差分动态显微镜（DDM），空间图像自相关（SIA）和粒子图像测速法（PIV），因为它们已经过优化，可以表征复合材料的复杂动力学和结构多样性17，26，49。

下面描述的步骤侧重于制备复合材料并使用共聚焦显微镜对其进行成像。描述采集后数据分析和光镊测量的协议可以在以前的著作17，26，48，50中找到，并可根据要求提供。所有材料均列在提供的材料表中。

Protocol

1. 准备硅烷化盖玻片和显微镜载玻片，以防止蛋白质吸附到腔室表面

注意：这是一个为期 2 天的过程。硅烷化载玻片可在使用前1个月制备。

  1. 将 1 号盖玻片 （24 mm x 24 mm） 和显微镜载玻片（1 英寸 x 3 英寸）放入适合等离子清洗器的指定架中。将架子放入等离子清洁器中并运行20分钟。
  2. 将盖玻片和载玻片转移到指定用于硅烷的新架子上，并将载玻片放入玻璃容器中以清洁玻璃杯，如下所述。
    1. 将盖玻片和载玻片浸入100%丙酮中1小时。将盖玻片和载玻片浸入100%乙醇中10分钟。
    2. 将盖玻片和载玻片浸入去离子水（DI）中5分钟。再重复清洁步骤两次。
    3. 将盖玻片和载玻片浸入新鲜制备的0.1M KOH中15分钟。将盖玻片和载玻片浸入新鲜DI中5分钟。再重复此步骤两次。
  3. 风干盖玻片和载玻片10分钟。用硅烷处理清洁的盖玻片和载玻片，以产生疏水表面，如下所述。
    注意：在通风橱中完成以下步骤。
    1. 将干燥的盖玻片和载玻片浸入2%硅烷（溶解在甲苯中）中5分钟。使用漏斗将硅烷倒回其指定的瓶子中，最多可重复使用五次。
    2. 将盖玻片和载玻片浸入100%乙醇中5分钟。用新鲜乙醇代替乙醇。将盖玻片和载玻片浸泡5分钟。
    3. 将盖玻片和载玻片浸入新鲜DI中5分钟。每次使用新鲜乙醇和DI重复乙醇和DI洗涤步骤两次。风干盖玻片和载玻片10分钟。

2. 肌球蛋白微丝驱动活性肌动蛋白-微管复合物的制备

  1. 通过肌动蛋白丝结合 去除 无活性的肌球蛋白，并通过超速离心 进行 下拉，如下所述。
    1. 将肌动蛋白聚合成细丝。使用精密微量移液器和无菌移液器吸头，在微量离心管中混合：1.87 μL DI、1.3 μL 10x G 缓冲液、1.3 μL 10x F 缓冲液、1.63 μL 4 M KCl、4.53 μL 肌动蛋白 （47.6 μM） 和 1.08 μL 100 μM 鬼笔环肽。
      注意：为确保充分聚合，肌动蛋白浓度和肌动蛋白：鬼笔环肽摩尔比应分别为18.4μM和2：1。
    2. 轻轻地上下移液溶液以混合，然后在黑暗中放在冰上≥1小时。将超速离心机冷却至4°C。 从-80°C取出肌球蛋白等分试样并放在冰上。
      注意：此时完成步骤2.2，而肌动蛋白正在聚合。
    3. 肌动蛋白聚合 ≥1 小时后，向聚合的肌动蛋白中加入 1.3 μL 10 mM ATP 和 2 μL 19 μM 肌球蛋白。
      注意：肌动蛋白：肌球蛋白摩尔比应为>5，以确保充分去除不活跃的肌球蛋白马达（即死头）。
    4. 轻轻地上下移液以混合。转移到超速离心机级管中。
      在4°C和121，968× g 下离心30分钟。
  2. 制备肌动蛋白丝和微管的共缠结复合网络，如下所述。
    注意：肌球蛋白旋转前30分钟开始（步骤2.1.4）。
    1. 将加热块设置为37°C。 使用精密微量移液器和无菌移液管吸头将以下内容添加到微量离心管中：13.9 μL PEM、3 μL 1% 吐温20、1.55 μL 47.6 μM 肌动蛋白、0.36 μL 34.8 μM R-肌动蛋白、0.3 μL 250 mM ATP、0.87 μL 100 μM 鬼笔环肽、1.91 μL 5-488-微管蛋白、0.3 μL 100 mM GTP， 和 0.75 μL 的 200 μM 紫杉醇，总体积为 23 μL。
      注意：列出的肌动蛋白和微管蛋白的浓度适用于具有2.9μM肌动蛋白和2.9μM微管蛋白的复合材料。总蛋白质浓度为 c = c A + c T = 5.8 μM，摩尔肌动蛋白部分为 c A/（c A + cT） = Φ A = 0.5。请参阅步骤 2.5 以调整这些值。
    2. 轻轻地上下移液以混合并置于37°C加热块上避光1小时。
  3. 准备用于共聚焦成像实验的样品室，如下所述。
    注意：在等待期间完成步骤 2.1.4 和 2.2.2。
    1. 将两个硅烷化载玻片并排放在热板上（关闭），在载玻片上放置两条热塑性密封膜条~3mm，并将两个硅烷化盖玻片放在热塑性密封膜上以形成样品室。
    2. 将热板置于低设置状态，直到盖玻片牢固地与带有熔化的热塑性密封膜的载玻片结合（~1-2分钟）。用均匀的压力向下压以确保粘合，同时保持两个表面之间的~100μm间距。
    3. 移除腔室并关闭热板。用 （+） 和 （-） 标记腔室。（+）腔室将用于活性样品（带肌球蛋白），（-）室将用于对照（无肌球蛋白）。确保每个腔室可容纳 ≤10 μL 液体。
  4. 准备样品进行成像，如下所述。
    注意：请务必在完成步骤 2.1 和 2.2 后立即完成此步骤。
    1. 小心地从超速离心机（步骤2.1.4）中取出肌球蛋白-肌动蛋白样品，并立即吸取顶部7.5μL的上清液并转移到新的微量离心管中。
    2. 从加热块中取出肌动蛋白-微管样品，轻轻混合 1.5 μL 10x D-葡萄糖、1.5 μL 10x GOC 和 1.5 μL 1 mM 布比他汀。将溶液分成两个 13.7 μL 等分试样，并标记为 （+） 和 （-）。
    3. 从步骤2.4.1混合1.28μL上清液至（+）等分试样。将 1.28 μL DI 混合至 （-） 等分试样。通过毛细管作用 将 每种溶液缓慢流入相应的腔室（步骤2.3）。注意不要将气泡引入通道。
    4. 用快干环氧树脂或UV胶密封每个通道的两个开口端。在放在显微镜上之前，请确保粘合剂完全干燥。立即按照步骤 3 中的说明进行映像。
      注意：UV胶是有利的，因为它在紫外线照射后几乎立即固化。然而，由于布比他汀对紫外线敏感，因此重要的是仅使用小紫外棒局部照射胶水（样品室边缘），以避免布比他汀失活。
  5. 可选：改变蛋白质浓度以调整复合材料的动力学和结构。
    注意：如果需要，建议对上述步骤进行以下步骤的更改，以改变肌动蛋白，微管和肌球蛋白的浓度。
    1. 执行上述步骤，步骤 2.2.1 和 2.4.3 中的以下修改除外。
    2. 为了改变肌动蛋白和微管的浓度，从而调节 c 和 ΦA，根据需要增加或减少步骤2.2.1中使用的肌动蛋白，R-肌动蛋白和5-488-微管蛋白的体积26。当改变肌动蛋白浓度时，按比例调整R-肌动蛋白和鬼笔环肽摩尔浓度，以保持与肌动蛋白相同的摩尔比。调整 PEM 的体积，使混合物的最终体积保持在 23 μL。所有其他成分体积和浓度保持不变。
    3. 为了改变肌球蛋白浓度，根据需要调整添加到步骤2.4.3中（+）等分试样中的肌球蛋白的体积。相应地调整添加到 （-） 等分试样中的 DI 体积。调整步骤 2.2.1 中的 PEM 体积，以考虑肌球蛋白 （+） 和 DI （-） 体积的增加或减少，确保每个样品 （（+） 和 （-）） 的最终体积为 14.98 μL。

3. 使用共聚焦显微镜对活性复合材料进行成像和表征

  1. 要对步骤2中制备的肌动蛋白-微管复合材料进行成像，请使用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）或类似显微镜，并带有60x 1.4 NA油浸物镜。要在单独的荧光通道中同时可视化肌动蛋白丝和微管，请使用带有 565/591 nm 激发/发射滤光片的 561 nm 激光器和带有 488/525 nm 激发/发射滤光片的 488 nm 激光器。
  2. 将样品室放在显微镜上，使控制通道直接位于物镜上方。确保物镜和盖玻片之间有油界面。
  3. 使用载物台控件使对照复合材料聚焦，然后找到样品室的两个表面。将z位置移动到样品室的中心。检查是否存在清晰的丝状网络，如图 2 所示。
  4. 仍然可视化控制室，调整每个激光的强度，以允许同时可视化肌动蛋白丝和微管。保持尽可能低的激光强度，以防止光漂白（在肌动蛋白通道中更普遍）和渗漏（通常从微管渗入肌动蛋白通道）。
  5. 要表征非活性对照样品，请以 2.65 fps 的速度收集三个 256 x 256 平方像素 （213 μm x 213 μm） 图像的时间序列（视频），总共 ≥1000 帧。将每个时间序列收集在样品室的不同区域中，间隔≥500μm。确保有最小的可检测运动，没有流动或重组。
  6. 关闭 488 nm 激光并使用载物台控件移动到 （+） 室。
  7. 使用 568 nm 激光，可视化 （+） 通道中的微管以确保正确的网络形成（图 2）并确定样品室的轴向中心（可能与控制室的中心 z 位置不同）。
  8. 打开 488 nm 激光器并重复上述步骤 3.5，并进行以下修改。收集时间序列长达 45 分钟，当样品移出视野、破裂或光漂白时停止采集。记录 5-10 个时间序列，并跟踪每个时间序列相对于第一个时间序列开始的时间。
  9. 使用 DDM、SIA 和 PIV 分析数据，如图 3、图 4、图 5 和之前的17、48、50、51 中所述。
    注意：488 nm激光通过使布比他汀失活来局部激活肌球蛋白ATP酶活性，因此只能在数据采集开始时打开，以便t = 0在时间序列开始时。这些采集参数针对差示动态显微镜（DDM）分析进行了优化，如前所述26。

4. 驱动蛋白电机驱动活性肌动蛋白-微管复合材料的制备

注意：以下步骤创建肌动蛋白 - 微管复合材料，这些复合材料由驱动蛋白马达或驱动蛋白和肌球蛋白50的组合驱动不平衡。

  1. 如下所述准备驱动蛋白和肌球蛋白马达。
    1. 如果加入肌球蛋白，请按照步骤 2.1 操作。
    2. 为了形成在微管对之间结合并施加力的驱动蛋白运动簇，请使用微量移液器和无菌移液器吸头将以下内容添加到无菌 1.5 mL 微量离心管中：1.16 μL PEM、2.74 μL 8.87 μM 驱动蛋白二聚体、7.29 μL 83.3 μM 中性亲和素、0.81 μL 2mM DTT。通过上下移液溶液轻轻混合，并在4°C下避光孵育（使用黑色微量离心管或用箔纸包裹）30分钟。
      注意：驱动蛋白二聚体与NA的摩尔比为1：25。
  2. 按照步骤2.3准备样品室并制作三个腔室而不是两个。在驱动蛋白孵育（步骤4.1.2）和肌球蛋白超速离心（步骤4.1.1）期间执行此步骤。
  3. 制备肌动蛋白丝和微管的共缠结复合网络。
    1. 将加热块设置为37°C。 使用微量移液器和无菌移液管吸头将以下内容添加到无菌 1.5 mL 微量离心管中：3.21 μL PEM、4.5 μL 1% Tween20、2.18 μL 47.6 μM 肌动蛋白、3.46 μL 5-R-微管蛋白、4.5 μL 100 mM ATP、4.5 μL 10 mM GTP、1.13 μL 200 μM 紫杉醇和 1.57 μL 20 μM 488-鬼笔环肽。确保总体积为 25 μL。
    2. 轻轻地上下移液溶液以混合并放置在37°C加热块上避光1小时。从加热块中取出试管，并使用微量移液器轻轻混合 0.84 μL 100 μM 鬼笔环肽。在室温下孵育5-10分钟，避光。
      注意：在此步骤而不是步骤4.3.1中添加鬼笔环肽可改善肌动蛋白丝的荧光标记，因为488-鬼笔环肽不必与未标记的鬼笔环肽竞争肌动蛋白结合位点。
  4. 准备用于共聚焦成像的活性复合材料。
    1. 向步骤 4.3.2 中的溶液中加入 1.13 μL 200 μM 贝比他汀、1.35 μL 10x Glu 和 1.35 μL 10x GOC，并通过上下移液轻轻混合。将溶液分成三个 10 μL 等分试样，并标记为 （K）、（K+M） 和 （-）。
    2. 将步骤 2.1.4 中的 2.54 μL 肌球蛋白混合至 （K+M） 等分试样。将 2.54 μL PEM 混合至 （K） 和 （-） 等分试样。
    3. 使用微量移液器和无菌移液管吸头将步骤 4.1.2 中的 2.5 μL 驱动蛋白簇添加到 （K） 和 （K+M） 等分试样中。上下移液混合。使用相同的技术将 2.5 μL PEM 混合至 （-）。
      注意：列出的肌动蛋白和微管蛋白的浓度适用于具有2.32μM肌动蛋白和3.48μM微管蛋白的复合材料。总蛋白质浓度为 c = c A + c T = 5.8 μM，摩尔肌动蛋白部分为 c A/（c A + cT） = Φ A = 0.4。驱动蛋白和肌球蛋白浓度分别为0.35μM和0.47μM。有关调整 c A、c T、c和 ΦA 的一般准则，请参阅步骤 2.5。
    4. 使用微量移液器，通过毛细管作用 将 每种溶液缓慢地流入制备的样品室的相应通道（步骤4.2）。非常缓慢地轻轻地向下推移液管，以免将气泡引入通道。
    5. 用快干环氧树脂或紫外线固化胶密封每个通道的两个开口端。在放在显微镜上之前，请确保粘合剂完全干燥。
      注意：重要的是，此步骤必须快速完成，以最大程度地减少驱动蛋白在没有被监控的情况下起作用的时间。因此，建议使用在1分钟（而不是5或10分钟）内固化的环氧树脂。紫外光固化胶水在这方面是有利的，因为它在紫外线照射下几乎立即固化。
  5. 立即按照步骤3制备样品的图像，但以下重要修改除外。由于驱动蛋白不受光激活控制，因此它在步骤4.4.3之后立即开始工作，因此将此时间标记为t = 0。要对复合材料成像尽可能接近初始非活动状态（t = 0），请先对（K）和（K+M）通道进行成像，并记下步骤4.4.3和数据采集开始（步骤3.8）之间经过的时间。在实践中，这个经过的时间是~5分钟。

5. 将被动交联剂掺入活性复合材料中

注意：这些步骤描述了如何在步骤4中描述的活性复合材料中使用生物素化的肌动蛋白和微管蛋白亚基以及中性亲和素（NA）被动交联肌动蛋白到肌动蛋白（A-A）或微管到微管（M-M）。

  1. 以 2：2：1 的生物素-肌动蛋白或生物素-微管蛋白）、NA 和生物素的比例制备 A-A 或 M-M 交联剂复合物。在步骤 4 之前开始此过程。
    1. 对于 A-A 交联剂，使用微量移液器和无菌移液器吸头向微量离心管中加入 2 μL 11.6 μM 生物素-肌动蛋白、1.39 μL 8.33 μM NA、2.27 μL 1.02 μM 生物素和 4.34 μL PEM。通过上下移液轻轻混合。
    2. 对于 M-M 交联剂，使用微量移液器和无菌移液器吸头向微量离心管中加入 1.86 μL 4.55 μM 生物微管蛋白、1.11 μL 8.33 μM NA、1.82 μL 1.02 μM 生物素和 5.21 μL PEM。通过上下移液轻轻混合。
    3. 将步骤5.1.1和/或5.1.2中的管子包裹在热塑性密封膜中，以形成防水密封。放入浮选筏中，置于设置为4°C的温控超声仪浴中。
    4. 在4°C超声处理90分钟。 在实践中，最好将超声仪放在冷藏室中，并在超声浴中加入冰袋以保持低温。
  2. 要将交联剂复合物掺入样品中进行成像，请按照步骤4.3修改步骤4.3.1，如下所述A-A交联（步骤5.2.1）或M-M交联（步骤5.2.2）。
    1. 对于 A-A 交联，在微量离心管中组合以下内容：1.94 μL PEM、4.50 μL 1% 吐温20、2.18 μL 47.6 μM 肌动蛋白、3.46 μL 45.5 μM 5-R-微管蛋白、1.13 μL A-A 交联剂（步骤 5.1.1）、4.50 μL 100 mM ATP、4.50 μL 10 mM GTP、1.13 μL 200 μM 紫杉醇， 和 1.57 μL 20 μM 488-鬼笔环肽。确保总体积为 25 μL。
    2. 对于 M-M 交联，在微量离心管中合并以下内容：1.97 μL PEM、4.50 μL 1% 吐温20、2.18 μL 47.6 μM 肌动蛋白、3.76 μL 45.5 μM 5-R-微管蛋白、1.13 μL 1：4 稀释的 M-M 交联剂（步骤 5.1.2）、4.50 μL 100 mM ATP、4.50 μL 10 mM GTP、1.13 μL 200 μM 紫杉醇， 和 1.57 μL 20 μM 488-鬼笔环肽。确保总体积为 25 μL。
  3. 按照步骤4.3.2-4.5，交联剂：肌动蛋白摩尔比RA = 0.02和交联剂：微管蛋白摩尔比RT = 0.005的特定浓度。这些R A和R T值导致沿肌动蛋白丝和微管的交联剂之间的长度相似（d A 60 nm和dMT Equation 1 67 nm），使用d A = I单体/ 2R AEquation 1估计，其中I单体是肌动蛋白单体的长度，dMT = I环/ 26R T，其中I环是13个微管蛋白15的环的长度，17.

Representative Results

为了确定活性复合材料的成功制备（图1），并表征其动力学和结构，使用具有至少两个荧光通道的激光扫描荧光显微镜同时观察肌动蛋白丝和微管（图2和图6）。复合材料中的所有肌动蛋白丝和微管都被稀疏标记，而不是像体外研究中经常做的那样在示踪剂亮丝中掺杂。这种方法确保测量的动力学和结构代表复合材料本身，而不是在与复合材料不同的条件下形成的示踪剂。因此，通常无法分辨单个肌动蛋白丝和微管，而是图像描绘了中尺度网络结构（图2和图6）。

这种标记方法针对空间图像自相关（SIA）和差分动态显微镜（DDM）分析进行了优化，这些分析检查了倒数傅里叶空间中的动力学和结构（图4，图5和图8）52，53，54，55。粒子图像测速法（PIV）也可用于描绘和表征动力学和流场（图3和图7），但它需要像素分箱（较低的空间分辨率）和比SIA和DDM更大的滞后时间增量（较低的时间分辨率），以消除由密集、低信号图像中的噪声引起的错误矢量。尽管如此，建议使用PIV对流场进行定性检查并证实DDM结果（图4和图8）26，50。

提供使用这些分析（即DDM，SIA，PIV）的所描述网络的样本表征，以帮助研究人员采用类似的分析来对其样本进行基准测试和表征。但是，对这些技术的详细说明超出了这项工作的范围。有关如何在这些系统和其他类似系统上执行DDM的详细说明，包括用户友好的Python代码，请参阅以前的著作17，26，49，50及其中的参考文献。有关如何在此处描述的系统上执行SIA和PIV的详细信息，读者将定向到以前的作品17，50。

应执行以下几项控制，以确保复合材料按预期运行。不含肌球蛋白或驱动蛋白的复合材料应基本上是静态的，热波动或漂移最小。肌动蛋白丝和微管应呈现共缠和均匀分布，在~200 μm x 200 μm的视野中，肌动蛋白和微管的捆绑、聚集或相分离最小（图2，最左边）17。对于含有肌球蛋白但不暴露在488nm光下（使blebbirtin失活）的复合材料，人们应该期待类似的结果。

在掺入肌球蛋白并暴露于 488 nm 光下时，复合材料经历的收缩在很大程度上是各向同性的，肌动蛋白和微管相似，如肌球蛋白活性前后拍摄的显微镜图像所示（图 2），以及活动期间不同时间的相应 PIV 流场（图 3）。为了确定运动是否是弹道的、扩散的、亚扩散的等，从DDM确定的特征去相关时间τ（q）被评估为波矢量（即倒数空间）的函数。详见前面详述的17，26，49。 图 4 还演示了如何使用 DDM 来表征这些复合材料。幂律缩放τ（q）~1/vq β，β = 1，表示速度为v的弹道运动。作为参考，β = 2 表示扩散动力学，其中 v 是扩散系数。所有活性复合材料都表现出弹道缩放（图4A），其速度由肌动蛋白和肌球蛋白的浓度调整（图4B），并且在活动期间可以随时间变化，加速或减速（图4C，D）。

网络重组和聚类，在图2中可见，对于较高的肌动蛋白和肌球蛋白浓度更为明显，可以使用SIA表征，如图5所示，如前面17，48，50所述。简而言之，相关长度ξ是图像中特征大小的度量，可以通过将每个空间强度自相关曲线g（r）拟合到像素之间距离r的指数函数来确定。持续较长距离的较大g（r）峰表明较大的结构特征（即，单个细丝的捆绑，聚集）。如图5所示，对于较高的肌动蛋白分数和肌球蛋白浓度，显着的重组和聚集反映在ξ随时间的增加上。

活性复合材料的粘弹性能和非线性力学响应也可以使用光镊微流变学（OTM）进行测量。然而，这些实验的协议和代表性结果不在这项工作的范围之内。有兴趣的读者可以参考以前的著作48，56，其中详细描述了如何执行OTM测量和预期结果。

使用上述相同的实验和分析工具程序，以下部分描述了当驱动蛋白马达和生物素-NA交联剂掺入复合材料时动力学和结构如何变化（图6，图7和图8）。图6显示了由仅驱动蛋白（K）或驱动蛋白和肌球蛋白（K + M）驱动的复合材料的代表性共聚焦图像，有和没有肌动蛋白丝或微管的被动交联（XL）。

将驱动蛋白掺入复合材料中最初会产生与肌球蛋白驱动的复合材料相似的动力学和重组，如图7（第1类）的第一行所示。然而，动力学通常会过渡到大规模的各向异性流动（图 7 中行，2 类）、加速和减速（图 7 底行，3 类）。这些特征在5-30分钟后与中尺度聚类和聚集耦合（图6和图8B）。图7所示的PIV生成的流场和时间色图描述了各向同性重组（1类，上图）、定向流（2类，中间图）和双向加速度（3类，底图）的示例。

通过拟合τ（q）曲线确定的活动期间不同时间点的肌动蛋白和微管的速度说明了加速后减速（图8），这取决于交联。如图8所示，当两种运动蛋白掺入时，动力学实际上比仅驱动蛋白的复合材料慢，并且中尺度流动的开始延迟。肌球蛋白还支持肌动蛋白和微管网络在整个活动期间更均匀的相互渗透，以及更少的聚集和重组。这些效应可以在图6中的图像中看到，并通过SIA计算的时变相关长度进行量化，在肌球蛋白存在的情况下，时变相关长度通常较小（图8B）。

Figure 1
图1.具有多个力产生马达和被动交联剂的活性肌动蛋白-微管复合材料的设计和表征。（A）肌动蛋白单体和微管蛋白二聚体在摩尔浓度c A和c T为0.73-11.6μM以及肌动蛋白Φ A = c A/（c A + c T）= 0，0.25，0.5，0.75和1的摩尔分数下共聚合，形成肌动蛋白丝（绿色）和微管（红色）的共缠结网络。使用NA连接生物素化的肌动蛋白丝（肌动蛋白XL）或微管（MT XL），肌动蛋白和微管的交联剂：蛋白质摩尔比分别为R A = 0.01-0.08和RMT= 0.001-0.01。肌球蛋白-II迷你丝（紫色）和驱动蛋白簇（橙色），浓度为c M = 0.12 - 0.48 μM和cK = 0.2 - 0.7μM，推拉细丝以推动复合材料脱离稳态。（二）配方空间示意图。肌球蛋白II微丝（M），驱动蛋白簇（K）或两个马达（K + M）被掺入不含钝化交联剂（No XL），肌动蛋白-肌动蛋白交联（肌动蛋白XL）和微管-微管交联（MT XL）的复合材料中。所有卡通都不是按比例绘制的。请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2.肌球蛋白驱动的细胞骨架复合材料的双色共聚焦成像，具有不同的肌球蛋白浓度 cM 和摩尔肌动蛋白分数 ΦA。 （A） 256 x 128 方形像素 （212 x 106 μm2） 双色共聚焦显微镜图像显示了肌动蛋白丝（绿色）和微管（红色）的复合材料如何通过肌球蛋白运动活动 重新 排列。不存在驱动蛋白马达或被动交联剂。在每个面板中，显示了在45分钟肌球蛋白激活（通过488nm光照明以 灭活blebbstatin）的开始（左，之前）和结束（右，之后）拍摄的图像。面板按肌球蛋白摩尔浓度（cM）从左到右和肌动蛋白摩尔分数（ΦA）从上到下增加来排序。每个面板的轮廓颜色与图 4 和 图 5 中使用的颜色编码相匹配。比例尺为 50 μM。为了最好地捕获动态和结构进行分析，我们使用 1-5 fps 的帧速率、50-250 μm 边的 ROI 和 5-45 分钟的时间序列持续时间，具体取决于收缩和重新排列的速率。之前和之后图像看起来相似的面板表示最小的重组，如粉红色、洋红色和青色面板所示。在橙色、绿色和红色面板中可以看到小规模聚类，表现为异质性增加和明亮点状特征的存在。大规模的收缩，被视为均匀收缩的网络，在蓝色和紫色面板中很明显。该图已从参考文献17修改而来。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3.粒子图像测速法（PIV）显示，肌动肌蛋白活性触发了共纠缠复合材料中肌动蛋白和微管的协调收缩动力学。 肌球蛋白驱动复合材料中肌动蛋白（顶行）和微管（底行）的PIV流场，（ΦA， cM）= （0.5，0.24）在6分钟时间序列内增加时间。流场是使用 Fiji/ImageJ PIV 插件生成的，延迟时间为 20 秒，像素 x 2 像素合并。肌动蛋白和微管在整个电影持续时间内都显示出指向视场中心区域的一致运动。所有图像中的比例尺均为 50 μm。不同的箭头颜色对应于不同的速度，如矢量场右侧的色阶所示。该图已从参考文献26修改而来。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图4.时间分辨差分动态显微镜（DDM）测量活性复合材料中肌动蛋白和微管的运动速率和类型。（A）DDM在时间序列的微管（顶部，开放符号）和肌动蛋白（底部，填充符号）通道上进行，以确定肌动蛋白（填充符号）和微管（开放符号）的特征衰减时间τ与波数q，如前所述17，26。所有曲线都遵循 τ ~ q-1 缩放，表示弹道运动，速度 v 通过拟合 τ（q） = （vq）-1 来确定。对于任何给定的 q，更快的速度对应于较小的 τ（q） 值。符号颜色和形状对应于 B 中显示的 （ΦA， cM） 组合。 （B） 收缩速度 v 通过拟合 A 中显示的 τ（q） 曲线来确定，该曲线在每 45 分钟时间序列的持续时间内对所有滞后时间求平均值。（C）时间分辨DDM（trDDM）通过在45分钟激活时间内连续6分钟间隔（由相同颜色的不同阴影表示）评估肌动蛋白（填充符号，左）和微管（开放符号，右）的τ（q）来量化动力学如何随时间变化。trDDM 对每个 （ΦA， cM） 组合（由不同的符号和颜色表示）执行，如右下角的图例中所述。C中显示的τ（q）曲线遵循与A中相似的缩放和趋势，但也显示了某些（Φ A，cM）组合物的时间依赖性，最明显的是Φ A = 0.75。（D）肌动蛋白丝（闭合符号）和微管（开放符号）的收缩速度由相应的τ（q）曲线拟合确定。所有图中的误差条表示三到五个重复值的标准误差。该图已从参考文献17修改而来。请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图5.空间图像自相关（SIA）分析量化了活性细胞骨架复合材料的运动驱动重组。（A）图例中列出的（ΦA，cM）配方的实验开始（左，t = 0分钟，深色调）和结束（右，t = 42分钟，浅色调）微管的自相关g（r）。插图：（ΦA， cM） = （0.75， 0.12） 的初始和最终时间的数据拟合Equation 2示例。（B）肌动蛋白（闭合符号）和微管（开放符号）的平均相关长度ξ通过每条g（r）曲线的指数拟合确定，如A中的插图所示。A 和 B 中的误差条表示三到五次重复的标准误差。该图已从参考文献17修改而来。请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图6.将驱动蛋白马达和被动交联剂结合到活性复合材料中，以提高可编程性并扩展动力学和结构的相空间。（A）活性复合材料中肌动蛋白（绿色）和微管（红色）的双色共聚焦图像显示随着时间的推移而复杂的配方依赖性重组（以最小值列出）。每行中的五张图像对应于由驱动蛋白（K，第1，3，5行）或驱动蛋白和肌球蛋白（K + M，第2，4，6行）驱动的复合材料的2000帧时间序列的五帧，并且包括无被动交联剂（无XL，第1，2行），肌动蛋白 - 肌动蛋白交联（肌动蛋白XL，第3，4行）或微管 - 微管交联（MT XL， 第 5、6 行）。比例尺均为 50 μm。轮廓颜色与图 8 中的配色方案匹配。（B）仅驱动蛋白复合材料的分离肌动蛋白和微管荧光通道显示出具有肌动蛋白-MT共定位和微相分离的不同结构。显示的图像适用于c A = 2.32 μM，c T = 3.48 μM，c K = 0.35 μM，cM = 0.47 μM（第2，4，6行），R A = 0.02（第3，4行）和RMT = 0.005（第5，6行）的复合材料。 所有复合材料都始于均匀分布的肌动蛋白和微管互穿网络（第1栏）。没有交联剂的驱动蛋白驱动复合材料（第 1 行）形成松散连接的富含 MT 的无定形团簇。肌动蛋白最初在这些聚集体的中心共定位，但随后被挤出富含MT的区域，这些区域继续收缩并相互断开。肌动蛋白-肌动蛋白交联（第3行）阻碍了这种微尺度的肌动蛋白-MT分离，相反，富含MT的聚集体通过长链肌动蛋白连接。肌动蛋白交联还使肌动蛋白缓慢吸收到富含MT的区域，使得复合物成为共定位肌动蛋白和MT簇的连接网络。微管交联（第 5 行）导致 MT 的无定形聚集，随着时间的推移而聚结，导致肌动蛋白和 MT 的更大规模相分离。 添加肌球蛋白（第 2、4、6 行）可减少驱动蛋白驱动的解混和重组。如果没有交联剂（第 2 行），复合材料在数小时内几乎没有重排。交联增加肌动蛋白和微管的重组和共定位（第 4、6 行）。具体来说，当微管交联（第6行）时，存在显着的相互渗透和重组成网状纤维网络。该图已从参考文献50修改而来。请点击此处查看此图的大图。

Figure 7
图7.PIV表明，活性复合材料表现出三类时空不同的流场。（A）三个代表性时间序列的第一帧（t i）和最后一帧（tf）的PIV流场，显示了图6所示复合材料所表现出的不同动态等级。用于 1 类（顶部、紫色）、2 类（中间、橙色）和 3 类（底部，洋红色）示例视频的微管（顶部）和肌动蛋白（底部）的 PIV 流场，箭头颜色对应于底部的通用速度刻度，灰度颜色图显示空间速度分布，根据底部所示的比例为每个流场单独归一化。比例尺均为 50 μM。（B） A的速度矢量的角度分布（以弧度为单位），列出的初始和最终标准偏差σ i 和σf。（C）在A和B中分析的视频的时间彩色图显示了每个像素相对于其起点的帧到帧位置。1 类地图显示小比例随机运动;2 类地图描绘了空间或时间变化最小的快速单向运动;3 类地图同时具有 1 类和 2 类的特征。该图已从参考文献50修改而来。请点击此处查看此图的大图。

Figure 8
图8.DDM和SIA测量双电机肌动蛋白-微管复合材料的时变动力学和结构。 （A） 图6 和 图7中描述的复合材料的速度，通过DDM测量，显示复合材料的加速和减速， 通过 交联和肌球蛋白活性编程。微管（MT，闭圈）和肌动蛋白（A，开放圆）的速度绘制为无交联（顶部，蓝色），肌动蛋白交联（中间，绿色），微管交联（底部，红色），无肌球蛋白（K，较深的阴影）和肌球蛋白（K + M，较浅的色调）的复合材料中活性时间的函数。对于具有两种速度的 3 类情况，较慢的速度用星号表示。用黑色虚线圆圈括起来的数据点对应于每个配方的最大速度 v最大值。误差线（大多数太小而看不到）是相应 τ（q）的幂律拟合的标准误差。（B）结构相关长度 ξ， 通过 SIA确定，与活动时间的关系，对于A中评估的同一组时间序列。每个数据点都是为相应时间序列的第一帧和最后一帧确定的相关长度的平均值。一般来说，在所有复合材料系统中，肌动蛋白和微管的 ξ时间增加，并且仅由驱动蛋白驱动的复合材料比肌球蛋白也存在的复合材料具有更大的相关长度。与 图 7 中分析的三个时间序列对应的 A 和 B 中的数据点以相应的类颜色（1 = 紫色，2 = 橙色，3 = 洋红色）圈出。该图已从参考文献50修改而来。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

上述重组系统的一个关键进步是其模块化和可调性，因此鼓励用户修改蛋白质、马达、交联剂等的浓度以适应他们想要的结果，无论是模拟特定的细胞过程还是设计具有特定功能或机械性能的材料。肌动蛋白和微管蛋白浓度范围的限制由聚合肌动蛋白（~0.2μM）57，58，59和微管蛋白（~3 - 4μM）60所需的临界浓度设定在下限，上限由肌动蛋白丝（~90μM）61，62或微管（~35μM）63向向列排列的过渡设定。.肌动蛋白单体和微管蛋白二聚体应聚合成细丝，而不是聚合后混合在一起，以确保它们形成均匀互穿的渗透网络，相互协同支持。复合材料表现出的新动力学依赖于这种相互作用。虽然遵循协议中概述的所有步骤以成功重现显示的结果通常很重要，但有些步骤更严格，而其他步骤则有修改和调整的空间以适应特定需求和可用资源。

例如，确保结果可重现的一个重要步骤是按照材料表中提供的指南正确制备和储存试剂。细胞骨架蛋白（肌动蛋白，微管蛋白，肌球蛋白，驱动蛋白）不稳定，应等分，用液氮快速冷冻，并以一次性等分试样储存在-80°C。从-80°C取出后，应将等分试样保存在冰上。细胞骨架蛋白在额外的冻融循环后不能可靠地保持功能。

微管比肌动蛋白对解聚和变性更敏感。一旦从-80°C中取出，微管蛋白应在聚合前保持在冰上，并在12小时内使用。一旦聚合，微管应保持在室温下。用紫杉醇稳定微管以防止解聚也很重要。肌动蛋白丝的鬼笔环肽稳定对于抑制与肌球蛋白和驱动蛋白活性竞争的ATP消耗肌动蛋白跑步机同样重要。

肌球蛋白马达的超速离心是另一个关键步骤，因为它可以去除不活跃的肌球蛋白死头。不去除酶无活性的单体会导致肌动蛋白网络的被动交联和活性损失。为了延长马达的ATP酶活性，可以结合ATP再生系统，如磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶64 。

最后，保持复合活性需要抑制灯丝和电机吸附到样品室壁上，这可以通过显微镜盖玻片和载玻片的钝化来实现。运动蛋白特别容易吸附，这导致复合材料被拉到样品室表面，移出视场，塌陷到2D，不再进行活动。对盖玻片和载玻片进行硅烷化是钝化表面并防止吸附的有效方法（见步骤1）。在体外细胞骨架实验中有效使用的另一种钝化方法是在表面涂覆脂质双层，类似于细胞膜18。如果希望将蛋白质束缚在表面或引入其他特定的蛋白质 - 表面相互作用，则这种方法是有利的，因为双层可以功能化。对于光学镊子实验，微球的钝化也很关键，可以通过碳化二亚胺交联剂化学48用BSA或PEG包覆羧化微球来实现。

研究人员可以考虑更改所提出的协议的几个方面以满足他们的需求。首先，研究人员可以选择用生物交联剂代替非天然生物素-NA交联剂，例如分别交联肌动蛋白和微管的α-肌动蛋白或MAP6528，65，66。与天然交联剂相比，在本文描述的复合材料中使用非天然交联剂的动机是其增强的重现性、稳定性和可调性。由于强大的生物素-NA键，交联剂可以被认为是永久性的，而不是大多数以广泛的周转率瞬时结合的天然交联剂。瞬态交联的动力学使解析交联剂和电机对动力学的贡献变得复杂。此外，生物素-NA接头可用于交联肌动蛋白和微管，以及将肌动蛋白交联到微管。通过这种方式，可以在交联基序之间进行明确的比较，保持所有其他变量（例如，交联剂大小，结合亲和力，化学计量等）不变。最后，掺入生物素-NA接头所需的试剂已广泛商业化，表征良好，并且通常用于许多生物物理实验室。然而，这里描述的体外平台的关键优势之一是其模块化，因此研究人员应该能够选择用天然接头无缝替换生物素-NA接头。

其次，在当前的方案中，肌动蛋白单体和微管蛋白二聚体在加入样品室之前在离心管中聚合成细丝。将缠绕的丝状蛋白溶液流入样品室可能会导致流动对齐，尤其是微管的流动对齐，从而破坏复合材料所需的各向同性和均匀性。事实上，先前关于稳态肌动蛋白-微管复合材料的工作的一个重大进展是能够原位（在样品室中）共聚合肌动蛋白和微管，以确保形成肌动蛋白和微管的各向同性互穿网络15，16，27。然而，将这种方法扩展到活性复合材料需要在肌动蛋白和微管蛋白聚合之前将马达添加到样品中，并在实验前将整个样品在37°C下孵育在一起。对方案的这种变异的测试导致肌动蛋白聚合减少，并且没有明显的运动活性，这可能是由于竞争性ATP酶活性和马达的37°C长时间孵育。幸运的是，遵循当前协议时，复合材料没有明显的流动对齐，如图2、图3和图6所示。尽管如此，鼓励研究人员设计允许原位形成活性复合材料的方案。

另一个需要考虑的点是荧光标记方案，它需要稀疏地标记网络中的所有肌动蛋白丝和微管。这种标记方法经过优化，可以直接可视化网络的结构，而不是通过示踪丝或微球 推断 结构和动力学。然而，权衡是单个细丝没有明亮的标记和可解析。研究人员可以采取的一种方法来解析单丝以及可视化网络结构，方法是在用另一种荧光团标记的预成型细丝中掺杂，这样周围的网络和单个细丝都可以同时成像。然而，当使用两个以上的荧光基团和激发/发射通道时，通道之间的渗漏通常很难消除，因此在选择荧光团、滤光片和激光强度时必须小心。

一个相关的限制是无法可视化复合材料中的肌球蛋白或驱动蛋白马达。使用的荧光标记肌动蛋白单体和微管蛋白二聚体是市售的，而复合材料中肌球蛋白或驱动蛋白的可视化需要内部标记。鼓励研究人员采取下一步来标记电机，就像之前所做的那样18，67，以便能够明确地将电机活动和结合与我们的复合材料所表现出的动力学和结构联系起来。

最后，重要的是要注意，在当前的方案中，驱动蛋白活性的开始和持续时间不受控制。如上所述，由于肌球蛋白活性是使用布比他汀的光失活来控制的，以建立类似的驱动蛋白光激活，因此可以加入光激活ATP。

为了增加这里描述的设计的复杂性，更好地模拟细胞条件并拓宽动态结构功能参数空间，未来的工作将集中在结合中间细丝，如vimentin68，69，以及其他电机，如动力蛋白13，70。凝胶索林也将以不同的浓度掺入以控制肌动蛋白长度14，以及tau蛋白以控制微管硬度。

总之，所提出的协议描述了如何设计、创建和表征细胞骨架启发的活性物质系统的动力学、结构和力学，这些系统包含两个独立的主动力产生组件，它们作用于单个系统中的不同底物。这种可调谐的模块化平台使重建工作更接近模拟细胞骨架的重要一步，并通过独立合并、移除和调整不同的组分，提供了在宽相空间中对其特性进行编程的独特能力。此外，这种多功能系统的所有组件都可以市售（见材料表），除了在Ross实验室纯化的驱动蛋白二聚体，如前所述50，可根据要求提供。最后，所有分析代码都可以通过GitHub49 免费获得，并且基于免费的编程语言和软件（Python和斐济）。透明地传播设计这些系统的协议，有望使具有不同专业知识、背景、机构隶属关系和研究目标的不同用户群体更容易访问该平台。

Disclosures

作者没有什么可透露的

Acknowledgments

我们感谢Maya Hendija和Jonathan Michel博士在数据分析方面的帮助，感谢Janet Sheung博士，Moumita Das博士和Michael Rust博士提供的有益讨论和指导。这项研究得到了William M. Keck基金会研究基金和NSF DMREF奖（DMR 2119663）的支持，该奖项授予RMRA和JLR以及美国国立卫生研究院R15赠款（R15GM123420，2R15GM123420-02）授予RMR-A和RJM。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin
 Abbreviation used in paper: blebbistatin		 Sigma Aldrich B0560 Stock Concentration: 200 μM in DMSO
Storage: dessicated, in DMSO, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: dissolve 1 mg of powder to 200 μM in DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: limited shelf-life, typically stops functioning reliably after 3-4 months. purchase and prepare new solution every 3 months. 
1:20 488-tubulin:tubulin mixture
 Abbreviation used in paper: 5-488-tubulin		 NA NA Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and 488-tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
1:20 R-tubulin:tubulin mixture
 Abbreviation used in paper: 5-R-tubulin		 NA NA Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and rhodamine tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
actin (biotin): skeletal muscle
 Abbreviation used in paper: biotin-actin		 Cytoskeleton AB07 Stock Concentration: 1 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: (1) immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM, (2) once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC for up to 1 week
actin (rhodamine): rabbit skeletal muscle
 Abbreviation used in paper: R-actin		 Cytoskeleton AR05 Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week
adenosine triphosphate
 Abbreviation used in paper: ATP		 Thermo Fisher Scientific A1048 Stock Concentration: 100 mM
Storage: in solution (pH 7), -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconsitute in DI H20, bring pH to 7 with NaOH
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: routinely check pH and adjust as needed, hydrolyzes over time, replace every ~6-12 months
AlexaFluor488 Phalloidin
 Abbreviation used in paper: 488-phalloidin		 Thermo Fisher Scientific A12379 Stock Concentration: 100 μM DMSO
Storage: protected from light, dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 20 μM in PEM (1 μL in 4 μL PEM)
AlexaFluor488–labeled actin
 Abbreviation used in paper: 488-actin		 Thermo Fisher Scientific A12373 Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: this item has been discontinued
Basic Plasma Cleaner
 Abbreviation used in paper: plasma cleaner		 Harrick Plasma PDC-32G
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
 Abbreviation used in paper: transparent film		 Thermo Fisher Scientific 13-374-5
D-(+)-Glucose
 Abbreviation used in paper: 		 Thermo Fisher Scientific A1682836 Stock Concentration: 100x
Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 4.5 mg/ml in DI H20
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should 45 μg/mL 
D-Biotin
 Abbreviation used in paper: biotin		 Fisher Scientific BP232-1 Stock Concentration: 1.02 mM in PEM
Storage: dessicated, 4ºC
deionized nanopure water
 Abbreviation used in paper: DI
Dimethyldichlorosilane
 Abbreviation used in paper: silane		 Thermo Fisher Scientific D/3820/PB05 Stock Concentration: 2% dissolved in Toulene
Dithiothreitol
 Abbreviation used in paper: DTT		 Thermo Fisher Scientific R0861 Stock Concentration: 1 M in DMSO
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: dilute to 2 mM in PEM immediately before each experiment
DMSO Anhydrous
 Abbreviation used in paper: DMSO		 Thermo Fisher Scientific D12345
F-Buffer
 Abbreviation used in paper: F-buffer		 NA NA Stock Concentration: 10x
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: 10 mM Imidazole (pH 7.0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.2 mM ATP
G-Buffer
 Abbreviation used in paper: G-buffer		 NA NA Stock Concentration: 10x
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: 2.0 mM Tris (pH 8), 0.2 mM ATP, 0.5 mM DTT, 0.1 mM CaCl2. Store at -20°C.
glass microscope slide
 Abbreviation used in paper: slide		 Thermo Fisher Scientific 22-310397
Glucose oxidase + catalase + β-mercaptoethanol
 Abbreviation used in paper: GOC		 Sigma Aldrich G2133-250KU, C1345, 63689  Stock Concentration: 100x
Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC
Stock and Experiment Recipes: For 100x: 4.3 mg/ml glucose oxidase, 0.7 mg/ml catalase, 0.5% v/v  β-mercaptoethanol in DI H20
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should be: 0.005% β-mercaptoethanol, 43 μg/mL glucose oxidase, 7 μg/mL catalase
glu-GOC oxygen scavenging system
 Abbreviation used in paper: glu-GOC		 NA NA Stock Concentration: 100x
Storage: prepare fresh each time
Stock and Experiment Recipes: mix equal parts Glu and GOC and add at 1/100 final sample volume immediately before imaging
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: prepare from Glu and GOC immediately before imaging
Guanosine triphosphate
 Abbreviation used in paper: GTP		 Thermo Fisher Scientific R0461 Stock Concentration: 100 mM
Storage: 100 μL aliquots at -20ºC
Instant Mix 1-minute epoxy
 Abbreviation used in paper: epoxy		 Loctite 1366072 
Kinesin-1 401 BIO 6x HIS
 Abbreviation used in paper: kinesin		 Prepared in JL Ross Lab at Syracuse University NA Stock Concentration: 8.87 μM in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: biotinylated dimers form kinesin clusters, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
NeutrAvidin
 Abbreviation used in paper: NA		 Thermo Fisher Scientific 31000 Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM
No 1. glass coverslips (24 mm x 24 mm)
 Abbreviation used in paper: coverslip		 Thermo Fisher Scientific 12-548-CP
Paclitaxel 
 Abbreviation used in paper: Taxol		 Thermo Fisher Scientific P3456 Stock Concentration: 2 mM in DMSO
Storage: protected from light, dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mM with DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 200 μM in DMSO (0.4 μL in 3.6 μL DMSO)
PEM-100
 Abbreviation used in paper: PEM		 NA NA Stock Concentration: 1x
Storage: room temperature (RT)
Stock and Experiment Recipes: 100 mM K-PIPES (pH 6.8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: use KOH to adjust pH to 6.8, recheck pH often and adjust accordingly
phalloidin
Abbreviation used in paper: phalloidin		 Thermo Fisher Scientific P3457 Stock Concentration: 100 μM in DMSO
Storage: protected from light, dessicated, -20ºC, adhere closely to storage/handling conditions
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: susceptible to impurities in its preparation and denaturing, identifiable as large amorphous aggregates of actin in samples
porcine brain tubulin
 Abbreviation used in paper: tubulin		 Cytoskeleton T240 Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
Potassium Chloride
 Abbreviation used in paper: KCl		 Thermo Fisher Scientific AM9640G Stock Concentration: 4 M
Storage: RT
Rabbit skeletal actin
 Abbreviation used in paper: actin		 Cytoskeleton AKL99 Stock Concentration: 2 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week
Rabbit skeletal myosin II
 Abbreviation used in paper: myosin		 Cytoskeleton MY02 Stock Concentration: 10 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 10 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: monomers form minifilaments at low KCl, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
Tubulin (biotin): porcine brain
 Abbreviation used in paper: biotin-tubulin		 Cytoskeleton T333P Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM
Tubulin (fluorescent HiLyte 488): porcine brain
 Abbreviation used in paper: 488-tubulin		 Cytoskeleton TL488M Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
tubulin (rhodamine): porcine brain
 Abbreviation used in paper: R-tubulin		 Cytoskeleton TL590M Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
Tween 20
 Abbreviation used in paper: Tween20		 Thermo Fisher Scientific J20605.AP Stock Concentration: 1% v/v in DI H20
Storage: RT
ultracentrifuge grade microtubes
 Abbreviation used in paper: Beckman-Coulter Optima Max XP 		 Beckman Coultier 343776 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: 8x34 mm PC
UV light curing glue
 Abbreviation used in paper: UV glue		 Pharda SKG-2869

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References

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Tags

生物学，第186期，细胞骨架，活性物质，肌动蛋白，微管，肌球蛋白，驱动蛋白，复合材料，生物聚合物， 体外 重建，荧光共聚焦显微镜

Erratum

Formal Correction: Erratum: Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics
Posted by JoVE Editors on 10/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics. The Authors section was updated.

Mehrzad Sasanpour1
Daisy H. Achiriloaie1,2
Gloria Lee1
Gregor Leech1
Christopher Currie1
K. Alice Lindsay3
Jennifer L. Ross3
Ryan J. McGorty1
Rae M. Robertson-Anderson1
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College
3Department of Physics, Syracuse University

to:

Mehrzad Sasanpour1
Daisy H. Achiriloaie1,2
Gloria Lee1
Gregor Leech1
Maya Hendija1
K. Alice Lindsay3
Jennifer L. Ross3
Ryan J. McGorty1
Rae M. Robertson-Anderson1
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College
3Department of Physics, Syracuse University

重组和表征具有可调电机驱动动力学和力学的肌动蛋白-微管复合材料
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Sasanpour, M., Achiriloaie, D. H.,… More

Sasanpour, M., Achiriloaie, D. H., Lee, G., Leech, G., Hendija, M., Lindsay, K. A., Ross, J. L., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics. J. Vis. Exp. (186), e64228, doi:10.3791/64228 (2022).

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