Summary
本プロトコルは、青色LED照明技術を用いてTLCプレート上の化合物の収率を推定する方法を開発した。このアプローチの利点は、安全で効果的で安価であり、研究者が複数のサンプルを同時に測定できることです。
Abstract
薄層クロマトグラフィー(TLC)は、未知のサンプルの収量を定量化するために有機化学研究で広く使用されているアクセス可能な分析技術です。本研究では、青色LEDイルミネーターを使用してTLCプレート上のサンプルの収量を推定するための効果的で安価で安全な方法を開発しました。 アスペルギルス・テレウス から抽出したロバスタチンは、本試験で用いた例化合物であった。ロバスタチン標準に基づく回帰モデルを用いて、ロバスタチンの収率を評価した。バイオアッセイ、UV検出、青色LED照明の3つの方法を比較しました。結果は、青色LED照明法がUV検出およびバイオアッセイ法よりも有意に時間効率が高いことを示しました。さらに、青色LED照明は、バイオアッセイ法における生物学的危険性(例えば、微生物感染)およびUV検出法における紫外線曝露の懸念のために、比較的安全な選択肢であった。GC、HPLC、HPTLCなど、独立して作業する前に特殊な機器と長期トレーニングを必要とする高価な方法と比較して、青色LEDイルミネーターを使用することは、TLCプレートからサンプルの収量を推定するための経済的なオプションでした。
Introduction
薄層クロマトグラフィー(TLC)は、有機化学の分野で定性的および定量的手法として広く使用されています1,2,3。TLCの主な利点は、高速検出、柔軟なサンプル要件を提供し、特殊な機器を必要としないことです4。今日まで、多くの高度なアプローチが確立されているにもかかわらず、TLCは依然として混合物中の未知のサンプルを識別するための主要な方法です。ただし、このアプローチの課題は、特に予算が限られているラボを開発する場合、サンプル収量を定量化するための安全で安価な機器がないことです。そこで本研究では、TLCと組み合わせてサンプルの収量を推定するための効率的で安全かつ安価な方法を開発することを目的とした。
高性能TLC(HPTLC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、およびガスクロマトグラフィー(GC)とは異なり、厳しいサンプル要件、時間がかかり、サンプル調製のための多段階の関与1,5、TLCはいくつかの利点を示しました。まず、サンプル調製の場合、粗抽出物がHPLCおよびGCのカラムを詰まらせる可能性があるため、HPLCおよびGCは粗抽出物を検出できません。第二に、サンプルがUVに適さない(HPLC分析にとって重要)または低揮発性(GC分析にとって重要)である場合、TLCをこれらのサンプルに適用することができ、可視化試薬を使用すると、単離されたサンプルが薄層に見えるようになります6,7,8。第三に、一般ユーザーの場合、HPLCとGCは、TLCと比較して、独立して作業する前に比較的長い時間の事前トレーニングを必要とします。さらに、高性能TLC(HPTLC)として知られる定量的TLC分析は、高感度スキャナーでTLCプレート上の情報をデジタル化できます。しかしながら、HPTLCシステムのコストは比較的高価である。そのため、TLCプレート上のサンプルを定量するための費用効果が高く迅速なアプローチを開発することは重要なトピックです。
TLC収量の定量化についても同様の方法が開発されています。たとえば、ジョンソン9 は、コンピューターに接続されたフラットベッドスキャナーを使用してTLCプレート上のサンプルを定量できる技術を報告しました。2001年、El-Gindyら10 は、光学密度で化合物を検出するために使用されるTLC-デンシトメトリー法を開発し、この技術はElkadyらによっても適用されました11。2007年、Hess2 は、UV光と組み合わせたデジタルカメラを使用してTLCプレート上の化合物の収率を検出するために適用されたデジタル強化TLC(DE-TLC)法を発表しました。ヘスはまた、HPTLC法とDE-TLC法のコスト差を比較し、DE-TLC法は手頃な価格であるため、高校や大学の研究室で使用できると結論付けました2。ただし、TLC濃度測定法のコストは依然として高価であり、紫外線の操作には、ユーザーが紫外線にさらされる可能性がある場合に備えて、適切な事前トレーニングが必要です。したがって、TLCと互換性があり、効率的、安全、かつ安価なサンプル収率を定量する方法の開発が望まれている。
本研究では、青色LEDイルミネーターを用いてTLCプレート上のサンプルを検出するためのプロトコルを記述し、バンドの寸法を測定し、化合物収率を決定するための信頼性の高い(高いR2乗値)回帰モデルを開発しました。最後に、青色LED照明法は比較的安全であることがわかりました(対。紫外線検出法)、安価(対。GC、HPLC、およびHPTLC)、および収量定量のための効果的な(対バイオアッセイ法)アプローチ。
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Protocol
本プロトコルは、例としてロバスタチンを用いて記載される。ロバスタチンは、1週間齢の アスペルギルス・テレウスから抽出した。
1.化合物抽出
注:化合物抽出の詳細については、 図1を参照してください。
- ジャガイモデキストロース寒天培地上で アスペルギルス・テレウス (PDA、 材料の表を参照)培地を30°Cで培養する。
- 培養物を40°Cで24時間乾燥させます。滅菌ピンセットを使用して乾燥した培養物を50 mLチューブに移し、15 mLの酢酸エチルを加えます。
- 混合物を1分間ボルテックスして激しく振盪し、200rpmで振とうしながら40°Cで1時間インキュベートします。
- 40 kHzの超音波浴( 材料の表を参照)を使用して混合物を40°Cで1時間超音波処理します。
- 混合物を室温で5,000 x g で1分間遠心分離し、11 μmのろ紙でろ過します。
- 分液漏斗で等量の滅菌水でろ液を抽出する。
- 相分離後、有機層を収集し、ロータリーエバポレーターで蒸発させます( 材料表を参照)。残留物を2mLの酢酸エチルに溶解する。
2. 順相(NP)吸着カラムによる粗抽出物の分離
- 固定相としてNPシリカゲルをカラムに充填し、移動相としてn-ヘキサン:酢酸エチル:トリフルオロ酢酸(H:E:T; 80:20:0.1、v/v/v)を使用します。
- 2 mLの抽出物(ステップ1)をカラムにロードし、移動相溶媒を1 mL/minの流速で加えて抽出物を溶出します。
注:流量は活栓を使用して手動で制御されました。 - TLCで廃液を検証してロバスタチンの存在を確認し、溶媒が除去されるまで45°Cのロータリーエバポレーターで蒸発させます。このステップには約20〜25分かかります。
- 残留物を1mLの酢酸エチルに溶解し、次いで等量の1%トリフルオロ酢酸と混合する。
- 混合物を室温で5,000 x g で1分間遠心分離し、有機層を新しいガラス管に集めます。
3. 薄層クロマトグラム(TLC)プレートの調製とローディング
- キャピラリーピペットを使用して、5 μLのサンプルとロバスタチン標準物質( 材料表を参照)をTLCプレートのベースラインにスポットし、TLCプレートの側面に1 cmの境界線を残します。
- TLCプレートをヒュームフードで室温で5分間乾燥させます。
- プレートを鉗子で移動相溶媒の入った飽和ガラスチャンバーにそっと置きます。チャンバーをガラス蓋で覆い、プレートが完全に発達するようにします。
- 溶媒ラインがプレートの上部から1cmに達したら、プレートをチャンバーから取り出します。
4. 青色LEDイルミネーターによる分析
- 溶剤線を鉛筆でマークします。プレートをヒュームフードで室温で10分間乾燥させます。
- 乾燥後、直ちにプレートを10%H2SO4 溶媒に浸し、次にヒュームフード内で室温で10分間乾燥させる。
- 茶色の斑点が現れるまでプレートを加熱パネルに置きます。ロバスタチンの視覚化が困難になる可能性があるため、プレートが過熱していないことを確認してください。
- プレートを青色LEDイルミネーターに移し、互換性のあるフリーウェア(MiBio Fluo)を使用してスキャンします(材料の表を参照)。
5. 回帰モデルによる歩留まり推定
- ImageJソフトウェアを使用してバンドの寸法を測定します( 材料表を参照)。
- 1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mLなどのロバスタチン標準物質の降順濃度に基づいて、データ分析およびグラフ作成ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して回帰モデルを確立します。
- 回帰モデルを適用して、サンプルの収量を推定します。
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Representative Results
この研究では、化合物の収率を推定するための青色LED照明法を提示し、この方法を検証し、バイオアッセイおよびUV検出法と比較しました(表1)。回帰モデルは、サンプルの収量を予測するために、それぞれ3つの方法のバンドの次元と標準の濃度に基づいて開発されました。まず、バイオアッセイ法の結果において、阻害ゾーンの寸法とロバスタチン標準物質のR2乗は0.99であり、回帰モデルによって予測されたサンプル収量は0.56mgであった(図2)。第二に、UV検出法では、ロバスタチン標準とTLCプレート上のバンドの寸法との間のR二乗は0.97であり、回帰モデルによって予測されたサンプルの収量は0.53mgであった(図3)。特に、バンドのエッジがぼやけており、比較的低い信号強度のバンドが観察されました(図3A)。第三に、青色LED照明法では、ロバスタチン標準とTLCプレート上のバンド寸法との間のR二乗は0.98であり、回帰モデルによって予測されたサンプル収量は0.54mgであった(図4)。青色LED照明器を用いた予測収量は、バイオアッセイ法(対照として設定)に近かった。バンドの寸法はロバスタチンの量に比例し、明瞭なバンドは青色LED照明法によって得られた。さらに、バイオアッセイ、UV検出、および青色LED照明方法の作業時間は、それぞれ約24時間、2時間、および1時間でした。(注:労働時間とは、ロバスタチンの収量検査に費やされた合計時間を意味します)。
図1:プロトコルのワークフロー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:バイオアッセイ法。 (A) ニューロスポラクラッサ に対するロバスタチンのバイオアッセイ(30°Cで24時間インキュベート)。試験の終わりに、90mm寒天プレートを可視光下で撮影した。(B)6つのロバスタチン標準の濃度は、No.1(1 mg / mL)、No.2(0.75 mg / mL)、No.3(0.5 mg / mL)、およびNo.4(0.25 mg / mL)でした。.試料番号5を0.25×(1:4)に希釈した。サンプル番号6を0.5×(1:2)に希釈した。阻害ゾーン寸法(mm2)は、イメージングソフトウェアにより測定した。(C)標準の阻害ゾーン次元に基づくデータ分析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して回帰モデルを開発した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:UV光にさらされた薄層クロマトグラム(TLC)プレート。 (A)TLC分析の移動相としてn-ヘキサン:酢酸エチル(2:3 v / v)を使用し、TLCプレートを現像液(10%H2SO4)に浸した後、UV光(365 nm)にさらしました。(B)6つのロバスタチン標準の濃度は、No.1(1 mg / mL)、No.2(0.75 mg / mL)、No.3(0.5 mg / mL)、およびNo.4(0.25 mg / mL)でした。.試料番号5を0.25×(1:4)に希釈した。サンプル番号6を0.5×(1:2)に希釈した。阻害ゾーン寸法(mm2)は、イメージングソフトウェアにより測定した。(C)TLCプレート上のロバスタチン標準バンドの寸法に基づくデータ分析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して回帰モデルを開発した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:青色LEDイルミネーターでスキャンした薄層クロマトグラム(TLC)プレート 。 (A)TLC分析の移動相としてn-ヘキサン:酢酸エチル(2:3 v / v)を使用し、 TLCプレートを青色LEDイルミネーターでスキャンしました。(B)6つのロバスタチン標準の濃度は、No.1(1 mg / mL)、No.2(0.75 mg / mL)、No.3(0.5 mg / mL)、およびNo.4(0.25 mg / mL)でした。.試料番号5を0.25×(1:4)に希釈した。サンプル番号6を0.5×(1:2)に希釈した。阻害ゾーン寸法(mm2)は、イメージングソフトウェアにより測定した。(C)TLCプレート上のロバスタチン標準バンドの寸法に基づくデータ分析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して回帰モデルを開発した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| バイオアッセイ | 青色LEDイルミネーター | 紫外線検出 | |
| 結果観察 | 目 | 青色LEDイルミネーターと目 | 紫外線と目 |
| 画像解像度 | 中程度 | 高い | 低い (ぼやけてかすかな画像) |
| 概算の時間コスト | 24時間 | 1時間 | 2時間 |
| 必要な分析スキル | 中程度 | 低い | 中程度 |
| 安全 | 微生物感染 | 非常に安全 | 紫外線への露出 |
| 回帰式 | y = 0.0019x + 0.0304 | y = 0.0399x - 0.1271 | y = 0.0657x - 0.6405 |
| R二乗 | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
| 坂 | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
| 遮る | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
| 勾配の標準誤差 | 8.94E-05 | 3.54E-03 | 6.28E-03 |
| 切片の標準誤差 | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
表1:この研究で使用された3つの検出方法の比較。
| TLC濃度測定法 | TLC画像解析 | |||||||
| エルギンディ ら10 |
エルカディ ら11 |
ムシャラフ ら12 |
ジョンソン9 | ヘス2 | 青色LEDイルミネーター方式 (本研究) |
|||
| 見本 | アセブトロール塩酸塩 | シプロフロキサシンHCL | メトロニダゾール | ダナゾール | コレステロール | バニリン | ニコチンアミド | ロバスタチン |
| 業績 | 紫外線 ディテクター |
ティッカー スキャナー |
ティッカー スキャナー |
フラットベッドスキャナー | デジカメ UVランプ付き |
青色LEDイルミネーター | ||
| 波長 | 230 nm | 280 nm | 280 nm | 291 nm | 該当なし | 254 ナノメートル | 該当なし | |
| 相関係数 | 0.996あ | 0.9991あ | 0.9994あ | 0.996あ | 0.998あ | 0.971b | 0.987b | 0.99あ 0.98b |
| 回帰式 | 該当なし | y = 5.7853x +19.9383 |
y = 1.1104x + 6.9755 |
y = 7.949x + 2460 | y = 0.96x | 該当なし | 該当なし | y = 0.0399x -0.1271 |
| a: ピアソン相関係数 | ||||||||
| b: R二乗 | ||||||||
表2:以前の方法と現在の研究の比較。
補足図1:アンピシリンを含む薄層クロマトグラム(TLC)プレートを青色LED照明法でスキャンしました。 (A)TLC分析の移動相として酢酸エチル:メタノール(9:13 v / v)を使用し、TLCプレートを青色LEDイルミネーターでスキャンしました。(B)アンピシリンの4つの標準物質の濃度は、1番(100 mg / mL)、2番(75 mg / mL)、3番(50 mg / mL)、および4番(25 mg / mL)でした。バンドの寸法は、イメージングソフトウェアによって測定されました。(C)TLCプレート上のアンピシリン標準バンドの寸法に基づくデータ分析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して回帰モデルを開発しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:青色LED照明法でスキャンしたアプラマイシンを含む薄層クロマトグラム(TLC)プレート。 (A)メタノール:水(6:5 v / v)をTLC分析の移動相として使用し、TLCプレートを青色LEDイルミネーターでスキャンしました。(B)4つのアプラマイシン標準の濃度は、No.1(50 mg / mL)、No.2(40 mg / mL)、No.3(30 mg / mL)、およびNo.4(20 mg / mL)でした。バンドの寸法は、イメージングソフトウェアによって測定されました。(C)TLCプレート上のアプラマイシン標準バンドの寸法に基づくデータ分析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して回帰モデルを開発しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、HPTLC、HPLC、GC法などの高価で特殊な機器を使用せずに化合物を定量する新しいアプローチである青色LEDイルミネーターについて説明し、その方法をバイオアッセイおよびUV検出法と比較して定量性能を評価しました。その結果、青色LED照明法は、TLCプレート上の標的化合物の収率を定量化するために使用される比較的安全で効果的なプロトコルであると結論付けられました。
これまでの研究では、特殊な定量装置を使用しない定量方法がいくつか報告されており、すべての研究で、定量の精度は特殊な機器を使用した場合の精度に近いことが示されました2,9,10,11,12(表2)。例えば、El-Gindyら10は、HPLCとTLC密度測定法に基づいて推定収率の精度を比較し、その結果、2つの方法の間に有意差がないことを示しました(p値<0.05)。本研究では、青色LED照明法と比較して、El-Gindyらが開発したTLC濃度測定法10は特殊な波長検出器を必要とし、青色LED照明法は簡単で安価な青色LEDスキャナーを必要とした。一方、青色LEDスキャナーは、ゲル電気泳動スキャンなどの他の目的にも使用できますが、Elkadyらによって開発された特殊なTLCスキャナー11は、TLC濃度測定法にのみ使用されていました。
TLC密度測定法10,11に加えて、サンプルの収量を検出するためにフラットベッドスキャナーとデジタルカメラ法が開発されました。たとえば、ジョンソン9は、フラットベッドスキャナーを使用した迅速なTLC検出方法を確立し、市販の画像ソフトウェアを使用して吸収を測定しました。しかし、青色LED照明方式で使用した画像ソフトは無料で使いやすいものでした。Hess2は、デジタルカメラで撮影したTLCプレート画像のバンドの寸法を推定するソフトウェア「TLCアナライザー」を開発しましたが、これは本研究のUV検出法と同様でした。ただし、どちらの方法も、UV光の危険性と相互作用する可能性があります。
標準バンドの次元に基づく回帰モデルは、バイオアッセイ、青色LED照明器、およびUV検出法のために開発され、R2乗値はそれぞれ0.99、0.98、および0.97でした(表1)。高い線形性(R2乗)が達成されたため、回帰モデルがサンプルの収率を測定できることが示唆されました。回帰モデルのX値を標準バンドの次元で代入し、推定収量(回帰モデルの予測Y値)は、バイオアッセイ、青色LED、およびUV検出法によってそれぞれ約5.6、5.4、および5.3でした。結果は、青色LED照明器を使用したR2乗と推定収量が、UV検出法よりもバイオアッセイ法(対照として設定)に近いことを示しました(表1)。
このアプローチの限界を理解するために、このアプローチは、アンピシリンとアプラマイシンを含む他の2つの化合物を検出するためにも適用されました。結果を補足図1及び補足図2に示す。このアプローチでは、2つの重要なステップに注意する必要があります:(1)乾燥後、プレートをすぐに視覚化する必要があります。遅延可視化はスポット検出に影響を与える可能性があります。(2)プレートからのスキャン画像はバックグラウンドが高く、スポットの面積の測定が困難になるため、プレートの露出オーバーはお勧めしません。
結論として、青色LED照明法は、他の定量クロマトグラフィー法と比較して、サンプルの収率の定量化を高速化するための比較的安全で、時間を節約し、安価で、手間のかからないアプローチです。したがって、このアプローチは、予算が限られているラボの開発に使用するのに理想的なプロトコルです。一方、青色LED照明法から取得したTLCプレート画像は、UV検出法から取得した画像よりもはるかに鮮明でした(図3A 対。 図4A)、これはTLCプレート上のバンドの寸法を正確に決定し、サンプルの収量を推定するのにも役立ちました。
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Disclosures
すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、台湾科学技術部(MOST 108-2320-B-110-007-MY3)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
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