Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Cellefri proteinsyntese fra exonuklease-mangelfulde cellulære ekstrakter ved hjælp af lineære DNA-skabeloner

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64236
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenteres en protokol til fremstilling og bufferkalibrering af celleekstrakter fra exonuklease V knockout-stammer af Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD og ΔrecB). Dette er en hurtig, nem og direkte tilgang til ekspression i cellefrie proteinsyntesesystemer ved hjælp af lineære DNA-skabeloner.

Abstract

Cellefri proteinsyntese (CFPS) er for nylig blevet meget populær inden for syntetisk biologi på grund af dens mange fordele. Brug af lineære DNA-skabeloner til CFPS vil yderligere gøre det muligt for teknologien at nå sit fulde potentiale, hvilket reducerer den eksperimentelle tid ved at eliminere trinene til kloning, transformation og plasmidekstraktion. Lineært DNA kan hurtigt og let forstærkes af PCR for at opnå høje koncentrationer af skabelonen, hvilket undgår potentiel in vivo-ekspressionstoksicitet. Imidlertid nedbrydes lineære DNA-skabeloner hurtigt af exonukleaser, der er naturligt til stede i celleekstrakterne. Der er flere strategier, der er blevet foreslået for at tackle dette problem, såsom tilføjelse af nukleasehæmmere eller kemisk modifikation af lineære DNA-ender til beskyttelse. Alle disse strategier koster ekstra tid og ressourcer og har endnu ikke opnået næsten plasmidniveauer af proteinekspression. En detaljeret protokol for en alternativ strategi præsenteres her for brug af lineære DNA-skabeloner til CFPS. Ved at bruge celleekstrakter fra exonuklease-mangelfulde knockout-celler forbliver lineære DNA-skabeloner intakte uden at kræve nogen slutmodifikationer. Vi præsenterer forberedelsestrinnene for cellelysat fra Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stamme ved sonikeringslysis og bufferkalibrering for Mg-glutamat (Mg-glu) og K-glutamat (K-glu) specifikt til lineært DNA. Denne metode er i stand til at opnå proteinekspressionsniveauer, der kan sammenlignes med det fra plasmid-DNA i E. coli CFPS.

Introduction

Cellefri proteinsyntese (CFPS) systemer bruges i stigende grad som en hurtig, enkel og effektiv metode til biosensorteknik, decentraliseret fremstilling og prototyping af genetiske kredsløb1. På grund af deres store potentiale anvendes CFPS-systemer regelmæssigt inden for syntetisk biologi. Indtil videre er CFPS-systemer imidlertid afhængige af cirkulære plasmider, der kan begrænse teknologien fra at nå sit fulde potentiale. Forberedelse af plasmid-DNA afhænger af mange tidskrævende trin under kloning og store mængder DNA-isolering. På den anden side kan PCR-amplifikation fra et plasmid eller en syntetiseret DNA-skabelon bruges til blot at forberede CFPS-skabeloner inden for få timer 2,3. Derfor tilbyder anvendelse af lineært DNA en lovende løsning til CFPS. Imidlertid nedbrydes lineært DNA hurtigt af exonukleaser, der er naturligt til stede i cellulære ekstrakter4. Der er løsninger, der løser dette problem, såsom at bruge λ-GamS-protein5 eller DNA indeholdende Chi-steder6 som beskyttelsesmidler eller direkte beskytte det lineære DNA ved kemisk modifikation af dets ender 2,7,8,9. Alle disse metoder kræver tilskud til celleekstraktet, som er dyre og tidskrævende. Det har været kendt i lang tid, at exonuklease V-komplekset (RecBCD) nedbryder lineært DNA icellelysater 4. For nylig viste vi, at lineært DNA kan beskyttes meget bedre i lysater fra celler, der er slået ud for exonukleasegener (recBCD)10.

I denne protokol beskrives trin til fremstilling af cellefrie lysater fra E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stammen ved sonikeringslyse detaljeret. Sonikeringslysis er en almindelig og overkommelig teknik, der anvendes af flere laboratorier11,12. De ekstrakter, der fremstilles af denne stamme, behøver ikke tilføjelse af ekstra komponent- eller DNA-skabelonmodifikation for at understøtte ekspression fra lineære DNA-skabeloner. Metoden er afhængig af det væsentlige trin i bufferoptimering for celleekstrakter specifikt til lineær DNA-ekspression fra indfødte E. coli-promotorer. Det har vist sig, at denne specifikke bufferoptimering til lineær DNA-ekspression er nøglen for indfødte σ70-promotorer til at give høj proteinproduktion uden GamS-protein eller Chi DNA-tilskud, selv undgå oprensning af PCR-produkterne10. Den optimale koncentration af Mg-glu til lineær DNA-ekspression viste sig at svare til den for plasmid-DNA. Den optimale koncentration af K-glu viste imidlertid en væsentlig forskel mellem lineært og plasmid-DNA, sandsynligvis på grund af en transkriptionsrelateret mekanisme10. Funktionaliteten af proteiner udtrykt ved hjælp af denne metode er blevet demonstreret til flere anvendelser, såsom hurtig screening af tåholdsafbrydere og aktivitetsvurdering af enzymvarianter10.

Denne protokol giver en enkel, effektiv og omkostningseffektiv løsning til brug af lineære DNA-skabeloner i E. coli-cellefrie systemer ved blot at bruge mutante ΔrecBCD-celleekstrakter og specifik kalibrering til lineært DNA som skabelon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af medier og buffer

  1. Fremstilling af 2xYT+P medium (fast og flydende)
    1. Forbered flydende og faste medier som beskrevet i tabel 1, og steriliser derefter ved autoklavering.
      BEMÆRK: Denne protokol kræver en 2xYT + P agarplade indeholdende chloramphenicol (10 μg / ml). Volumenet af flydende medier er proportionalt med volumenet af det krævede lysat. Her anvendes et startvolumen på 5 L flydende 2xYT+P-medier. Volumenet kan dog justeres efter behov, idet man ved, at 1 L af cellekulturen resulterer i 2 til 3 ml af det endelige cellelysat.
  2. Fremstilling af chloramphenicol (34 mg/ml)
    1. Vej 0,34 g chloramphenicol, tilsæt ethanol til 10 ml og opløs ved blanding. Aliquot 1 ml hver i flere rør, og opbevares ved -20 ° C til brug senere.
  3. Klargøring af S30A buffer
    1. Forbered S30A-buffer i henhold til tabel 2, der sigter mod 2 L af denne buffer.
      BEMÆRK: Endnu en gang er volumenet af denne buffer proportional med volumenet af det krævede lysat.
    2. Før autoklavering justeres bufferens pH til 7,7 ved hjælp af iseddike.
    3. Autoklave bufferen.
    4. Hold denne buffer ved 4 °C efter autoklavering.
    5. Før brug tilsættes DTT (filtreret med et 0,22 μm membranfilter) til S30A-bufferen for at nå en endelig koncentration på 2 mM (2 ml lager 1 M DTT til 1 liter S30A-buffer).
      BEMÆRK: Endnu en gang er volumenet af denne buffer proportional med volumenet af det krævede lysat.
  4. Fremstilling af energiopløsning
    BEMÆRK: Denne energiløsning er baseret på Sun et al. papir13 (14x lagerkoncentration). Tabel 3 opsummerer de komponenter, der er nødvendige til fremstilling af energiopløsningslageret, med katalognumre for alle de kemikalier, der anvendes i denne protokol.
    1. Stamopløsningerne fremstilles i henhold til tabel 3 , og de opbevares på is.
    2. Den ønskede pH-værdi kalibreres for de angivne komponenter, enten med Tris-buffer 2 M (60,57 g Tris-base i et sterilt vand på 250 ml) eller KOH 15 % (15 g KOH i et sterilt vand på 100 ml) som angivet i tabel 3.
    3. I et 15 ml rør tilsættes volumenet af hver komponent i den rækkefølge, der er angivet i tabel 3.
    4. Aliquot energiløsningen, 150 μL pr. rør.
    5. Flash fryser aliquots på tøris og opbevares ved -80 °C.
  5. Fremstilling af aminosyreopløsning (AA)
    BEMÆRK: Aminosyreopløsning fremstilles af RTS Amino Acid Sampler kit. Hver af de 20 aminosyrer leveres i dette sæt som et 1,5 ml volumen ved 168 mM, undtagen leucin, som er ved 140 mM. Her er den forberedte lageropløsning 4x koncentreret, snarere end den krævede arbejdsløsning. Den endelige koncentration af aminosyreopløsningen er 6 mM for alle aminosyrer, undtagen leucin, som er ved 5 mM.
    1. De 20 aminosyrerør optøes ved hvirveldannelse og inkuberes ved 37 °C, indtil de er helt opløst.
      BEMÆRK: Cys opløses muligvis ikke helt.
    2. I et 50 ml rør tilsættes 12 ml sterilt vand og 1,5 ml hver af aminosyrerne i den rækkefølge, der er angivet i tabel 4.
    3. Hvirvel, indtil opløsningen er nogenlunde klar, og inkuberes om nødvendigt ved 37 °C.
      BEMÆRK: Cys opløses muligvis ikke helt.
    4. Aliquot 500 μL af aminosyreopløsningen pr. rør på is.
    5. Flash-frys aliquoterne på tøris og opbevares ved -80 °C.
  6. Fremstilling af opløsninger til bufferkalibrering
    1. Stamopløsningen til Mg-glu (100 mM) og K-glu (3 M) fremstilles som angivet i tabel 5. Der foretages en seriel fortynding (i 1 ml volumen) fra disse lagre for Mg-glu (0 til 20 mM) og K-glu (20 til 300 mM) som angivet i supplerende fil 1 til kalibreringstrin.
      BEMÆRK: Disse lagerkoncentrationer er til kalibreringstrinnet og skal muligvis ændres, når det endelige forsøg opsættes. De højeste koncentrationer af de bestande, der testes for denne protokol, er 1 M og 4,5 M for henholdsvis Mg-glu og K-glu.
  7. Fremstilling af PEG8000-opløsningsmateriale
    1. Der fremstilles 50 ml 40 % PEG8000-opløsning (20 g PEG8000 i et 50 ml volumen sterilt vand).

2. Cellekultur og lysatpræparat (4 dages eksperiment)

  1. Dag 1
    1. Stribestamme BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (tabel 6) fra -80 °C glycerolbestand til en 2xYT+P agarplade, der indeholder 10 μg/ml chloramphenicol. Alternativt kan BL21 Rosetta2 ΔrecB (tabel 6) også anvendes10.
    2. Inkuberes natten over ved 37 °C.
  2. Dag 2
    1. Inokuler en enkelt koloni fra ovenstående agarplade i 10 ml 2xYT+P suppleret med 10 μg/ml chloramphenicol.
    2. Inkuberes natten over ved 37 °C med rystelser på 200 omdr./min.
  3. Dag 3
    1. Lav en subkultur ved at fortynde natten over kultur 100 gange til 4 L friske 2xYT + P medier indeholdende 10 μg / ml chloramphenicol.
      BEMÆRK: For eksempel tilføjes 40 ml af overnatningskulturen til 3960 ml friske medier. Efter fortynding opdeles 4 L-mediet i 4 kolber (5 L volumen), således at hver kolbe indeholder 1 L.
    2. Inkuberes ved 37 °C, 200 o / min i ca. 3 til 4 timers vækst for at nå en OD600 på 1,5-2,0. Fortynd kulturen med 4x, hvis der målesOD 600 > 0,8.
      BEMÆRK: Den nøjagtige inkubationstid kan variere afhængigt af stammen, den indledende podning, labware og de anvendte instrumenter. ΔrecB/ΔrecBCD knockout-stammerne har vækstrater, der kan sammenlignes med BL21 Rosetta2-forældrene (supplerende figur 1).
    3. Læg kulturen på is.
    4. Drej cellerne ned ved 5.000 x g i 12 minutter ved 4 °C, og kassér derefter supernatanten ved dekantering.
    5. Resuspender cellepillerne i 800 ml kølet S30A + DTT.
      BEMÆRK: Volumenet af S30A + DTT er 5x mindre end det oprindelige cellekulturvolumen. For eksempel for et startvolumen på 1 L af cellekulturen resuspenderer cellepiller i 200 ml S30A + DTT. Det anbefales også at udføre dette trin i et koldt rum ved 4 ° C samt holde alle materialer på is.
    6. Drej cellerne ned ved 5.000 x g i 12 minutter ved 4 °C, og kassér derefter supernatanten ved dekantering.
    7. Gentag trin 2.3.5 og 2.3.6.
    8. Resuspender cellepiller i 160 ml kølet S30A + DTT.
      BEMÆRK: Denne gang er volumenet af S30A + DTT 25x mindre end det oprindelige cellekulturvolumen. For eksempel for et startvolumen på 1 L af cellekulturen resuspenderer cellepiller i 40 ml S30A + DTT. Igen anbefales det at udføre dette trin i et koldt rum ved 4 ° C samt at holde materialerne på is.
    9. Overfør cellerne til kølede og forvejede 50 ml rør.
    10. Drej cellerne ned ved 2.000 x g i 8 minutter ved 4 °C, og kassér derefter supernatanten ved dekantering.
    11. Drej cellerne ned ved 2.000 x g i 4 minutter ved 4 °C, og fjern derefter den resterende supernatant forsigtigt ved hjælp af en pipette.
    12. Mål rørets vægt igen for at beregne vægten af cellepellet.
    13. Hold cellepillerne ved -80 °C.
  4. Dag 4
    1. Tag cellepillerne fra -80 °C og tø dem op på is i 1-2 timer.
    2. Resuspender cellepillerne i 0,9 ml S30A + DTT-buffer pr. Gram af pellets vægt. Pipetter langsomt for at resuspendere cellerne, undgå topskum så meget som muligt, hvis nogen.
    3. Anbring 1 ml alikvoter af de resuspenderede celler i 1,5 ml mikrorør, og hold dem på is eller en forkølet koldblok ved 4 °C (det foretrækkes at bruge metalblokke).
      BEMÆRK: Hvis den sidste aliquot er meget mindre end 1 ml, er det bedre at kassere det end at sonikere et suboptimalt volumen. Det optimale volumen (1 ml) til sonikering blev bestemt for denne opsætning (rør, sonikator og sonde) og kan variere for en anden.
    4. Soniker hvert rør i en sonikator (3 mm sonde, frekvens 20 kHz), med en opsætning af 20% amplitude i tre cyklusser (30 s sonikering, 1 min pause).
      BEMÆRK: Den samlede energi, der blev leveret over de tre cyklusser, var ~ 266 Joule (~ 80-110 Joule pr. Cyklus). I løbet af dette trin skal du holde rørene på den kolde blok, der er omgivet af is. Skift mellem to kolde blokke for at undgå overophedning af sonden (standby-køleblokken holdes også kold på is). Begge de kolde blokke blev forkølet i køleskabet dagen før sonikeringen.
    5. Drej lysatet ned ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    6. Opsamling supernatanten (cellelysat) med en pipette og overfør til et 50 ml rør.
    7. Inkuber cellelysatet ved 37 °C ved 200 omdr./min. omrøring i 80 min.
    8. Drej lysatet ned ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    9. Supernatanten og aliquot 30 μL opsamles hver i forkølede 1,5 ml mikrorør, mens alle rør holdes på is.
    10. Lysataliquoterne lynfryses på tøris og opbevares ved -80 °C.

3. Cellefri bufferkalibrering til lineært DNA

BEMÆRK: Cellefri buffer blev kalibreret til optimale Mg-glu- og K-glu-koncentrationer som beskrevet i Sun et al.13. Supplerende fil 1 er nødvendig for kalibreringstrinnene. Reaktionerne blev sat til et endeligt volumen på 10,5 μL hver. Ekstrakter blev kalibreret ved hjælp af 1 nM lineær (se punkt 4 nedenfor) eller plasmid-DNA. Forsøgene kan udføres samme dag, som bufferne fremstilles, eller de forberedte buffere kan fryses ved -80 °C for at udføre forsøget på en anden dag. For alle kalibreringstrin blev hver komponent optøet på is, før den blev blandet og pipetteret i en 384-brøndsplade.

  1. Forbered en Master Mix i henhold til fanen 'Bufferforberedelse' i Excel-filens supplerende fil 1, der indeholder: (a) celleekstrakt (33% af det samlede reaktionsvolumen), (b) reporter-DNA (som lineært og / eller plasmid-DNA) til en endelig koncentration på 1 nM, (c) cellefri buffer (PEG8000, AA-opløsning og energiopløsning) og (d) K-glu til en endelig koncentration på 80 mM.
  2. For et reaktionsvolumen på 10,5 μL tages 1,05 μL (10% total reaktion) af forskellige koncentrationer af Mg-glu 10x koncentrerede bestande (endelige koncentrationsintervaller: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 og 20 mM) og tilsættes 9,45 μL (90% total reaktion) af Master Mix. Bland forsigtigt.
    BEMÆRK: Brug PCR-rør med otte strimler til at forberede fortyndingerne og blandes med en flerkanalspipette. Om nødvendigt kan der anvendes et andet interval af Mg-glu-koncentrationer.
  3. Pipetter 10 μL af ovenstående reaktioner i en 384-brønds firkantet mikroplade, dæk den ved hjælp af en klæbepladeforsegling og mål genekspression som fluorescensudgang. Optag fluorescensdata med en pladelæser (f.eks. 485 nm; Em: 528 nm) med jævne mellemrum (f.eks. 5 min) i 8 timers inkubation ved 30 °C med kontinuerlig orbitalomrystning ved 307 cpm.
    BEMÆRK: Centrifugering om nødvendigt skal du dreje mikropladen med 384 brønde (<2.500 x g, 1 min, stuetemperatur), før du starter dataindsamling. Slutpunktsmålinger blev brugt til at sammenligne GFP-ekspression i de forskellige buffersammensætninger. Fluorescensværdierne kan konverteres til standardiserede enheder til plotning (se nedenfor).
  4. Identificer den Mg-glu-koncentration, der resulterer i den højeste fluorescensværdi ved slutpunktet.
    BEMÆRK: Hvis du er usikker på den optimale opnåede Mg-glu-koncentration, skal du gentage trin 3.2 med mere forskellige koncentrationsintervaller.
  5. Med den optimerede Mg-glu-koncentration skal du fortsætte til K-glu-kalibrering for en række koncentrationer (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 og 240 mM) ved hjælp af de samme volumener, der er angivet i trin 3.2. Kør eksperimentet og identificer den højeste fluorescensværdi blandt de testede K-glu-koncentrationer. Dette indikerer den optimale buffersammensætning for Mg-glu og K-glu for dette lysat.
    BEMÆRK: Hvis du er usikker på den optimale opnåede K-glu-koncentration, skal du gentage trinnet med mere forskellige koncentrationsintervaller.
  6. Når Mg-glu- og K-glu-værdierne er etableret, skal du forberede lagerrør med den optimerede buffersammensætning i henhold til det opnåede batchvolumen. Brug fanen "Bufferforberedelse" i supplerende fil 1 til at beregne antallet af nødvendige bufferrør, aliquot 38 μL pr. rør, og opbevar ved -80 °C.

4. Lineær DNA-forberedelse

BEMÆRK: Til lysatkalibrering anvendes plasmid P70a-deGFP. Dette plasmid blev opretholdt i E. coli KL740 cl857+ (tabel 6) til miniprep ved hjælp af Plasmid Miniprep Kit eller maxiprep ved hjælp af Plasmid Maxiprep Kit. Lineære DNA-fragmenter, der blev brugt som ekspressionsskabeloner i de cellefrie reaktioner, blev PCR-forstærket ved hjælp af primerne og skabelonerne, der er anført i tabel 7 og tabel 8.

  1. PCR forstærker fra plasmid P70a-deGFP ved anvendelse af DNA-polymerase med oligoprimere opført i tabel 7. PCR-reaktionerne indstilles i et volumen på 50 μL i henhold til producentens protokol ved hjælp af termocyklerprogrammet: [98 °C i 2 min; 40 cyklusser x (98 °C i 30 s → 66 °C i 30 s → 72 °C i 60 s); 72 °C i 10 min; 4 °C i ∞].
  2. Skabelon-DNA'et fordøjes i PCR-reaktionerne ved at tilsætte 1 μL DpnI-restriktionsenzym pr. 50 μL PCR-reaktion og inkuberes ved 37 °C i 1 time. Rens derefter PCR-reaktionen ved hjælp af et PCR- og DNA-oprydningssæt og eluer i nukleasefrit vand.
  3. Kontroller PCR-produkterne på en 1% agarosegel (1x TAE) inden brug.
  4. Kvantificer de oprensede PCR-produkter (eller plasmidforberedelserne) ved hjælp af Nanodrop (ND-1,000).
    BEMÆRK: Hvis der anvendes en DNA-polymerase/buffer, der er direkte kompatibel med den nedstrøms cellefrie reaktion, kan oprensningstrin (trin 2) springes helt over, og koncentrationen af urenset DNA måles ved et fluorometrisk assay med DNA-bindende farvestof i stedet (se Batista et al.10).

5. Eksperimentel udførelse

BEMÆRK: Ud over at bruge supplerende fil 1 til at kalibrere bufferlageret for hver klaret lysatbatch, der er fremstillet (ovenfor), anbefales det at bruge fanen 'Reaktionspræparat' i filen til at konfigurere de efterfølgende cellefrie reaktioner. Som tidligere er reaktionernes volumen sat til 10,5 μL pr. reaktion, hvoraf kun 10 μL til sidst pipetteres ind i 384-brøndspladen til dataindsamling. Her bruges 5 nM af hver skabelon til cellefrit udtryk. Det er vigtigt at være konsekvent, når du pipetterer reaktionerne - brug den samme pipette og typen af spidser. Dispenser omhyggeligt for at undgå bobler i brønden eller væske, der klæber til brøndens vægge. Drej om nødvendigt pladen ned (<2.500 x g, 1 min, stuetemperatur).

  1. Beregn mængderne til pipette ved at indtaste de prøvebeskrivelser og replikater, der er nødvendige pr. prøve, i fanen 'Reaktionsforberedelse' i supplerende fil 1.
    BEMÆRK: Hvis der kræves et andet reaktionsvolumen end 10,5 μL, kan det også indtastes i supplerende fil 1. Filen beregner antallet af rør af tidligere optimerede bufferlagre og celleekstraktrørene, der skal optøes på is.
  2. Mærk et 1,5 ml mikrorør til det optimale mastermixpræparat (separat for lineært og plasmid-DNA), tilsæt de korrekte volumener af bufferen og lysat, og bland forsigtigt.
    BEMÆRK: På grund af forskelle i optimale K-glu-koncentrationer i deres buffere skal kopier af fanen 'Reaktionspræparat' laves til brug separat til lineær og plasmid-DNA.
  3. Dna-prøverne pipetteres først, efterfulgt af nukleasefrit vand og til sidst Optimal Master Mix (MM) fra trin 5.2. Bland den cellefrie reaktion forsigtigt med pipetten, lige før den tilsættes pladelæseren, og undgå bobler.
    BEMÆRK: Brug et PCR-rør med otte strimler til at blande reaktionsvolumenet til en yderligere replikat. For eksempel, hvis tekniske triplikater er beregnet, skal du forberede en blanding til fire reaktioner og efterlade et dødt volumen i røret for at reducere pipetteringsfejl, mens prøverne tilsættes til pladen.
  4. Indstil reaktionerne i pladelæseren (ex 485 nm; Em 528 nm). Kinetiske kørsler registrerede fluorescensdata med jævne mellemrum (f.eks. 5 min) i 8 timers inkubation ved 30 °C med kontinuerlig orbitalrystelse ved 307 cpm.
    BEMÆRK: Slutpunktsmålinger blev rapporteret som 8 timers tidspunkt. De indsamlede fluorescensværdier er i vilkårlige enheder (a.u.), men de kan konverteres til standardiserede enheder til plotning (se nedenfor).

6. Relativ måling af FITC og GFP

BEMÆRK: GFP-udtryk eksporteres af pladelæseren i vilkårlige fluorescensenheder (a.u.). Det anbefales dog at bruge standardiserede måleenheder for at sammenligne fluorescensværdier mellem forskellige indstillinger (batcher, udstyr, brugere og laboratorier). Her præsenteres detaljerede trin til at konvertere fluorescensværdierne (a.u.) til FITC-ækvivalente og eGFP (μM) værdier ved hjælp af standardkurver for NIST-FITC og rekombinant eGFP. Opbevar NIST-FITC-stamopløsning ved 4 °C, og opbevar rekombinant eGFP ved -20 °C. Sørg for, at stamopløsningen og seriefortyndingerne er beskyttet mod lys. Ved levering anbefales det at aliquotere den rekombinante eGFP i mindre mængder for at undgå flere fryse-optøningscyklusser.

  1. Der fremstilles en opløsning af 100 mM natriumborat, pH 9,5, og opbevares ved stuetemperatur eller ved 4 °C.
  2. Der forberedes 12 fortyndinger (70 μL hver) til standardkurven, 2x pr. trin (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562, 0,781, 0,390, 0,195, 0,097, 0,048 og 0 μM) NIST-sporbar FITC-standard fra 50 μM-stammen ved hjælp af natriumboratopløsningen. Fortyndingsserien forberedes i tre eksemplarer.
  3. I lighed med trin 6.2 fremstilles serielle fortyndinger (70 μL hver) fra den rekombinante eGFP ved anvendelse af natriumboratopløsningen (1.2, 0.3, 0.075, 0.0188, 0.0047, 0.0012, 0.,0003, 0.,00007 og 0 μM). Til molaritetsberegning skal du overveje proteinets fulde størrelse (28 kDa) og koncentrationen af den oprensede eGFP (1 g / L). Fortyndingsserien forberedes i tre eksemplarer.
  4. Der tilsættes 20 μL af hver fortynding (ni brønde hver = tre fortyndingsserier x tre tekniske replikater) i en mikroplade med firkantet bund med 384 brønde, dækket af en klæbepladeforsegling, og inkuberes i en pladelæser til måling.
    BEMÆRK: Her var de anvendte indstillinger Excitation: 485/20, Emission: 528/20, med gevinst 50. Yderligere bølgelængde/forstærkningskombinationer kan dog også bruges til at kalibrere for andre fluorescerende molekyler og/eller forstærkningsindstillinger. For at beregne konverteringsfaktoren kræves de samme bølgelængde- og forstærkningsindstillinger for at erhverve GFP-fluorescensdata fra de cellefrie eksperimenter og standardkurvedataene.
  5. Brug det lineære signalområde (her for eksempel [FITC] ≤ 0,781 μM) til at passe til hældningen [y = ax og R2] for hver tilstand.
    BEMÆRK: Udvalget kan variere for forskellige maskiner og anvendte standardløsninger.
  6. Gem dataene til FITC- og eGFP-kalibrering for at beregne relative målinger for laboratoriet ved at følge eksemplet i tabel 9. Divider de værdier, der opnås i fluorescensvilkårlige enheder (a.u.), med kurvehældningsværdien "a" (y = ax) for at estimere GFP-produktionen i form af FITC eller eGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative resultater vises her efter kalibrering af lysatet for optimale Mg-glutamat- og K-glutamatniveauer separat for lineært og plasmid-DNA (figur 1). Den optimale koncentration af Mg-glutamat er ens på tværs af ΔrecB - og ΔrecBCD-ekstrakter ved 8 mM (figur 1B). Den optimale K-glutamatkoncentration for plasmid-DNA er imidlertid 140 mM, mens den optimale K-glutamatkoncentration for lineært DNA for det samme ekstrakt er 20 mM (figur 1C). I en sammenlignende analyse af GFP-ekspression i ekstrakter fra WT- og ΔrecBCD-celler blev det set, at buffersammensætningen af ekstrakter skal kalibreres specifikt for optimal ekspression fra lineært og plasmid-DNA, der anvendes i exonuklease V-slettede ekstrakter.

Efter kalibreringstrin blev niveauer af GFP-ekspressioner sammenlignet fra lineært og plasmid-DNA (5 nM) i WT- ogΔ-recBCD-ekstraktet (figur 1D). GFP-ekspression fra lineært DNA nåede 102% og 138% af ekspressionen fra plasmid-DNA i ekstrakter fra henholdsvis ΔrecB- og ΔrecBCD-stammer. Tilsammen viser disse resultater, at ekspression fra lineært DNA ved hjælp af en indfødt E. coli σ70-promotor kan nå samme niveau som fra plasmidekspression, når cellelysatet fremstilles fra sådanne mutanter, og den cellefrie buffer er specifikt kalibreret til lineært DNA.

Figure 1
Figur 1: Differentiel bufferoptimering for lineært og plasmid-DNA i ΔrecB/ΔrecBCD-ekstrakter. (A) En 1361 bp lineær DNA-amplikon blev amplificeret fra plasmid p70a-deGFP og anvendt som skabelon for genekspression til bufferkalibrering. (B) Mg-glutamatbufferkalibrering med 1 nM af hver DNA-type ved hjælp af forskellige koncentrationer fra 0 til 20 mM (med K-glutamat fastgjort til 80 mM). Firkantede felter angiver de valgte koncentrationspunkter. P = plasmid-DNA, L = lineært DNA. (C) Efter at have valgt den optimale Mg-glutamatkoncentration for hvert lysat blev K-glutamat titreret fra 20 til 240 mM. Firkantede felter angiver de valgte koncentrationspunkter. P = plasmid-DNA, L = lineært DNA. Data vist på varmekortene (B) og (C) er fra et enkelt eksperiment. (D) Efter bufferkalibrering blev cellefrie reaktioner udført med 5 nM af hver DNA-type. Ekstrakt BL21 Rosetta2 understøtter ikke lineær DNA-ekspression, mens differentielt optimerede ekstrakter fra ΔrecB- og ΔrecBCD-stammer udviser lineært DNA (grønt) udtryk svarende til plasmid-DNA (blå) niveauer. De viste slutpunktsdata er gennemsnitlige SD-± for tre replikater, der udføres samme dag og indsamles efter 8 timers inkubation. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Visuel repræsentation af protokollen. Arbejdsgang for cellelysatforberedelse og lysatoptimering til lineært DNA som skabelon i CFPS-syntese. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Liste over komponenter til fremstilling af flydende og faste 2xYT + P-medier. Mængden (i gram) af hver komponent er specificeret for 1 liter medie. Skaler proportionalt op efter behov. Medier skal autoklaveres før brug. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Liste over komponenter til fremstilling af buffer S30A+DTT. Mængden (i gram) af hver komponent er specificeret for 1 liter buffer S30A. Skaler proportionalt op efter behov. S30A-bufferen autoklaveres og nedkøles derefter (4 °C) inden brug. DTT-bufferen skal fremstilles og filtreres separat som angivet (i 15 ml rør) og opbevares i -20 °C. Lige før du bruger buffer S30A, skal du tilføje 2 ml DTT (fra 1 M lager) til 1 liter S30A buffer. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Liste over komponenter til forberedelse af energiopløsning. Mængden (i gram) eller volumenet af hver bestanddel er angivet (i kolonne G) til fremstilling af et bestemt volumen (i kolonne H) stamopløsninger til den angivne koncentration (i kolonne F). pH-værdien for hver komponent skal justeres, hvis det er nødvendigt, som det er angivet (i kolonne I og J). 14x energiopløsningslager fremstilles ved at blande det anførte volumen af hver komponent (i kolonne K) i den angivne rækkefølge. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Liste over komponenter til fremstilling af aminosyrestamopløsning. Til fremstilling af 4x aminosyrestamopløsning skal alle aminosyrerne blandes i den angivne rækkefølge. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 5. Liste over komponenter til fremstilling af lysatkalibreringsopløsninger. Mængden (i gram) af Mg-glutamat og K-glutamat stamopløsninger specificeres til fremstilling af 50 ml af den angivne koncentration af hver buffer. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 6: Liste over bakteriestammer, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 7: Liste over primere, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 8: Plasmid anvendt i denne protokol til lysatkalibrering og som skabelon til lineær DNA-amplifikation ved PCR. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 9: Konvertering af FITC og eGFP. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende sag 1. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 1. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi, at cellelysat fremstillet af E. coli BL21 Rosetta2 med en genomisk knockout til enten recB eller recBCD operon understøtter højt proteinekspression fra lineære DNA-skabeloner. Denne protokol uddyber en trin-for-trin lysatkalibreringsprocedure, der er specifik for lineære DNA-skabeloner (figur 2), som er et kritisk trin, der fører til det høje udtryk fra σ70-promotorer i lineært DNA og når næsten plasmidniveauer for ækvimolære DNA-koncentrationer. Denne protokol fremhæver vigtigheden af bufferkalibrering i henhold til den type DNA (lineær eller plasmid), der skal anvendes i den endelige anvendelse.

Protokollen kan hjælpe med at undgå plasmidkloning, hvilket giver betydelige gevinster i tid og omkostninger. Lineære DNA-fragmenter kan syntetiseres af kommercielle udbydere og / eller forstærkes af PCR i laboratoriet. Den samme proces ved hjælp af plasmid-DNA ville tage mindst 1 uge længere under hensyntagen til kloning, sekvensverifikation og DNA-forberedelsestrin10. Det anbefales at forberede store mængder af celleekstraktet og lineære DNA-skabeloner for at minimere batch-til-batch-variabilitet mellem eksperimenter14,15.

Denne metode har vist sig at være robust og anvendes på tværs af laboratorier10. Resultaterne fra disse ekstrakter har været konsistente på tværs af biologiske replikater, forskellige ekstraktbatcher samt på tværs af forskellige stammebaggrunde10. Protokollens robusthed er også blevet testet på tværs af forskellige eksperimentelle parametre: cellelysemetoder, temperaturer, DNA-skabeloner og forskellige DNA-koncentrationer. Metoden er allerede blevet brugt til hurtig screening og karakterisering af genetiske konstruktioner til to relevante anvendelser: toehold switch bibliotek karakterisering og enzymaktivitet screening10.

Selvom høje ekspressionsniveauer blev opnået i denne undersøgelse fra lineært DNA i ΔrecB / ΔrecBCD-ekstrakter fra den meget produktive forældrestamme E. coli BL21 Rosetta2, ville metoden kræve genomteknik for en ny stamme af interesse. I modsætning hertil er tilskud med beskyttelsesmidler til lineært DNA, som GamS5 eller Chi DNA6, lettere at anvende for en ny stamme, men dyrere og mere tidskrævende.

Protokollen, der leveres her, vil lette brugen af lineære DNA-skabeloner i cellefrie systemer og fremskynde design-build-testcyklusserne for det syntetiske biologisamfund. Lettere cellefri ekspression fra lineære DNA-skabeloner i ΔrecB/ΔrecBCD-ekstrakter kan anvendes til produktion af små molekyler af interesse, biosimilære lægemidler og andre on-demand point-of-care-applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

ACB og JLF anerkender finansieringsstøtte fra ANR SINAPUV-tilskuddet (ANR-17-CE07-0046). JLF og JB anerkender finansieringsstøtte fra ANR SynBioDiag-tilskuddet (ANR-18-CE33-0015). MSA og JLF anerkender finansieringsstøtte fra ANR iCFree-tilskuddet (ANR-20-BiopNSE). JB anerkender støtte fra EFR, der starter "COMPUCELL" (tilskudsnummer 657579). Centre de Biochimie Structurale anerkender støtte fra den franske infrastruktur for integreret strukturbiologi (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK anerkender finansieringsstøtte fra INRAe's MICA-afdeling, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) regionens DIM-RFSI og ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Dette arbejde blev støttet af finansiering gennem European Research Council Consolidator Award (865973 til CLB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-YT Broth Invitrogen 22712020
1.5 mL Safe-Lock tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL microtube
384-well square-bottom microplate Thermo Scientific Nunc 142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) Sigma-Aldrich P8877
adhesive plate seal Thermo Scientific Nunc 232701
Agar Invitrogen 30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma-Aldrich A8937
BL21 Rosetta2 Merck Millipore 71402
BL21 Rosetta2 ΔrecB Addgene 176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCD Addgene 176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) Sigma-Aldrich  A9501
Chloramphenicol  Sigma-Aldrich C0378
CoA (Coenzyme A hydrate) Sigma-Aldrich C4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile Corning 430790 15 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile Corning 430828 50 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) Alfa Aesar  J62238
DpnI NEB R0176S
DTT (DL-Dithiothreitol) Sigma-Aldrich D0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) Sigma-Aldrich F7878
GTP (Guanosine 5?-Triphosphate,  Disodium Salt) Sigma-Aldrich 371701
HEPES Sigma-Aldrich  H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4) Carl Roth 231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P) Sigma-Aldrich P5655
K-glutamate Alfa Aesar A17232
Mg-glutamate  Sigma-Aldrich 49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone Merck Millipore SLGP033RB membrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit NEB T1030S PCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010S Plasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)  Sigma-Aldrich  N6522
NIST-traceable FITC standard Invitrogen F36915 NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kit Macherey-Nagel 740414.1 Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000 Sigma-Aldrich 89510
plate reader Biotek  Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP Protein Chromotek egfp-250 recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0492S DNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492L DNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Q32850 fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid Sampler biotechrabbit BR1401801
Spermidine Sigma-Aldrich 85558
Sterile water Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving.
Tris base Life Science products Cytiva 17-1321-01 
tRNA Roche 10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 SONICS VC505 sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) Acros Organics  226310010
Water, nuclease-free Thermo R0581 nuclease-free water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
  3. Schinn, S. -M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
  4. Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
  5. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  6. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
  7. Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
  8. Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
  9. Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
  10. Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
  11. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
  12. Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  13. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  14. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  15. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).

Tags

Bioengineering udgave 186
Cellefri proteinsyntese fra exonuklease-mangelfulde cellulære ekstrakter ved hjælp af lineære DNA-skabeloner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabeti Azad, M., Cardoso Batista,More

Sabeti Azad, M., Cardoso Batista, A., Faulon, J. L., Beisel, C. L., Bonnet, J., Kushwaha, M. Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates. J. Vis. Exp. (186), e64236, doi:10.3791/64236 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter