Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bereiding en bufferkalibratie van celextracten uit exonuclease V knock-out stammen van Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD en ΔrecB). Dit is een snelle, eenvoudige en directe benadering voor expressie in celvrije eiwitsynthesesystemen met behulp van lineaire DNA-sjablonen.
Abstract
Celvrije eiwitsynthese (CFPS) is onlangs erg populair geworden op het gebied van synthetische biologie vanwege de vele voordelen. Het gebruik van lineaire DNA-sjablonen voor CFPS zal de technologie verder in staat stellen zijn volledige potentieel te bereiken, waardoor de experimentele tijd wordt verkort door de stappen van klonen, transformatie en plasmide-extractie te elimineren. Lineair DNA kan snel en gemakkelijk worden versterkt door PCR om hoge concentraties van de sjabloon te verkrijgen, waardoor potentiële in vivo expressietoxiciteit wordt vermeden. Lineaire DNA-sjablonen worden echter snel afgebroken door exonucleasen die van nature aanwezig zijn in de celextracten. Er zijn verschillende strategieën voorgesteld om dit probleem aan te pakken, zoals het toevoegen van nucleaseremmers of chemische modificatie van lineaire DNA-uiteinden voor bescherming. Al deze strategieën kosten extra tijd en middelen en moeten nog bijna-plasmide niveaus van eiwitexpressie verkrijgen. Een gedetailleerd protocol voor een alternatieve strategie wordt hier gepresenteerd voor het gebruik van lineaire DNA-sjablonen voor CFPS. Door celextracten uit exonuclease-deficiënte knock-outcellen te gebruiken, blijven lineaire DNA-sjablonen intact zonder dat er eindaanpassingen nodig zijn. We presenteren de bereidingsstappen van cellysaat uit Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stam door ultrasoonapparaatlyse en bufferkalibratie voor Mg-glutamaat (Mg-glu) en K-glutamaat (K-glu) specifiek voor lineair DNA. Deze methode is in staat om eiwitexpressieniveaus te bereiken die vergelijkbaar zijn met die van plasmide-DNA in E. coli CFPS.
Introduction
Celvrije eiwitsynthese (CFPS) -systemen worden steeds vaker gebruikt als een snelle, eenvoudige en efficiënte methode voor biosensortechnologie, gedecentraliseerde productie en prototyping van genetische circuits1. Vanwege hun grote potentieel worden CFPS-systemen regelmatig gebruikt op het gebied van synthetische biologie. Tot nu toe vertrouwen CFPS-systemen echter op circulaire plasmiden die kunnen voorkomen dat de technologie zijn volledige potentieel bereikt. Het voorbereiden van plasmide-DNA is afhankelijk van vele tijdrovende stappen tijdens het klonen en grote hoeveelheden DNA-isolatie. Aan de andere kant kan PCR-amplificatie van een plasmide, of een gesynthetiseerd DNA-sjabloon, worden gebruikt om eenvoudig CFPS-sjablonen binnen een paar uur voor te bereiden 2,3. Daarom biedt toepassing van lineair DNA een veelbelovende oplossing voor CFPS. Lineair DNA wordt echter snel afgebroken door exonucleasen die van nature aanwezig zijn in cellulaire extracten4. Er zijn oplossingen die dit probleem aanpakken, zoals het gebruik van het λ-faag GamS-eiwit5 of DNA met Chi-sites6 als beschermende middelen, of het direct beschermen van het lineaire DNA door chemische modificatie van de uiteinden 2,7,8,9. Al deze methoden vereisen suppleties aan het celextract, die kostbaar en tijdrovend zijn. Het is al lang bekend dat het exonuclease V-complex (RecBCD) lineair DNA in cellysaten afbreekt4. Onlangs toonden we aan dat lineair DNA veel beter kan worden beschermd in lysaten van cellen die zijn uitgeschakeld voor exonucleasegenen (recBCD)10.
In dit protocol worden stappen voor de bereiding van celvrije lysaten van de E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stam door ultrasoonapparaatlyse in detail beschreven. Sonicatielysis is een veel voorkomende en betaalbare techniek die door verschillende laboratoria wordt gebruikt11,12. De extracten die uit deze stam worden geproduceerd, hebben geen extra component of DNA-sjabloonmodificatie nodig om expressie van lineaire DNA-sjablonen te ondersteunen. De methode is gebaseerd op de essentiële stap van bufferoptimalisatie voor celextracten specifiek voor lineaire DNA-expressie van inheemse E. coli-promotors. Het is aangetoond dat deze specifieke bufferoptimalisatie voor lineaire DNA-expressie de sleutel is voor inheemse σ70-promotors om een hoge eiwitproductie te produceren zonder GamS-eiwit of Chi DNA-suppletie, zelfs het vermijden van zuivering van de PCR-producten10. De optimale concentratie mg-glu voor lineaire DNA-expressie bleek vergelijkbaar te zijn met die voor plasmide-DNA. De optimale concentratie van K-glu toonde echter een aanzienlijk verschil tussen lineair en plasmide-DNA, waarschijnlijk als gevolg van een transcriptiegerelateerd mechanisme10. De functionaliteit van eiwitten die met deze methode tot expressie komen, is aangetoond voor verschillende toepassingen, zoals snelle screening van grijpschakelaars en activiteitsbeoordeling van enzymvarianten10.
Dit protocol biedt een eenvoudige, efficiënte en kosteneffectieve oplossing voor het gebruik van lineaire DNA-sjablonen in E. coli-celvrije systemen door simpelweg mutante ΔrecBCD-celextracten en specifieke kalibratie voor lineair DNA als sjabloon te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Media- en buffervoorbereiding
- Bereiding van 2xYT+P medium (vast en vloeibaar)
- Bereid vloeibare en vaste media zoals beschreven in tabel 1 en steriliseer vervolgens door autoclaveren.
OPMERKING: Dit protocol vereist één 2xYT + P agar-plaat met chlooramfenicol (10 μg / ml). Het volume van vloeibare media is evenredig met het volume van het vereiste lysaat. Hier wordt een startvolume van 5 L vloeibare 2xYT+P media gebruikt. Het volume kan echter naar behoefte worden aangepast, wetende dat 1 L van de celcultuur resulteert in 2 tot 3 ml van het uiteindelijke cellysaat.
- Bereid vloeibare en vaste media zoals beschreven in tabel 1 en steriliseer vervolgens door autoclaveren.
- Bereiding van chlooramfenicol (34 mg/ml)
- Weeg 0,34 g chlooramfenicol af, voeg ethanol toe aan 10 ml en los op door te mengen. Aliquot 1 ml elk in verschillende buizen en bewaar bij -20 °C om later te gebruiken.
- Bereiding van S30A buffer
- Bereid de S30A-buffer voor volgens tabel 2, waarbij wordt gestreefd naar 2 L van deze buffer.
OPMERKING: Nogmaals, het volume van deze buffer is evenredig met het volume van het vereiste lysaat. - Voor het autoclaveren, stelt u de pH van de buffer in op 7,7 met ijsazijn.
- Autoclaaf de buffer.
- Houd deze buffer na het autoclaveren op 4 °C.
- Voeg voor gebruik DTT (gefilterd door een membraanfilter van 0,22 μm) toe aan de S30A-buffer om een eindconcentratie van 2 mM (2 ml voorraad 1 M DTT tot 1 L S30A-buffer) te bereiken.
OPMERKING: Nogmaals, het volume van deze buffer is evenredig met het volume van het vereiste lysaat.
- Bereid de S30A-buffer voor volgens tabel 2, waarbij wordt gestreefd naar 2 L van deze buffer.
- Bereiding van energieoplossing
OPMERKING: Deze energieoplossing is gebaseerd op de Sun et al. paper13 (14x voorraadconcentratie). Tabel 3 geeft een overzicht van de componenten die nodig zijn voor de bereiding van de voorraad energieoplossingen, met catalogusnummers voor alle chemicaliën die in dit protocol worden gebruikt.- Bereid de voorraadoplossingen volgens tabel 3 en bewaar ze op ijs.
- Kalibreer de pH zoals gevraagd voor de aangegeven componenten, hetzij met Tris-buffer 2 M (60,57 g Tris-basis in een volume steriel water van 250 ml) of KOH 15% (15 g KOH in een volume steriel water van 100 ml) zoals aangegeven in tabel 3.
- Voeg in een buis van 15 ml het volume van elk bestanddeel toe in de in tabel 3 aangegeven volgorde.
- Aliquot de energieoplossing, 150 μL per buis.
- Flash vries aliquots in op droogijs en bewaar bij -80 °C.
- Bereiding van aminozuur (AA) oplossing
OPMERKING: Aminozuuroplossing wordt bereid door de RTS Amino Acid Sampler-kit. Elk van de 20 aminozuren wordt in deze kit geleverd als een volume van 1,5 ml bij 168 mM, behalve voor leucine op 140 mM. Hier is de bereide voorraadoplossing 4x geconcentreerd, in plaats van de vereiste werkoplossing. De uiteindelijke concentratie van de aminozuuroplossing is 6 mM voor alle aminozuren, behalve leucine bij 5 mM.- Ontdooi de 20 aminozuurbuizen door vortexing en incubeer bij 37 °C totdat ze volledig zijn opgelost.
OPMERKING: Cys kan niet volledig oplossen. - Voeg in een buis van 50 ml 12 ml steriel water en 1,5 ml elk van de aminozuren toe in de volgorde die is aangegeven in tabel 4.
- Vortex totdat de oplossing vrij helder is, zo nodig incuberend bij 37 °C.
OPMERKING: Cys kan niet volledig oplossen. - Aliquot 500 μL van de aminozuuroplossing per buis op ijs.
- Vries de aliquots in op droogijs en bewaar bij -80 °C.
- Ontdooi de 20 aminozuurbuizen door vortexing en incubeer bij 37 °C totdat ze volledig zijn opgelost.
- Voorbereiding van oplossingen voor bufferkalibratie
- Bereid de stamoplossing voor Mg-glu (100 mM) en K-glu (3 M) zoals aangegeven in tabel 5. Maak uit deze voorraden een seriële verdunning (in volume van 1 ml) voor Mg-glu (0 tot 20 mM) en K-glu (20 tot 300 mM) zoals aangegeven in aanvullend dossier 1 voor kalibratiestappen.
OPMERKING: Deze voorraadconcentraties zijn voor de kalibratiestap en moeten mogelijk worden gewijzigd bij het opzetten van het eindexperiment. De hoogste concentraties van de voor dit protocol geteste voorraden zijn respectievelijk 1 M en 4,5 M voor Mg-glu en K-glu.
- Bereid de stamoplossing voor Mg-glu (100 mM) en K-glu (3 M) zoals aangegeven in tabel 5. Maak uit deze voorraden een seriële verdunning (in volume van 1 ml) voor Mg-glu (0 tot 20 mM) en K-glu (20 tot 300 mM) zoals aangegeven in aanvullend dossier 1 voor kalibratiestappen.
- Bereiding van peg8000 oplossing voorraad
- Bereid 50 ml 40% PEG8000-oplossing (20 g PEG8000 in een volume steriel water van 50 ml).
2. Celkweek en lysaatpreparaat (4 dagen experiment)
- Dag 1
- Streak stam BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (tabel 6) van -80 °C glycerolbouillon op een 2xYT+P agarplaat die 10 μg/ml chlooramfenicol bevat. Als alternatief kan OOK BL21 Rosetta2 ΔrecB (tabel 6) worden gebruikt10.
- Incubeer een nacht bij 37 °C.
- Dag 2
- Ent een enkele kolonie van de bovenstaande agarplaat in 10 ml 2xYT + P aangevuld met 10 μg / ml chlooramfenicol.
- Incubeer 's nachts bij 37 °C met 200 tpm schudden.
- Dag 3
- Maak een subcultuur door de nachtcultuur 100 keer te verdunnen tot 4 L verse 2xYT+P media met 10 μg/ml chlooramfenicol.
OPMERKING: Bijvoorbeeld, 40 ml van de nachtcultuur wordt toegevoegd aan 3960 ml verse media. Na verdunning wordt het medium van 4 L verdeeld in 4 kolven (volume van 5 L), zodat elke kolf 1 L bevat. - Incubeer bij 37 °C, 200 tpm gedurende ongeveer 3 tot 4 uur groei om een OD600 van 1,5-2,0 te bereiken. Verdun de cultuur met 4x bij een afmeting van OD600 > 0,8.
OPMERKING: De exacte incubatietijd kan variëren afhankelijk van de stam, het initiële entmateriaal, labware en de gebruikte instrumenten. De ΔrecB/ΔrecBCD knock-out stammen hebben groeisnelheden die vergelijkbaar zijn met de BL21 Rosetta2 ouder (aanvullende figuur 1). - Zet de cultuur in de ijskast.
- Draai de cellen op 5.000 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant vervolgens weg door te decanteren.
- Resuspendeer de celpellets in 800 ml gekoelde S30A+DTT.
OPMERKING: Het volume van S30A+DTT is 5x minder dan het oorspronkelijke celkweekvolume. Bijvoorbeeld, voor een startvolume van 1 L van de celcultuur, resuspend cel pellets in 200 ml S30A + DTT. Het wordt ook aanbevolen om deze stap uit te voeren in een koelcel bij 4 °C, en alle materialen op ijs te houden. - Draai de cellen op 5.000 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant vervolgens weg door te decanteren.
- Herhaal stap 2.3.5 en 2.3.6.
- Resuspend cel pellets in 160 ml gekoelde S30A+DTT.
OPMERKING: Deze keer is het volume van S30A + DTT 25x minder dan het oorspronkelijke celcultuurvolume. Bijvoorbeeld, voor een startvolume van 1 L van de celcultuur, resuspend cel pellets in 40 ml S30A + DTT. Nogmaals, het wordt aanbevolen om deze stap uit te voeren in een koude ruimte bij 4 ° C, evenals om de materialen op ijs te houden. - Breng de cellen over in gekoelde en vooraf gewogen buizen van 50 ml.
- Draai de cellen op 2.000 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant vervolgens weg door te decanteren.
- Draai de cellen op 2.000 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C en verwijder vervolgens het resterende supernatant voorzichtig met behulp van een pipet.
- Meet het gewicht van de buis opnieuw om het gewicht van de celpellet te berekenen.
- Bewaar de celpellets op -80 °C.
- Maak een subcultuur door de nachtcultuur 100 keer te verdunnen tot 4 L verse 2xYT+P media met 10 μg/ml chlooramfenicol.
- Dag 4
- Neem de celkorrels van -80 °C en ontdooi ze op ijs gedurende 1-2 uur.
- Resuspendeer de celpellets in 0,9 ml S30A+DTT-buffer per gram van het gewicht van de pellets. Pipetteer langzaam om de cellen te resuspenderen en vermijd zoveel mogelijk het schuim van de bovenkant, indien aanwezig.
- Plaats 1 ml aliquots van de geresuspendeerde cellen in microbuisjes van 1,5 ml en bewaar ze op ijs of een voorgekoeld koud blok bij 4 °C (het verdient de voorkeur om metalen blokken te gebruiken).
OPMERKING: Als de laatste aliquot veel minder dan 1 ml is, is het beter om het weg te gooien dan om een suboptimaal volume te soniceren. Het optimale volume (1 ml) voor ultrasoonapparaat werd bepaald voor deze opstelling (buis, sonicator en sonde) en kan variëren voor een andere. - Soniceer elke buis in een sonicator (3 mm sonde, frequentie 20 kHz), met een opstelling van 20% amplitude gedurende drie cycli (30 s ultrasoonapparaat, 1 minuut pauze).
OPMERKING: De totale energie die over de drie cycli werd geleverd, was ~ 266 Joule (~ 80-110 Joule per cyclus). Houd tijdens deze stap de buizen op het koude blok dat omgeven is door ijs. Wissel af tussen twee koude blokken om oververhitting van de sonde te voorkomen (het standby koude blok wordt ook koud gehouden op ijs). Beide koude blokken werden de dag voor de ultrasoonapparaat voorgekoeld in de koelkast. - Draai het lysaat op 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verzamel het supernatant (cellysaat) met een pipet en breng het over in een buis van 50 ml.
- Incubeer het cellysaat bij 37 °C bij 200 rpm roeren gedurende 80 min.
- Draai het lysaat op 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verzamel het supernatant en aliquot 30 μL elk in voorgekoelde microbuisjes van 1,5 ml, terwijl alle buizen op ijs blijven.
- Vries de lysaat aliquots in op droogijs en bewaar bij -80 °C.
3. Celvrije bufferkalibratie voor lineair DNA
OPMERKING: Celvrije buffer werd gekalibreerd voor optimale Mg-glu en K-glu concentraties zoals beschreven in Sun et al.13. Aanvullend bestand 1 is nodig voor de kalibratiestappen. De reacties werden ingesteld op een eindvolume van elk 10,5 μL. Extracten werden gekalibreerd met behulp van 1 nM lineair (zie rubriek 4 hieronder) of plasmide-DNA. De experimenten kunnen worden uitgevoerd op dezelfde dag dat de buffers worden voorbereid, of de voorbereide buffers kunnen worden bevroren bij -80 °C om het experiment op een andere dag uit te voeren. Voor alle kalibratiestappen werd elk onderdeel op ijs ontdooid voordat het werd gemengd en gepipetteerd in een plaat met 384 putten.
- Bereid een Master Mix voor, volgens het tabblad 'Buffervoorbereiding' in het Excel-bestand Aanvullend bestand 1, met daarin: (a) celextract (33% van het totale reactievolume), (b) reporter-DNA (als lineair en/of plasmide-DNA) tot een eindconcentratie van 1 nM, (c) celvrije buffer (PEG8000, AA-oplossing en energieoplossing) en (d) K-glu tot een eindconcentratie van 80 mM.
- Neem voor een reactievolume van 10,5 μL 1,05 μL (10% totale reactie) van verschillende concentraties Mg-glu 10x geconcentreerde voorraden (eindconcentratiebereiken: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 en 20 mM) en voeg 9,45 μL (90% totale reactie) van de Master Mix toe. Meng voorzichtig.
OPMERKING: Gebruik PCR achtstripbuizen om de verdunningen te bereiden en meng met een meerkanaals pipet. Indien nodig kan een ander bereik van Mg-glu-concentraties worden gebruikt. - Pipetteer 10 μL van de bovenstaande reacties in een microplaat met vierkante bodem van 384 goed, bedek deze met een zelfklevende plaatafdichting en meet genexpressie als fluorescentie-output. Registreer fluorescentiegegevens met een plaatlezer (bijvoorbeeld: 485 nm; Em: 528 nm) met regelmatige tussenpozen (bijv. 5 min) gedurende 8 uur incubatie bij 30 °C met continu orbitaal schudden bij 307 cpm.
OPMERKING: Draai indien nodig de 384-well microplaat (<2.500 x g, 1 min, kamertemperatuur) af voordat u begint met het verzamelen van gegevens. Eindpuntmetingen werden gebruikt om GFP-expressie in de verschillende buffersamenstellingen te vergelijken. De fluorescentiewaarden kunnen worden omgezet in gestandaardiseerde eenheden voor plotten (zie hieronder). - Identificeer de Mg-glu-concentratie die resulteert in de hoogste fluorescentiewaarde op het eindpunt.
OPMERKING: Als u niet zeker bent van de optimale mg-glu-concentratie, herhaalt u stap 3.2 met meer diverse concentratiebereiken. - Ga met de geoptimaliseerde Mg-glu-concentratie over op K-glu-kalibratie voor een reeks concentraties (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 en 240 mM), met dezelfde volumes die zijn aangegeven in stap 3.2. Voer het experiment uit en identificeer de hoogste fluorescentiewaarde uit de geteste K-glu-concentraties. Dit geeft de optimale buffersamenstelling voor Mg-glu en K-glu voor dit lysaat aan.
OPMERKING: Als u niet zeker bent van de optimale K-glu-concentratie die wordt verkregen, herhaalt u de stap met meer diverse concentratiebereiken. - Zodra de Mg-glu- en K-glu-waarden zijn vastgesteld, bereidt u voorraadbuizen van de geoptimaliseerde buffersamenstelling voor op basis van het verkregen batchvolume. Gebruik het tabblad 'Buffervoorbereiding' in aanvullend dossier 1 om het benodigde bufferbuizen te berekenen, aliquot 38 μL per buis, en bewaar bij -80 °C.
4. Lineair DNA-preparaat
OPMERKING: Voor lysaatkalibratie wordt plasmide P70a-deGFP gebruikt. Dit plasmide werd onderhouden in E. coli KL740 cl857+ (tabel 6) voor miniprep met behulp van de Plasmid Miniprep Kit, of maxiprep met behulp van de Plasmid Maxiprep Kit. Lineaire DNA-fragmenten die als expressiesjablonen in de celvrije reacties werden gebruikt, werden PCR versterkt met behulp van de primers en sjablonen in tabel 7 en tabel 8.
- PCR-amplificeren uit plasmide P70a-deGFP met behulp van DNA-polymerase met oligoprimers vermeld in tabel 7. Stel de PCR-reacties in een volume van 50 μL in, volgens het protocol van de fabrikant, met behulp van het thermocycler-programma: [98 °C gedurende 2 min; 40 cycli x (98 °C gedurende 30 s → 66 °C gedurende 30 s → 72 °C gedurende 60 s); 72 °C gedurende 10 minuten; 4 °C voor ∞].
- Verwerk het sjabloon-DNA in de PCR-reacties door 1 μL DpnI-restrictie-enzym per 50 μL PCR-reactie toe te voegen en gedurende 1 uur bij 37 °C te incuberen. Zuiver vervolgens de PCR-reactie met behulp van een PCR &DNA-opruimkit en eluuteer in nucleasevrij water.
- Controleer de PCR-producten voor gebruik op een 1% agarose gel (1x TAE).
- Kwantificeer de gezuiverde PCR-producten (of de plasmidevoorbereiding) met Nanodrop (ND-1.000).
OPMERKING: Als u een DNA-polymerase/buffer gebruikt die direct compatibel is met de stroomafwaartse celvrije reactie, kan de zuiveringsstap (stap 2) volledig worden overgeslagen en kan de concentratie van ongezuiverd DNA worden gemeten door een fluorometrische test met DNA-bindende kleurstof (zie Batista et al.10).
5. Experimentele uitvoering
OPMERKING: Naast het gebruik van aanvullend bestand 1 om de buffervoorraad voor elke voorbereide lysaatpartij (hierboven) te kalibreren, wordt aanbevolen om het tabblad 'Reactievoorbereiding' in het bestand te gebruiken om de volgende celvrije reacties in te stellen. Net als voorheen is het volume van de reacties ingesteld op 10,5 μL per reactie, waarvan uiteindelijk slechts 10 μL in de 384-well plaat wordt gepipetteerd voor data-acquisitie. Hier wordt 5 nM van elke sjabloon gebruikt voor celvrije expressie. Het is belangrijk om consistent te zijn bij het pipetteren van de reacties - gebruik dezelfde pipet en het type tips. Doseer voorzichtig om te voorkomen dat er bubbels in de put zijn of vloeistof die aan de wanden van de put kleeft. Draai indien nodig de plaat naar beneden (<2.500 x g, 1 min, kamertemperatuur).
- Bereken de volumes die moeten pipetteren door de monsterbeschrijvingen en replicaties die per monster nodig zijn in te voeren op het tabblad 'Reactievoorbereiding' van aanvullend bestand 1.
OPMERKING: Als een reactievolume anders dan 10,5 μL vereist is, kan dat ook worden ingevoerd in aanvullend bestand 1. Het bestand berekent het aantal buizen van eerder geoptimaliseerde buffervoorraden en de celextractbuizen die op ijs moeten worden ontdooid. - Label een microbuisje van 1,5 ml voor het Optimal Master Mix-preparaat (afzonderlijk voor lineair en plasmide-DNA), voeg de juiste volumes van de buffer en het lysaat toe en meng voorzichtig.
OPMERKING: Vanwege verschillen in optimale K-glu-concentraties in hun buffers, moeten kopieën van het tabblad 'Reactievoorbereiding' worden gemaakt om afzonderlijk te gebruiken voor lineair en plasmide-DNA. - Pipetteer eerst de DNA-monsters, gevolgd door nucleasevrij water en ten slotte de Optimal Master Mix (MM) uit stap 5.2. Meng de celvrije reactie voorzichtig met de pipet vlak voordat u deze aan de plaatlezer toevoegt en vermijd bubbels.
OPMERKING: Gebruik een PCR-buis met acht strips om het reactievolume te mengen voor een extra replicaat. Als bijvoorbeeld technische drievoudstoffen zijn bedoeld, bereid dan een mengsel voor vier reacties voor en laat een dood volume in de buis achter om pipetteerfouten te verminderen terwijl de monsters aan de plaat worden toegevoegd. - Stel de reacties in de plaatlezer in (Ex 485 nm; Em 528 nm). Kinetische runs registreerden fluorescentiegegevens met regelmatige tussenpozen (bijv. 5 min) gedurende 8 uur incubatie bij 30 °C, met continu orbitaal schudden bij 307 cpm.
OPMERKING: Eindpuntmetingen werden gerapporteerd als het 8 uur-tijdspunt. De verzamelde fluorescentiewaarden zijn in willekeurige eenheden (a.u.), maar ze kunnen worden omgezet in gestandaardiseerde eenheden voor plotten (zie hieronder).
6. Fitc- en GFP-relatieve kwantificering
OPMERKING: GFP-expressie wordt door de platenlezer geëxporteerd in willekeurige fluorescentie-eenheden (a.u.). Het wordt echter aanbevolen om gestandaardiseerde meeteenheden te gebruiken om fluorescentiewaarden tussen verschillende instellingen (batches, apparatuur, gebruikers en laboratoria) te vergelijken. Hier worden gedetailleerde stappen gepresenteerd om de fluorescentiewaarden (a.u.) om te zetten naar FITC-equivalente en eGFP (μM) waarden, met behulp van standaardcurven van NIST-FITC en recombinant eGFP. Bewaar de NIST-FITC-stamoplossing bij 4 °C en bewaar recombinant eGFP bij -20 °C. Zorg ervoor dat de stamoplossing en seriële verdunningen beschermd zijn tegen licht. Bij levering wordt aanbevolen om de recombinante eGFP in kleinere volumes te aliquoteren om meerdere vries-dooicycli te voorkomen.
- Bereid een oplossing van 100 mM natriumboraat, pH 9,5, en bewaar bij kamertemperatuur of bij 4 °C.
- Bereid 12 verdunningen (elk 70 μL) voor de standaardcurve, 2x per stap (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562, 0,781, 0,390, 0,195, 0,097, 0,048 en 0 μM) van de NIST-traceerbare FITC-standaard uit de 50 μM-voorraad met behulp van de natriumboraatoplossing. Bereid de verdunningsreeks in drievoud voor.
- Bereid, net als bij stap 6.2, seriële verdunningen (elk 70 μL) uit het recombinante eGFP met behulp van de natriumboraatoplossing (1,2, 0,3, 0,075, 0,0188, 0,0047, 0,0012, 0,0003, 0,00007 en 0 μM). Houd voor de molariteitsberekening rekening met de volledige grootte van het eiwit (28 kDa) en de concentratie van de gezuiverde eGFP (1 g/L). Bereid de verdunningsreeks in drievoud voor.
- Voeg 20 μL van elke verdunning (elk negen putten = drie verdunningenreeks x drie technische replicaties) toe aan een microplaat met vierkante bodem van 384 putten, bedekt met een zelfklevende plaatafdichting, en incubeer in een plaatlezer voor meting.
OPMERKING: Hier waren de gebruikte instellingen Excitatie: 485/20, Emissie: 528/20, met versterking 50. Aanvullende golflengte/versterkingscombinaties kunnen echter ook worden gebruikt om te kalibreren voor andere fluorescerende moleculen en/of versterkingsinstellingen. Om de conversiefactor te berekenen, zijn dezelfde golflengte- en versterkingsinstellingen vereist om de GFP-fluorescentiegegevens van de celvrije experimenten en de standaardcurvegegevens te verkrijgen. - Gebruik het lineaire signaalbereik (hier bijvoorbeeld [FITC] ≤ 0,781 μM) om de helling [y = ax en R2] voor elke voorwaarde te passen.
OPMERKING: Het assortiment kan verschillen voor verschillende machines en standaardoplossingen die worden gebruikt. - Sla de gegevens op voor FITC- en eGFP-kalibratie om relatieve metingen voor het laboratorium te berekenen volgens het voorbeeld in tabel 9. Deel de waarden verkregen in fluorescentie willekeurige eenheden (a.u.) door de curve helling "a" waarde (y = ax) om de GFP-productie te schatten in termen van FITC of eGFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten worden hier getoond na kalibratie van het lysaat voor optimale Mg-glutamaat- en K-glutamaatspiegels afzonderlijk voor lineair en plasmide-DNA (figuur 1). De mg-glutamaat optimale concentratie is vergelijkbaar voor ΔrecB en ΔrecBCD extracten bij 8 mM (figuur 1B). De optimale K-glutamaatconcentratie voor plasmide-DNA is echter 140 mM, terwijl de optimale K-glutamaatconcentratie voor lineair DNA voor hetzelfde extract 20 mM is (figuur 1C). In een vergelijkende analyse van GFP-expressie in extracten van WT- en ΔrecBCD-cellen , werd gezien dat de buffersamenstelling van extracten specifiek moet worden gekalibreerd voor optimale expressie uit lineair en plasmide-DNA dat wordt gebruikt in exonuclease V-verwijderde extracten.
Na kalibratiestappen werden niveaus van GFP-expressies vergeleken van lineair en plasmide-DNA (5 nM) in het WT- en ΔrecBCD-extract (figuur 1D). GFP-expressie van lineair DNA bereikte 102% en 138% van de expressie van plasmide-DNA in extracten van respectievelijk ΔrecB - en ΔrecBCD-stammen . Samen tonen deze resultaten aan dat expressie van lineair DNA, met behulp van een inheemse E. coli σ70-promotor, hetzelfde niveau kan bereiken als dat van plasmide-expressie wanneer het cellysaat wordt bereid uit dergelijke mutanten en de celvrije buffer specifiek is gekalibreerd voor lineair DNA.
Figuur 1: Differentiële bufferoptimalisatie voor lineair en plasmide-DNA in ΔrecB/ΔrecBCD-extracten . (A) Een lineair DNA-amplicon van 1361 bp werd versterkt uit plasmide p70a-deGFP en gebruikt als sjabloon voor genexpressie voor bufferkalibratie. (B) Mg-glutamaatbufferkalibratie met 1 nM van elk DNA-type met verschillende concentraties van 0 tot 20 mM (met K-glutamaat vastgesteld op 80 mM). Vierkante vakjes geven de gekozen concentratiepunten aan. P = plasmide-DNA, L = lineair DNA. (C) Na het selecteren van de optimale Mg-glutamaatconcentratie voor elk lysaat, werd K-glutamaat getitreerd van 20 tot 240 mM. Vierkante vakjes geven de gekozen concentratiepunten aan. P = plasmide-DNA, L = lineair DNA. De gegevens in de heatmaps (B) en (C) zijn afkomstig van één experiment. (D) Na bufferkalibratie werden celvrije reacties uitgevoerd met 5 nM van elk DNA-type. Extract BL21 Rosetta2 ondersteunt geen lineaire DNA-expressie, terwijl differentieel geoptimaliseerde extracten van ΔrecB - en ΔrecBCD-stammen lineaire DNA(groene) expressie vertonen die vergelijkbaar is met plasmide-DNA (blauw) niveaus. De getoonde eindpuntgegevens zijn gemiddelde ± SD voor drie replicaties die op dezelfde dag zijn gedaan en na 8 uur incubatie zijn verzameld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Visuele weergave van het protocol. Workflow voor cellysaatvoorbereiding en lysaatoptimalisatie voor lineair DNA als sjabloon in CFPS-synthese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Lijst van componenten voor de bereiding van vloeibare en vaste 2xYT+P media. De hoeveelheid (in grammen) van elk bestanddeel wordt gespecificeerd voor 1 L media. Schaal proportioneel op als dat nodig is. Media moeten voor gebruik worden geautoclaveerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Lijst van componenten voor de bereiding van buffer S30A+DTT. De hoeveelheid (in grammen) van elk bestanddeel wordt gespecificeerd voor 1 l buffer S30A. Schaal proportioneel op als dat nodig is. De S30A-buffer moet vóór gebruik worden geautoclaveerd en vervolgens worden gekoeld (4 °C). De DTT-buffer moet afzonderlijk worden bereid en gefilterd zoals aangegeven (in een buis van 15 ml) en worden bewaard in -20 °C. Voeg vlak voordat u buffer S30A gebruikt 2 ml DTT (uit voorraad van 1 M) toe aan 1 L S30A-buffer. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Lijst van componenten voor de bereiding van energieoplossingen. De hoeveelheid (in grammen) of het volume van elk bestanddeel wordt gespecificeerd (in kolom G) voor de bereiding van een bepaald volume (in kolom H) van stamoplossingen voor de aangegeven concentratie (in kolom F). De pH van elk onderdeel moet indien nodig worden aangepast, zoals aangegeven (in kolom I en J). 14x voorraad energieoplossingen wordt bereid door het vermelde volume van elke component (in kolom K) in de aangegeven volgorde te mengen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Lijst van componenten voor de bereiding van aminozuur stockoplossing. Voor de bereiding van de 4x aminozuur stockoplossing moeten alle aminozuren in de vermelde volgorde worden gemengd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 5. Lijst van componenten voor de bereiding van lysaatkalibratieoplossingen. De hoeveelheid (in grammen) mg-glutamaat en K-glutamaat stamoplossingen wordt gespecificeerd om 50 ml van de aangegeven concentratie van elke buffer te bereiden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 6: Lijst van bacteriestammen die in dit protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 7: Lijst van primers die in dit protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 8: Plasmide dat in dit protocol wordt gebruikt voor lysaatkalibratie en als sjabloon voor lineaire DNA-amplificatie door PCR. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 9: FITC- en eGFP-conversie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier laten we zien dat cellysaat bereid uit E. coli BL21 Rosetta2 met een genomische knock-out voor recB - of recBCD-operon een hoge eiwitexpressie ondersteunt van lineaire DNA-sjablonen. Dit protocol werkt een stapsgewijze lysaatkalibratieprocedure uit die specifiek is voor lineaire DNA-sjablonen (figuur 2), wat een kritieke stap is die leidt tot de hoge expressie van σ70-promotors in lineair DNA, die bijna-plasmideniveaus bereiken voor equimolaire DNA-concentraties. Dit protocol benadrukt het belang van bufferkalibratie op basis van het type DNA (lineair of plasmide) dat in de uiteindelijke toepassing moet worden gebruikt.
Het protocol kan helpen plasmideklonen te voorkomen, wat aanzienlijke winst in tijd en kosten oplevert. Lineaire DNA-fragmenten kunnen worden gesynthetiseerd door commerciële aanbieders en/of versterkt door PCR in het laboratorium. Hetzelfde proces met plasmide-DNA zou minstens 1 week langer duren, rekening houdend met klonen, sequentieverificatie en DNA-voorbereidingsstappen10. Het wordt aanbevolen om grote volumes van het celextract en lineaire DNA-sjablonen voor te bereiden om batch-to-batch variabiliteit tussen experimenten te minimaliseren14,15.
Deze methode is robuust gebleken en wordt in laboratoria gebruikt10. De resultaten van deze extracten zijn consistent in biologische replicaties, verschillende extractbatches en in verschillende stamachtergronden10. De robuustheid van het protocol is ook getest op verschillende experimentele parameters: cellysemethoden, temperaturen, DNA-sjablonen en verschillende DNA-concentraties. De methode is al gebruikt voor snelle screening en karakterisering van genetische constructen voor twee relevante toepassingen: toehold switch library characterization en enzyme activity screening10.
Hoewel in deze studie hoge expressieniveaus werden verkregen uit lineair DNA in ΔrecB/ΔrecBCD-extracten van de zeer productieve ouderlijke stam E. coli BL21 Rosetta2, zou de methodologie genoomtechnologie vereisen voor een nieuwe stam van belang. Daarentegen is suppletie met beschermende middelen voor lineair DNA, zoals GamS5 of Chi DNA6, gemakkelijker aan te vragen voor een nieuwe stam, maar duurder en tijdrovender.
Het protocol dat hier wordt verstrekt, zal het gebruik van lineaire DNA-sjablonen in celvrije systemen vergemakkelijken en de ontwerp-bouw-testcycli voor de synthetische biologiegemeenschap versnellen. Eenvoudigere celvrije expressie van lineaire DNA-sjablonen in ΔrecB/ΔrecBCD-extracten kan worden ingezet voor de productie van kleine interessante moleculen, biosimilars en andere on-demand point-of-care-toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen
Acknowledgments
ACB en JLF erkennen financieringssteun door de ANR SINAPUV-subsidie (ANR-17-CE07-0046). JLF en JB erkennen financieringssteun door de ANR SynBioDiag-subsidie (ANR-18-CE33-0015). MSA en JLF erkennen financieringssteun door de ANR iCFree-subsidie (ANR-20-BiopNSE). JB erkent de steun van de ERC die "COMPUCELL" (subsidienummer 657579) start. Het Centre de Biochimie Structurale erkent de steun van de Franse Infrastructuur voor Geïntegreerde Structurele Biologie (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK erkent de financiële steun van inrae's MICA-afdeling, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) regio DIM-RFSI, en ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Dit werk werd ondersteund door financiering via de European Research Council Consolidator Award (865973 aan het CLB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5?-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
- Schinn, S. -M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
- Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
- Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
- Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
