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Bioengineering

रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करके एक्सोन्यूक्लिज़-कमी सेलुलर अर्क से सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64236
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 4, 1
1INRAe, AgroParisTech, Micalis Institute, Université Paris-Saclay, 2Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI), 3Medical Faculty, University of Würzburg, 4Centre de Biochimie Structurale, INSERM U1054, CNRS UMR 5048, University of Montpellier
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत एस्चेरिचिया कोलाई बीएल 21 रोसेटा 2 के एक्सोन्यूक्लिज़ वी नॉकआउट उपभेदों से सेल अर्क की तैयारी और बफर अंशांकन के लिए एक प्रोटोकॉल है। यह रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करके सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रणालियों में अभिव्यक्ति के लिए एक तेज़, आसान और प्रत्यक्ष दृष्टिकोण है।

Abstract

सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) हाल ही में अपने कई फायदों के कारण सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र में बहुत लोकप्रिय हो गया है। सीएफपीएस के लिए रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करने से तकनीक को अपनी पूरी क्षमता तक पहुंचने में मदद मिलेगी, क्लोनिंग, परिवर्तन और प्लास्मिड निष्कर्षण के चरणों को समाप्त करके प्रयोगात्मक समय कम हो जाएगा। रैखिक डीएनए को पीसीआर द्वारा टेम्पलेट की उच्च सांद्रता प्राप्त करने के लिए तेजी से और आसानी से प्रवर्धित किया जा सकता है, जिससे विवो अभिव्यक्ति विषाक्तता में क्षमता से बचा जा सकता है। हालांकि, रैखिक डीएनए टेम्प्लेट तेजी से एक्सोन्यूक्लिज़ द्वारा अवक्रमित होते हैं जो स्वाभाविक रूप से सेल अर्क में मौजूद होते हैं। इस समस्या से निपटने के लिए कई रणनीतियों का प्रस्ताव किया गया है, जैसे कि न्यूक्लियस इनहिबिटर जोड़ना या सुरक्षा के लिए रैखिक डीएनए छोरों का रासायनिक संशोधन। इन सभी रणनीतियों में अतिरिक्त समय और संसाधन खर्च होते हैं और अभी तक प्रोटीन अभिव्यक्ति के निकट-प्लास्मिड स्तर प्राप्त नहीं हुए हैं। सीएफपीएस के लिए रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है। एक्सोन्यूक्लिज़-कमी नॉकआउट कोशिकाओं से सेल अर्क का उपयोग करके, रैखिक डीएनए टेम्प्लेट किसी भी अंत-संशोधन की आवश्यकता के बिना बरकरार रहते हैं। हम विशेष रूप से रैखिक डीएनए के लिए एमजी-ग्लूटामेट (एमजी-ग्लू) और के-ग्लूटामेट (के-ग्लू) के लिए सोनिकेशन लाइसिस और बफर अंशांकन द्वारा एस्चेरिचिया कोलाई बीएल 21 रोसेट 2 आरईसीबीसीडी स्ट्रेन से सेल लाइसेट की तैयारी चरणों को प्रस्तुत करते हैं। यह विधि ई कोलाई सीएफपीएस में प्लास्मिड डीएनए से तुलनीय प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर प्राप्त करने में सक्षम है।

Introduction

सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) सिस्टम का उपयोग तेजी से बायोसेंसर इंजीनियरिंग,विकेंद्रीकृत विनिर्माण और आनुवंशिक सर्किट के प्रोटोटाइप के लिए एक तेज, सरल और कुशल विधि के रूप में किया जा रहा है। उनकी महान क्षमता के कारण, सीएफपीएस सिस्टम का उपयोग सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र में नियमित रूप से किया जाता है। हालांकि, अब तक सीएफपीएस सिस्टम परिपत्र प्लास्मिड पर भरोसा करते हैं जो तकनीक को अपनी पूरी क्षमता तक पहुंचने से सीमित कर सकते हैं। प्लास्मिड डीएनए तैयार करना क्लोनिंग और बड़ी मात्रा में डीएनए अलगाव के दौरान कई समय लेने वाले चरणों पर निर्भर करता है। दूसरी ओर, प्लास्मिड, या एक संश्लेषित डीएनए टेम्पलेट से पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग कुछ घंटों के भीतर सीएफपीएस टेम्पलेट्स तैयार करनेके लिए किया जा सकता है। इसलिए, रैखिक डीएनए का अनुप्रयोग सीएफपीएस के लिए एक आशाजनक समाधान प्रदान करता है। हालांकि, सेलुलर अर्क4 में स्वाभाविक रूप से मौजूद एक्सोन्यूक्लिज़ द्वारा रैखिक डीएनए तेजी से अवक्रमित होता है। ऐसे समाधान हैं जो इस समस्या को संबोधित करते हैं, जैसे कि सुरक्षात्मक एजेंटों के रूप में ची साइट6 युक्त λ-phage GamS प्रोटीन5 या डीएनए का उपयोग करना, या सीधे इसके सिरों 2,7,8,9 के रासायनिक संशोधन द्वारा रैखिक डीएनए की रक्षा करना। इन सभी विधियों को सेल निकालने के लिए पूरक की आवश्यकता होती है, जो महंगा और समय लेने वाला होता है। यह लंबे समय से ज्ञात है कि एक्सोन्यूक्लिज़ वी कॉम्प्लेक्स (आरईसीबीडी) सेल लाइसेट4 में रैखिक डीएनए को नीचा दिखाता है। हाल ही में, हमने दिखाया कि रैखिक डीएनए को एक्सोन्यूक्लिज़ जीन (आरईसीबीडी) 10 के लिए नॉक की गई कोशिकाओं से लाइसेट में बेहतर संरक्षित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, सोनिकेशन लाइसिस द्वारा ई कोलाई बीएल 21 रोसेटा 2 से सेल-मुक्त लाइसेट की तैयारी के लिए चरणों का विस्तार से वर्णन किया गया है। सोनिकेशन लाइसिस एक सामान्य और सस्ती तकनीक है जो कई प्रयोगशालाओं11,12 द्वारा नियोजित है। इस तनाव से उत्पादित अर्क को रैखिक डीएनए टेम्प्लेट से अभिव्यक्ति का समर्थन करने के लिए किसी भी अतिरिक्त घटक या डीएनए टेम्पलेट संशोधन के अतिरिक्त की आवश्यकता नहीं है। विधि विशेष रूप से देशी ई कोलाई प्रमोटरों से रैखिक डीएनए अभिव्यक्ति के लिए सेल अर्क के लिए बफर अनुकूलन के आवश्यक चरण पर निर्भर करती है। यह दिखाया गया है कि रैखिक डीएनए अभिव्यक्ति के लिए यह विशिष्ट बफर अनुकूलन देशी 70 प्रमोटरों के लिए जीएएमएस प्रोटीन या ची डीएनए पूरकता के बिना उच्च प्रोटीन उत्पादन प्राप्त करने की कुंजी है, यहां तक कि पीसीआर उत्पादोंके शुद्धिकरण से भी बचता है। रैखिक डीएनए अभिव्यक्ति के लिए एमजी-ग्लू की इष्टतम एकाग्रता प्लास्मिड डीएनए के समान पाई गई। हालांकि, के-ग्लू की इष्टतम एकाग्रता ने रैखिक और प्लास्मिड डीएनए के बीच पर्याप्त अंतर दिखाया, संभवतः प्रतिलेखन से संबंधित तंत्र10 के कारण। इस विधि का उपयोग करके व्यक्त प्रोटीन की कार्यक्षमता को कई अनुप्रयोगों के लिए प्रदर्शित किया गया है, जैसे कि टोहोल्ड स्विच की तेजी से स्क्रीनिंग और एंजाइम वेरिएंट10 का गतिविधि मूल्यांकन।

यह प्रोटोकॉल ई कोलाई सेल-मुक्त प्रणालियों में रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करने के लिए एक सरल, कुशल और लागत प्रभावी समाधान प्रदान करता है, बस टेम्पलेट के रूप में रैखिक डीएनए के लिए उत्परिवर्ती 1रिक बीसीडी सेल अर्क और विशिष्ट अंशांकन का उपयोग करके।

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Protocol

1. मीडिया और बफर तैयारी

  1. 2xYT + P माध्यम (ठोस और तरल) की तैयारी
    1. तालिका 1 में वर्णित तरल और ठोस मीडिया तैयार करें, और फिर ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए क्लोरैम्फेनिकॉल (10 μg / mL) युक्त एक 2xYT + P agar प्लेट की आवश्यकता होती है। तरल मीडिया की मात्रा आवश्यक लाइसेट की मात्रा के समानुपाती है। यहां, तरल 2xYT + P मीडिया के 5 L की प्रारंभिक मात्रा का उपयोग किया जाता है। हालांकि, मात्रा को आवश्यकतानुसार समायोजित किया जा सकता है, यह जानते हुए कि सेल संस्कृति के 1 एल के परिणामस्वरूप अंतिम सेल लाइसेट का 2 से 3 एमएल होता है।
  2. क्लोरैम्फेनिकॉल की तैयारी (34 मिलीग्राम /
    1. क्लोरैम्फेनिकॉल के 0.34 ग्राम वजन करें, 10 एमएल में इथेनॉल जोड़ें, और मिश्रण द्वारा घुल जाएं। एलिकोट 1 एमएल प्रत्येक को कई ट्यूबों में विभाजित करता है, और बाद में उपयोग करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करता है।
  3. S30A बफर की तैयारी
    1. तालिका 2 के अनुसार एस 30 ए बफर तैयार करें, इस बफर के 2 एल का लक्ष्य रखें।
      नोट: एक बार फिर, इस बफर की मात्रा आवश्यक लाइसेट की मात्रा के आनुपातिक है।
    2. ऑटोक्लेविंग से पहले, ग्लेशियल एसिटिक एसिड का उपयोग करके बफर के पीएच को 7.7 तक समायोजित करें।
    3. बफर को ऑटोक्लेव करें।
    4. ऑटोक्लेविंग के बाद इस बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    5. उपयोग से पहले, 2 mM की अंतिम सांद्रता तक पहुंचने के लिए S30A बफर में DTT (0.22 μm झिल्ली फ़िल्टर द्वारा फ़िल्टर किया गया) जोड़ें (स्टॉक 1 M DTT से S30A बफर के 1 L के 2 एमएल) तक पहुंचने के लिए।
      नोट: एक बार फिर, इस बफर की मात्रा आवश्यक लाइसेट की मात्रा के आनुपातिक है।
  4. ऊर्जा समाधान की तैयारी
    नोट: यह ऊर्जा समाधान सन एट अल पेपर 13 (14x स्टॉक एकाग्रता) पर आधारित है। तालिका 3 ऊर्जा समाधान स्टॉक की तैयारी के लिए आवश्यक घटकों को पुन: प्रस्तुत करती है, जिसमें इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी रसायनों के लिए कैटलॉग नंबर हैं।
    1. तालिका 3 के अनुसार स्टॉक समाधान तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    2. संकेतित घटकों के लिए अनुरोध के अनुसार पीएच को कैलिब्रेट करें, या तो ट्राइस बफर 2 एम (बाँझ पानी की 250 एमएल मात्रा में ट्राइस बेस का 60.57 ग्राम) या केओएच 15% (बाँझ पानी की 100 एमएल मात्रा में 15 ग्राम कोह) जैसा कि तालिका 3 में दर्शाया गया है।
    3. 15 एमएल ट्यूब में, तालिका 3 में दर्शाए गए क्रम में प्रत्येक घटक का आयतन जोड़ें।
    4. ऊर्जा समाधान, 150 μL प्रति ट्यूब।
    5. सूखी बर्फ पर फ्लैश फ्रीज एलिकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. अमीनो एसिड (एए) समाधान की तैयारी
    नोट: एमिनो एसिड समाधान आरटीएस एमिनो एसिड सैंपलर किट द्वारा तैयार किया जाता है। 20 अमीनो एसिड में से प्रत्येक को इस किट में 168 एमएम पर 1.5 एमएल मात्रा के रूप में प्रदान किया जाता है, ल्यूसीन को छोड़कर जो 140 एमएम पर है। यहां, तैयार स्टॉक समाधान आवश्यक कामकाजी समाधान के बजाय 4x केंद्रित है। अमीनो एसिड समाधान की अंतिम एकाग्रता सभी अमीनो एसिड के लिए 6 एमएम है, ल्यूसीन को छोड़कर जो 5 एमएम पर है।
    1. 20 अमीनो एसिड ट्यूबों को भंवर द्वारा पिघलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि वे पूरी तरह से भंग न हो जाएं।
      नोट: Cys पूरी तरह से भंग नहीं हो सकता है।
    2. एक 50 एमएल ट्यूब में, तालिका 4 में दर्शाए गए क्रम में 12 एमएल बाँझ पानी और 1.5 एमएल एमिनो एसिड जोड़ें।
    3. जब तक समाधान काफी स्पष्ट नहीं होता है, तब तक भंवर, यदि आवश्यक हो तो 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट होता है।
      नोट: Cys पूरी तरह से भंग नहीं हो सकता है।
    4. बर्फ पर प्रति ट्यूब अमीनो एसिड समाधान का एलिकोट 500 μL।
    5. सूखी बर्फ पर एलिकोट को फ्लैश-फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. बफर अंशांकन के लिए समाधान तैयार करना
    1. तालिका 5 में दर्शाए अनुसार Mg-glu (100 mM) और K-glu (3 M) के लिए स्टॉक समाधान तैयार करें। अंशांकन चरणों के लिए अनुपूरक फाइल 1 में दर्शाए अनुसार एमजी-ग्लू (0 से 20 एमएम) और के-ग्लू (20 से 300 एमएम) के लिए इन स्टॉक से सीरियल डाइल्यूशन (1 एमएल वॉल्यूम में) बनाएं।
      नोट: ये स्टॉक सांद्रता अंशांकन चरण के लिए हैं और अंतिम प्रयोग स्थापित करते समय इसे बदलने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल के लिए परीक्षण किए गए स्टॉक की उच्चतम सांद्रता क्रमशः एमजी-ग्लू और के-ग्लू के लिए 1 एम और 4.5 एम है।
  7. PEG8000 समाधान स्टॉक की तैयारी
    1. 40% पीईजी 8000 समाधान के 50 एमएल (बाँझ पानी की 50 एमएल मात्रा में पीईजी 8000 का 20 ग्राम) तैयार करें।

2. सेल संस्कृति और लाइसेट तैयारी (4 दिन प्रयोग)

  1. दिन 1
    1. स्ट्रीक स्ट्रेन BL21 Rosetta2 ErcBCD (तालिका 6) -80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल स्टॉक से 2xYT + P एगर प्लेट पर जिसमें 10 μg / mL chloramphenicol होता है। वैकल्पिक रूप से, BL21 Rosetta2 ΔrecB (तालिका 6) का भी उपयोग किया जा सकताहै।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. दिन 2
    1. उपरोक्त एगर प्लेट से एक एकल कॉलोनी को 10 मिलीलीटर 2xYT + P में टीका लगाएं, जो 10 μg / mL chloramphenicol के साथ पूरक है।
    2. 200 आरपीएम झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  3. तीसरा दिन
    1. रात भर की संस्कृति को 100 बार ताजा 2xYT + P मीडिया के 4 L में 10 μg / mL chloramphenicol युक्त 100 गुना पतला करके एक उपसंस्कृति बनाएं।
      नोट: उदाहरण के लिए, रात भर की संस्कृति के 40 एमएल को 3960 एमएल ताजा मीडिया में जोड़ा जाता है। कमजोर पड़ने के बाद, 4 एल मीडिया को 4 फ्लास्क (5 एल वॉल्यूम) में विभाजित किया जाता है जैसे कि प्रत्येक फ्लास्क में 1 एल होता है।
    2. 1.5-2.0 के ओडी 600 तक पहुंचने के लिए लगभग 3 से 4 घंटे की वृद्धि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस,200 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें। OD600 > 0.8 मापने पर संस्कृति को 4x से पतला करें।
      नोट: सटीक इनक्यूबेशन समय तनाव, प्रारंभिक इनोकुलम, लैबवेयर और उपयोग किए गए उपकरणों के अनुसार भिन्न हो सकता है। 11 रोसेटा 2 माता-पिता (पूरक चित्र 1) के बराबर वृद्धि दर है।
    3. संस्कृति को बर्फ पर रखो।
    4. कोशिकाओं को 5,000 x g पर 12 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं, और फिर डिकैंटिंग द्वारा सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    5. 800 एमएल ठंडे एस 30 ए + डीटीटी में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।
      नोट: S30A + DTT की मात्रा मूल सेल संस्कृति मात्रा से 5x कम है। उदाहरण के लिए, सेल कल्चर के 1 एल की शुरुआती मात्रा के लिए, एस 30 ए + डीटीटी के 200 एमएल में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। यह भी सिफारिश की जाती है कि इस चरण को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडे कमरे में किया जाए, साथ ही सभी सामग्रियों को बर्फ पर रखा जाए।
    6. कोशिकाओं को 5,000 x g पर 12 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं, और फिर डिकैंटिंग द्वारा सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    7. चरण 2.3.5 और 2.3.6 दोहराएँ।
    8. 160 एमएल ठंडा एस 30 ए + डीटीटी में सेल छर्रों को पुन: निलंबित करें।
      नोट: इस बार S30A + DTT की मात्रा मूल सेल संस्कृति मात्रा से 25 गुना कम है। उदाहरण के लिए, सेल कल्चर के 1 एल की शुरुआती मात्रा के लिए, एस 30 ए + डीटीटी के 40 एमएल में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। फिर, इस चरण को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडे कमरे में करने की सिफारिश की जाती है, साथ ही साथ बर्फ पर सामग्री रखने के लिए भी।
    9. कोशिकाओं को ठंडा और पूर्व-वजन वाले 50 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    10. कोशिकाओं को 2,000 x g पर 8 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं, और फिर डिकैंटिंग द्वारा सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    11. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 2,000 x g पर घुमाएं, और फिर पिपेट का उपयोग करके शेष सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    12. सेल पेलेट के वजन की गणना करने के लिए ट्यूब के वजन को फिर से मापें।
    13. सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. चौथा दिन
    1. सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस से लें और उन्हें बर्फ पर 1-2 घंटे के लिए पिघलाएं।
    2. सेल छर्रों को छर्रों के वजन के प्रति ग्राम एस 30 ए + डीटीटी बफर के 0.9 एमएल में पुन: निलंबित किया गया। पिपेट धीरे-धीरे कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए, जितना संभव हो उतना शीर्ष झाग से बचें, यदि कोई हो।
    3. पुन: निलंबित कोशिकाओं के 1 एमएल एलिकोट को 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में रखें, और उन्हें बर्फ या 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-ठंडा ठंडा ब्लॉक पर रखें (धातु ब्लॉक का उपयोग करना बेहतर है)।
      नोट: यदि अंतिम एलिकोट 1 एमएल से बहुत कम है, तो उप-इष्टतम मात्रा को कम करने की तुलना में इसे छोड़ना बेहतर है। सोनिकेशन के लिए इष्टतम मात्रा (1 एमएल) इस सेटअप (ट्यूब, सोनिकेटर और जांच) के लिए निर्धारित की गई थी, और एक अलग के लिए भिन्न हो सकती है।
    4. प्रत्येक ट्यूब को एक सोनिकेटर (3 मिमी जांच, आवृत्ति 20 kHz) में रखें, जिसमें तीन चक्रों (30 s सोनिकेशन, 1 मिनट विराम) के लिए 20% आयाम का सेटअप होता है।
      नोट: तीन चक्रों में वितरित कुल ऊर्जा ~ 266 जूल (~ 80-110 जूल प्रति चक्र) थी। इस चरण के दौरान, ट्यूबों को ठंडे ब्लॉक पर रखें जो बर्फ से घिरा हुआ है। प्रोब के अधिक गर्म होने से बचने के लिए दो ठंडे ब्लॉकों के बीच वैकल्पिक (स्टैंडबाय कोल्ड ब्लॉक को बर्फ पर ठंडा भी रखा जाता है)। सोनिकेशन से एक दिन पहले दोनों कोल्ड ब्लॉक को फ्रिज में पहले से ठंडा कर दिया गया था।
    5. लाइसेट को 12,000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
    6. एक पिपेट के साथ सुपरनैटेंट (सेल लाइसेट) इकट्ठा करें और 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. सेल लाइसेट को 80 मिनट के लिए 200 आरपीएम आंदोलन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    8. लाइसेट को 12,000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
    9. सभी ट्यूबों को बर्फ पर रखते हुए, पूर्व-ठंडा 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में सुपरनैटेंट और एलिकोट 30 μL एकत्र करें।
    10. सूखी बर्फ पर लाइसेट एलिकोट को फ्लैश-फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. रैखिक डीएनए के लिए सेल-मुक्त बफर अंशांकन

नोट: सेल-मुक्त बफर को इष्टतम एमजी-ग्लू और के-ग्लू सांद्रता के लिए कैलिब्रेट किया गया था जैसा कि सन एट अल .13 में वर्णित है। अंशांकन चरणों के लिए पूरक फ़ाइल 1 की आवश्यकता है। प्रत्येक प्रतिक्रिया को 10.5 μL की अंतिम मात्रा पर सेट किया गया था। अर्क को रैखिक के 1 एनएम (नीचे अनुभाग 4 देखें) या प्लास्मिड डीएनए का उपयोग करके कैलिब्रेट किया गया था। प्रयोग उसी दिन किए जा सकते हैं जिस दिन बफर तैयार किए जाते हैं, या तैयार बफर को किसी अन्य दिन प्रयोग करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया जा सकता है। सभी अंशांकन चरणों के लिए, प्रत्येक घटक को 384-वेल प्लेट में मिश्रण और पाइपिंग से पहले बर्फ पर पिघलाया गया था।

  1. एक्सेल फाइल पूरक फ़ाइल 1 में 'बफर तैयारी' टैब के अनुसार एक मास्टर मिक्स तैयार करें, जिसमें शामिल हैं: (ए) सेल एक्सट्रैक्ट (कुल प्रतिक्रिया मात्रा का 33%), (बी) रिपोर्टर डीएनए (रैखिक और / या प्लास्मिड डीएनए के रूप में) 1 एनएम की अंतिम एकाग्रता के लिए, (सी) सेल-फ्री बफर (पीईजी 8000, एए समाधान, और ऊर्जा समाधान), और (डी) के-ग्लू 80 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए।
  2. 10.5 μL की प्रतिक्रिया मात्रा के लिए, Mg-glu 10x केंद्रित स्टॉक की विभिन्न सांद्रता के 1.05 μL (10% कुल प्रतिक्रिया) लें (अंतिम एकाग्रता सीमा: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, और 20 mM) और मास्टर मिक्स के 9.45 μL (90% कुल प्रतिक्रिया) जोड़ें। धीरे से मिलाएं।
    नोट: कमजोर पड़ने को तैयार करने और मल्टीचैनल पिपेट के साथ मिश्रण करने के लिए पीसीआर आठ-स्ट्रिप ट्यूबों का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो एमजी-ग्लू सांद्रता की एक अलग श्रृंखला का उपयोग किया जा सकता है।
  3. पिपेट 10 μL उपरोक्त प्रतिक्रियाओं को 384-अच्छी तरह से वर्ग-तल माइक्रोप्लेट में बदल देता है, इसे चिपकने वाली प्लेट सील का उपयोग करके कवर करता है, और जीन अभिव्यक्ति को प्रतिदीप्ति आउटपुट के रूप में मापता है। प्लेट रीडर के साथ प्रतिदीप्ति डेटा रिकॉर्ड करें (उदा. : 485 एनएम; ईएम: 30 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के इनक्यूबेशन के लिए नियमित अंतराल (जैसे, 5 मिनट) पर 528 एनएम) 307 सीपीएम पर निरंतर कक्षीय झटकों के साथ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो डेटा अधिग्रहण शुरू करने से पहले 384-वेल माइक्रोप्लेट (<2,500 x g, 1 मिनट, कमरे का तापमान) को स्पिन करें। विभिन्न बफर रचनाओं में जीएफपी अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए अंत-बिंदु माप का उपयोग किया गया था। प्रतिदीप्ति मानों को प्लॉटिंग के लिए मानकीकृत इकाइयों में परिवर्तित किया जा सकता है (नीचे देखें)।
  4. एमजी-ग्लू एकाग्रता की पहचान करें जिसके परिणामस्वरूप अंत-बिंदु पर उच्चतम प्रतिदीप्ति मूल्य होता है।
    नोट: यदि प्राप्त इष्टतम Mg-glu एकाग्रता के बारे में अनिश्चित है, तो अधिक विविध एकाग्रता सीमाओं के साथ चरण 3.2 दोहराएं।
  5. अनुकूलित Mg-glu सांद्रता के साथ, चरण 3.2 में दर्शाए गए समान वॉल्यूम का उपयोग करते हुए सांद्रता (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 और 240 mM) की एक श्रृंखला के लिए K-glu अंशांकन पर आगे बढ़ें। प्रयोग चलाएं और परीक्षण किए गए के-ग्लू सांद्रता में से उच्चतम प्रतिदीप्ति मूल्य की पहचान करें। यह इस लाइसेट के लिए एमजी-ग्लू और के-ग्लू के लिए इष्टतम बफर संरचना को इंगित करता है।
    नोट: यदि प्राप्त इष्टतम के-ग्लू एकाग्रता के बारे में अनिश्चित है, तो अधिक विविध एकाग्रता सीमाओं के साथ चरण को दोहराएं।
  6. एक बार एमजी-ग्लू और के-ग्लू मान स्थापित हो जाने के बाद, प्राप्त बैच वॉल्यूम के अनुसार अनुकूलित बफर संरचना के स्टॉक ट्यूब तैयार करें। आवश्यक बफर ट्यूबों की संख्या की गणना करने के लिए पूरक फ़ाइल 1 में 'बफर तैयारी' टैब का उपयोग करें, एलिकोट 38 μL प्रति ट्यूब, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. रैखिक डीएनए तैयारी

नोट: लाइसेट अंशांकन के लिए, प्लास्मिड पी 70 ए-डीजीएफपी का उपयोग किया जाता है। इस प्लास्मिड को प्लास्मिड मिनीप्रेप किट का उपयोग करके मिनीप्रेप के लिए ई कोलाई केएल 740 सीएल 857 + (तालिका 6) में बनाए रखा गया था, या प्लास्मिड मैक्सिप्रेप किट का उपयोग करके मैक्सिप्रेप। सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं में अभिव्यक्ति टेम्पलेट्स के रूप में उपयोग किए जाने वाले रैखिक डीएनए टुकड़े तालिका 7 और तालिका 8 में सूचीबद्ध प्राइमरों और टेम्पलेट्स का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धित किए गए थे।

  1. पीसीआर तालिका 7 में सूचीबद्ध ऑलिगो प्राइमरों के साथ डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके प्लास्मिड पी 70 ए-डीजीएफपी से बढ़ता है। थर्मोसाइक्लर प्रोग्राम का उपयोग करते हुए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, पीसीआर प्रतिक्रियाओं को 50 μL वॉल्यूम में सेट करें: [2 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 40 चक्र x (30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस → 30 सेकंड के लिए 66 डिग्री सेल्सियस → 60 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस); 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; ∞ के लिए 4 डिग्री सेल्सियस]।
  2. पीसीआर प्रतिक्रियाओं में टेम्पलेट डीएनए को प्रति 50 μL पीसीआर प्रतिक्रिया में Dpni प्रतिबंध एंजाइम के 1 μL जोड़कर पचाएं और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, पीसीआर और डीएनए क्लीनअप किट का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रिया को शुद्ध करें और न्यूक्लियस-मुक्त पानी में एल्यूट करें।
  3. उपयोग करने से पहले 1% अगारोस जेल (1x TAE) पर पीसीआर उत्पादों को सत्यापित करें।
  4. नैनोड्रॉप (एनडी -1,000) का उपयोग करके शुद्ध पीसीआर उत्पादों (या प्लास्मिड प्रेप्स) की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: यदि डीएनए पोलीमरेज़ / बफर का उपयोग करना जो डाउनस्ट्रीम सेल-मुक्त प्रतिक्रिया के साथ सीधे संगत है, तो शुद्धिकरण चरण (चरण 2) को पूरी तरह से छोड़ दिया जा सकता है और इसके बजाय डीएनए-बाइंडिंग डाई के साथ फ्लोरोमेट्रिक परख द्वारा अपरिष्कृत डीएनए की एकाग्रता को मापा जा सकता है (देखें बतिस्ता एट अल.10)।

5. प्रायोगिक निष्पादन

नोट: तैयार किए गए प्रत्येक लाइसेट बैच के लिए बफर स्टॉक को कैलिब्रेट करने के लिए पूरक फ़ाइल 1 का उपयोग करने के अलावा, बाद के सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं को सेट करने के लिए फ़ाइल में 'प्रतिक्रिया तैयारी' टैब का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। पहले की तरह, प्रतिक्रियाओं की मात्रा प्रति प्रतिक्रिया 10.5 μL पर सेट की जाती है, जिसमें से केवल 10 μL को अंततः डेटा अधिग्रहण के लिए 384-वेल प्लेट में डाला जाता है। यहां, सेल-मुक्त अभिव्यक्ति के लिए प्रत्येक टेम्पलेट के 5 एनएम का उपयोग किया जाता है। प्रतिक्रियाओं को हल करते समय सुसंगत होना महत्वपूर्ण है- एक ही पिपेट और युक्तियों के प्रकार का उपयोग करें। कुएं में किसी भी बुलबुले या कुएं की दीवारों से चिपकने वाले किसी भी तरल से बचने के लिए सावधानी से वितरित करें। यदि आवश्यक हो, तो प्लेट को नीचे घुमाएं (<2,500 x g, 1 मिनट, कमरे का तापमान)।

  1. नमूना विवरण ों को सम्मिलित करके पिपेट के वॉल्यूम की गणना करें और पूरक फ़ाइल 1 के 'प्रतिक्रिया तैयारी' टैब में प्रति नमूना आवश्यक प्रतिकृतियां।
    नोट: यदि 10.5 μL के अलावा एक प्रतिक्रिया मात्रा की आवश्यकता है, तो इसे पूरक फ़ाइल 1 में भी इनपुट किया जा सकता है। फ़ाइल पहले से अनुकूलित बफर स्टॉक की ट्यूबों की संख्या और बर्फ पर पिघलने के लिए सेल एक्सट्रैक्ट ट्यूबों की गणना करेगी।
  2. इष्टतम मास्टर मिक्स तैयारी (रैखिक और प्लास्मिड डीएनए के लिए अलग से) के लिए 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब लेबल करें, बफर और लाइसेट के सही वॉल्यूम जोड़ें, और धीरे से मिलाएं।
    नोट: उनके बफर में इष्टतम के-ग्लू सांद्रता में अंतर के कारण, 'प्रतिक्रिया तैयारी' टैब की प्रतियों को रैखिक और प्लास्मिड डीएनए के लिए अलग से उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. पिपेट पहले डीएनए नमूने, उसके बाद न्यूक्लियस-मुक्त पानी, और अंत में चरण 5.2 से इष्टतम मास्टर मिक्स (एमएम) का उपयोग करें। प्लेट रीडर में जोड़ने से ठीक पहले पिपेट के साथ सेल-मुक्त प्रतिक्रिया को धीरे से मिलाएं और किसी भी बुलबुले से बचें।
    नोट: एक अतिरिक्त प्रतिकृति के लिए प्रतिक्रिया मात्रा को मिलाने के लिए पीसीआर आठ-स्ट्रिप ट्यूब का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, यदि तकनीकी तीन प्रतियों का इरादा है, तो चार प्रतिक्रियाओं के लिए एक मिश्रण तैयार करें और प्लेट में नमूने जोड़ते समय पाइपिंग त्रुटियों को कम करने के लिए ट्यूब में एक मृत मात्रा छोड़ दें।
  4. प्लेट रीडर में प्रतिक्रियाओं को सेट करें (एक्स 485 एनएम; ईएम 528 एनएम)। काइनेटिक रन ने 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 8 घंटे के लिए नियमित अंतराल (जैसे, 5 मिनट) पर फ्लोरेसेंस डेटा दर्ज किया, जिसमें 307 सीपीएम पर निरंतर कक्षीय झटके थे।
    नोट: अंत-बिंदु माप को 8 घंटे के समय-बिंदु के रूप में रिपोर्ट किया गया था। एकत्र किए गए प्रतिदीप्ति मान मनमानी इकाइयों (एयू) में हैं, लेकिन उन्हें प्लॉटिंग के लिए मानकीकृत इकाइयों में परिवर्तित किया जा सकता है (नीचे देखें)।

6. एफआईटीसी और जीएफपी सापेक्ष परिमाणीकरण

नोट: जीएफपी अभिव्यक्ति को प्लेट रीडर द्वारा मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति इकाइयों (एयू) में निर्यात किया जाता है। हालांकि, विभिन्न सेटिंग्स (बैच, उपकरण, उपयोगकर्ता और प्रयोगशालाओं) के बीच प्रतिदीप्ति मूल्यों की तुलना करने के लिए माप की मानकीकृत इकाइयों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। एनआईएसटी-एफआईटीसी और पुनः संयोजक ईजीएफपी के मानक वक्रों का उपयोग करते हुए, फ्लोरेसेंस मानों (ए.यू.) को एफआईटीसी-समकक्ष और ईजीएफपी (μM) मानों में परिवर्तित करने के लिए यहां विस्तृत चरण प्रस्तुत किए गए हैं। एनआईएसटी-एफआईटीसी स्टॉक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर पुनः संयोजक ईजीएफपी स्टोर करें। सुनिश्चित करें कि स्टॉक समाधान और सीरियल कमजोर पड़ने प्रकाश से सुरक्षित हैं। डिलीवरी पर, कई फ्रीज-पिघलाव चक्रों से बचने के लिए पुनः संयोजक ईजीएफपी को छोटी मात्रा में एलिकोट करने की सिफारिश की जाती है।

  1. 100 mM सोडियम बोरेट, pH 9.5 का घोल तैयार करें, और कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. मानक वक्र के लिए 12 तनुकरण (प्रत्येक 70 μL) तैयार करें, 2x प्रति चरण (50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781, 0.390, 0.195, 0.097, 0.048, और 0 μM) एनआईएसटी-ट्रेसेबल एफआईटीसी मानक का उपयोग करके 50 μM सोडियम समाधान का उपयोग करके। कमजोर पड़ने की श्रृंखला को तीन प्रतियों में तैयार करें।
  3. चरण 6.2 के समान, सोडियम बोरेट समाधान (1.2, 0.3, 0.075, 0.0188, 0.0047, 0.0012, 0.,0003, 0.,0003, 0.,0007, और 0 μM) का उपयोग करके पुनः संयोजक ईजीएफपी से सीरियल कमजोर पड़ने (प्रत्येक 70 μL) तैयार करें। दाढ़ता गणना के लिए, प्रोटीन (28 केडीए) के पूर्ण आकार और शुद्ध ईजीएफपी (1 ग्राम / एल) की एकाग्रता पर विचार करें। कमजोर पड़ने की श्रृंखला को तीन प्रतियों में तैयार करें।
  4. एक चिपकने वाली प्लेट सील द्वारा कवर किए गए 384-अच्छी तरह से वर्ग-तल माइक्रोप्लेट में प्रत्येक तनुकरण का 20 μL जोड़ें (प्रत्येक नौ कुएं = तीन तनुकरण श्रृंखला x तीन तकनीकी प्रतिकृतियां) और माप के लिए एक प्लेट रीडर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: यहां, उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स उत्तेजना: 485/20, उत्सर्जन: 528/20, लाभ 50 के साथ थीं। हालांकि, अतिरिक्त तरंग दैर्ध्य / लाभ संयोजन का उपयोग अन्य फ्लोरोसेंट अणुओं और / या लाभ सेटिंग्स के लिए कैलिब्रेट करने के लिए भी किया जा सकता है। रूपांतरण कारक की गणना करने के लिए, सेल-मुक्त प्रयोगों और मानक वक्र डेटा से जीएफपी प्रतिदीप्ति डेटा प्राप्त करने के लिए समान तरंग दैर्ध्य और लाभ सेटिंग्स की आवश्यकता होती है।
  5. प्रत्येक स्थिति के लिए ढलान [y = ax और R2] को फिट करने के लिए रैखिक सिग्नल रेंज (यहां, उदाहरण के लिए, [FITC] ≤ 0.781 μM) का उपयोग करें।
    नोट: विभिन्न मशीनों और उपयोग किए जाने वाले मानक समाधानों के लिए सीमा भिन्न हो सकती है।
  6. तालिका 9 में दिए गए उदाहरण का पालन करके प्रयोगशाला के लिए सापेक्ष माप की गणना करने के लिए एफआईटीसी और ईजीएफपी अंशांकन के लिए डेटा सहेजें। एफआईटीसी या ईजीएफपी के संदर्भ में जीएफपी उत्पादन का अनुमान लगाने के लिए वक्र ढलान "ए" मान (वाई = एएक्स) द्वारा प्रतिदीप्ति मनमानी इकाइयों (ए.यू.) में प्राप्त मूल्यों को विभाजित करें।

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Representative Results

रैखिक और प्लास्मिड डीएनए के लिए अलग-अलग एमजी-ग्लूटामेट और के-ग्लूटामेट स्तरों के लिए लाइसेट के अंशांकन के बाद प्रतिनिधि परिणाम यहां दिखाए गए हैं (चित्रा 1)। Mg-Glutamate इष्टतम सांद्रता 8 mM (चित्रा 1B) पर 1recB औरY recBCD अर्क में समान है। हालांकि, प्लास्मिड डीएनए के लिए इष्टतम के-ग्लूटामेट एकाग्रता 140 एमएम है, जबकि एक ही अर्क के लिए रैखिक डीएनए के लिए इष्टतम के-ग्लूटामेट एकाग्रता 20 एमएम (चित्रा 1 सी) है। डब्ल्यूटी और एआरईसीबीडी कोशिकाओं के अर्क में जीएफपी अभिव्यक्ति के तुलनात्मक विश्लेषण में, यह देखा गया कि अर्क की बफर संरचना को विशेष रूप से एक्सोन्यूक्लिज़ वी हटाए गए अर्क में उपयोग किए जाने वाले रैखिक और प्लास्मिड डीएनए से इष्टतम अभिव्यक्ति के लिए कैलिब्रेट किया जाना चाहिए।

अंशांकन चरणों के बाद, जीएफपी अभिव्यक्तियों के स्तर की तुलना डब्ल्यूटी औरआरईसीबीडी अर्क (चित्रा 1 डी) में रैखिक और प्लास्मिड डीएनए (5 एनएम) से की गई थी। रैखिक डीएनए से जीएफपी अभिव्यक्ति क्रमशः 102% और 138% प्लास्मिड डीएनए से अभिव्यक्ति तक पहुंच गई। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि रैखिक डीएनए से अभिव्यक्ति, एक देशी ई कोलाई 70 प्रमोटर का उपयोग करके, प्लास्मिड अभिव्यक्ति से उसी स्तर तक पहुंच सकती है जब सेल लाइसेट ऐसे उत्परिवर्ती से तैयार किया जाता है और सेल-मुक्त बफर को विशेष रूप से रैखिक डीएनए के लिए कैलिब्रेट किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: 1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.11.11.11.11.11.11.11.11.11.11. (ए) एक 1361 बीपी रैखिक डीएनए एम्प्लिकॉन को प्लास्मिड पी 70 ए-डीजीएफपी से प्रवर्धित किया गया था और बफर अंशांकन के लिए जीन अभिव्यक्ति के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया गया था। (बी) 0 से 20 एमएम तक अलग-अलग सांद्रता का उपयोग करके प्रत्येक डीएनए प्रकार के 1 एनएम के साथ एमजी-ग्लूटामेट बफर अंशांकन (के-ग्लूटामेट 80 एमएम पर तय किया गया है)। वर्ग बक्से चुने गए एकाग्रता बिंदुओं को इंगित करते हैं। पी = प्लास्मिड डीएनए, एल = रैखिक डीएनए। (सी) प्रत्येक लाइसेट के लिए इष्टतम एमजी-ग्लूटामेट एकाग्रता का चयन करने के बाद, के-ग्लूटामेट को 20 से 240 एमएम तक टाइट किया गया था। वर्ग बक्से चुने गए एकाग्रता बिंदुओं को इंगित करते हैं। पी = प्लास्मिड डीएनए, एल = रैखिक डीएनए। हीट-मैप्स (बी) और (सी) में दिखाए गए डेटा एक ही प्रयोग से हैं। (डी) बफर अंशांकन के बाद, प्रत्येक डीएनए प्रकार के 5 एनएम के साथ सेल-मुक्त प्रतिक्रियाएं की गईं। एक्सट्रैक्ट बीएल 21 रोसेटा 2 रैखिक डीएनए अभिव्यक्ति का समर्थन नहीं करता है, जबकि एलआरईसीबी और एरेकबीसीडी उपभेदों से अलग-अलग अनुकूलित अर्क प्लास्मिड डीएनए (नीले) स्तरों के समान रैखिक डीएनए (हरे) अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करते हैं। दिखाए गए समापन बिंदु डेटा एक ही दिन में किए गए तीन प्रतिकृतियों के लिए एसडी ± माध्य हैं और इनक्यूबेशन के 8 घंटे के बाद एकत्र किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल का दृश्य प्रतिनिधित्व। सीएफपीएस संश्लेषण में टेम्पलेट के रूप में रैखिक डीएनए के लिए सेल लाइसेट तैयारी और लाइसेट अनुकूलन के लिए वर्कफ़्लो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: तरल और ठोस 2xYT + P मीडिया की तैयारी के लिए घटकों की सूची। प्रत्येक घटक की मात्रा (ग्राम में) 1 एल मीडिया के लिए निर्दिष्ट की जाती है। आवश्यकतानुसार आनुपातिक रूप से स्केल करें। उपयोग करने से पहले मीडिया को आटोक्लेव किया जाना चाहिए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: बफर एस 30 ए + डीटीटी की तैयारी के लिए घटकों की सूची। बफर एस 30 ए के 1 एल के लिए प्रत्येक घटक की मात्रा (ग्राम में) निर्दिष्ट की जाती है। आवश्यकतानुसार आनुपातिक रूप से स्केल करें। एस 30 ए बफर को आटोक्लेव किया जाना चाहिए और फिर उपयोग से पहले ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) किया जाना चाहिए। डीटीटी बफर को अलग से तैयार और फ़िल्टर किया जाना चाहिए जैसा कि संकेत दिया गया है (15 एमएल ट्यूब में) और -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जाना चाहिए। बफर एस 30 ए का उपयोग करने से ठीक पहले, एस 30 ए बफर के 1 एल में 2 एमएल डीटीटी (1 एम स्टॉक से) जोड़ें। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: ऊर्जा समाधान तैयार करने के लिए घटकों की सूची। संकेतित एकाग्रता (कॉलम एफ में) के लिए स्टॉक समाधान के एक निर्दिष्ट वॉल्यूम (कॉलम एच में) की तैयारी के लिए मात्रा (ग्राम में) या प्रत्येक घटक की मात्रा (कॉलम जी में) निर्दिष्ट की जाती है। यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक घटक के पीएच को समायोजित किया जाना चाहिए, जैसा कि इंगित किया गया है (कॉलम I और J में)। 14x ऊर्जा समाधान स्टॉक सूचीबद्ध क्रम में प्रत्येक घटक (कॉलम K में) की सूचीबद्ध मात्रा को मिलाकर तैयार किया जाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: अमीनो एसिड स्टॉक समाधान की तैयारी के लिए घटकों की सूची। 4x अमीनो एसिड स्टॉक समाधान की तैयारी के लिए, सभी अमीनो एसिड को सूचीबद्ध क्रम में मिलाया जाना चाहिए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 5. लाइसेट अंशांकन समाधान तैयार करने के लिए घटकों की सूची। एमजी-ग्लूटामेट और के-ग्लूटामेट स्टॉक समाधानों की मात्रा (ग्राम में) प्रत्येक बफर की संकेतित एकाग्रता के 50 एमएल तैयार करने के लिए निर्दिष्ट की जाती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 6: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले जीवाणु उपभेदों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 7: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 8: प्लास्मिड का उपयोग लाइसेट अंशांकन के लिए इस प्रोटोकॉल में और पीसीआर द्वारा रैखिक डीएनए प्रवर्धन के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 9: एफआईटीसी और ईजीएफपी रूपांतरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हम दिखाते हैं कि ई कोलाई बीएल 21 रोसेटा 2 से तैयार सेल लाइसेट या तो आरईसीबी या आरईसीसीडी ऑपेरॉन के लिए जीनोमिक नॉकआउट के साथ रैखिक डीएनए टेम्पलेट्स से उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति का समर्थन करता है। यह प्रोटोकॉल रैखिक डीएनए टेम्प्लेट (चित्रा 2) के लिए विशिष्ट एक चरण-दर-चरण लाइसेट अंशांकन प्रक्रिया को विस्तृत करता है, जो एक महत्वपूर्ण कदम है जो रैखिक डीएनए में 70 प्रमोटरों से उच्च अभिव्यक्ति की ओर जाता है, जो इक्विमोलर डीएनए सांद्रता के लिए निकट-प्लास्मिड स्तर तक पहुंचता है। यह प्रोटोकॉल अंतिम आवेदन में उपयोग किए जाने वाले डीएनए (रैखिक या प्लास्मिड) के प्रकार के अनुसार बफर अंशांकन के महत्व पर प्रकाश डालता है।

प्रोटोकॉल प्लास्मिड क्लोनिंग से बचने में मदद कर सकता है, जो समय और लागत में महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है। रैखिक डीएनए टुकड़े वाणिज्यिक प्रदाताओं द्वारा संश्लेषित किए जा सकते हैं और / या प्रयोगशाला में पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किए जा सकते हैं। प्लास्मिड डीएनए का उपयोग करने वाली एक ही प्रक्रिया में क्लोनिंग, अनुक्रम सत्यापन और डीएनए तैयारी चरण10 को ध्यान में रखते हुए कम से कम 1 सप्ताह अधिक समय लगेगा। प्रयोगों14,15 के बीच बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए सेल अर्क और रैखिक डीएनए टेम्पलेट्स की बड़ी मात्रा तैयार करने की सिफारिश की जाती है।

इस विधि को मजबूत दिखाया गया है और प्रयोगशालाओं10 में उपयोग किया जाता है। इन अर्क के परिणाम जैविक प्रतिकृति, विभिन्न अर्क बैचों के साथ-साथ विभिन्न तनाव पृष्ठभूमि10 में सुसंगत रहे हैं। प्रोटोकॉल की मजबूती का परीक्षण विभिन्न प्रयोगात्मक मापदंडों में भी किया गया है: सेल लाइसिस विधियां, तापमान, डीएनए टेम्पलेट्स और विभिन्न डीएनए सांद्रता। विधि का उपयोग पहले से ही दो प्रासंगिक अनुप्रयोगों के लिए आनुवंशिक संरचनाओं की तेजी से स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन के लिए किया गया है: टोहोल्ड स्विच लाइब्रेरी लक्षण वर्णन और एंजाइम गतिविधि स्क्रीनिंग10।

यद्यपि इस अध्ययन में उच्च अभिव्यक्ति स्तर अत्यधिक उत्पादक माता-पिता के तनाव ई कोलाई बीएल 21 रोसेटा 2 से रैखिक डीएनए से प्राप्त किए गए थे, लेकिन कार्यप्रणाली को रुचि के एक नए तनाव के लिए जीनोम इंजीनियरिंग की आवश्यकता होगी। इसके विपरीत, रैखिक डीएनए के लिए सुरक्षात्मक एजेंटों के साथ पूरक, जैसे कि जीएएमएस5 या ची डीएनए6, एक नए तनाव के लिए लागू करना आसान है, लेकिन महंगा और अधिक समय लेने वाला है।

यहां प्रदान किया गया प्रोटोकॉल सेल-मुक्त प्रणालियों में रैखिक डीएनए टेम्पलेट्स के उपयोग की सुविधा प्रदान करेगा और सिंथेटिक जीव विज्ञान समुदाय के लिए डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट चक्रों में तेजी लाएगा। 1.5.1.5.1.1.3.1.1.3.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.12 में रैखिक डीएनए टेम्प्लेट से आसान सेल-मुक्त अभिव्यक्ति को रुचि के छोटे अणुओं, बायोसिमिलर और अन्य ऑन-डिमांड पॉइंट-ऑफ-केयर अनुप्रयोगों के उत्पादन के लिए तैनात किया जा सकता है।

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Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

एसीबी और जेएलएफ एएनआर सिनापयूवी अनुदान (एएनआर-17-सीई07-0046) द्वारा वित्त पोषण सहायता स्वीकार करते हैं। जेएलएफ और जेबी एएनआर सिंबायोडायग अनुदान (एएनआर-18-सीई 33-0015) द्वारा वित्त पोषण सहायता स्वीकार करते हैं। एमएसए और जेएलएफ एएनआर आईसीफ्री अनुदान (एएनआर -20-बायोपएनएसई) द्वारा वित्त पोषण सहायता स्वीकार करते हैं। जेबी "COMPUCELL" (अनुदान संख्या 657579) शुरू करने वाले ईआरसी से समर्थन स्वीकार करता है। सेंटर डी बायोचीमी स्ट्रक्चरल स्ट्रक्चरल एकीकृत संरचनात्मक जीवविज्ञान (एफआरआईएसबी) (एएनआर -10-आईएनएसबी-05-01) के लिए फ्रेंच इंफ्रास्ट्रक्चर से समर्थन स्वीकार करता है। एमके ने आईएनआरएई के एमआईसीए विभाग, यूनिवर्सिट पेरिस-सैकले, इले-डी-फ्रांस (आईडीएफ) क्षेत्र के डीआईएम-आरएफएसआई और एएनआर ड्रीमी (एएनआर -21-सीई 48-003) से वित्त पोषण सहायता स्वीकार की। इस काम को यूरोपीय अनुसंधान परिषद समेकितकर्ता पुरस्कार (सीएलबी के 865973) के माध्यम से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-YT Broth Invitrogen 22712020
1.5 mL Safe-Lock tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL microtube
384-well square-bottom microplate Thermo Scientific Nunc 142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) Sigma-Aldrich P8877
adhesive plate seal Thermo Scientific Nunc 232701
Agar Invitrogen 30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma-Aldrich A8937
BL21 Rosetta2 Merck Millipore 71402
BL21 Rosetta2 ΔrecB Addgene 176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCD Addgene 176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) Sigma-Aldrich  A9501
Chloramphenicol  Sigma-Aldrich C0378
CoA (Coenzyme A hydrate) Sigma-Aldrich C4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile Corning 430790 15 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile Corning 430828 50 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) Alfa Aesar  J62238
DpnI NEB R0176S
DTT (DL-Dithiothreitol) Sigma-Aldrich D0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) Sigma-Aldrich F7878
GTP (Guanosine 5?-Triphosphate,  Disodium Salt) Sigma-Aldrich 371701
HEPES Sigma-Aldrich  H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4) Carl Roth 231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P) Sigma-Aldrich P5655
K-glutamate Alfa Aesar A17232
Mg-glutamate  Sigma-Aldrich 49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone Merck Millipore SLGP033RB membrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit NEB T1030S PCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010S Plasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)  Sigma-Aldrich  N6522
NIST-traceable FITC standard Invitrogen F36915 NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kit Macherey-Nagel 740414.1 Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000 Sigma-Aldrich 89510
plate reader Biotek  Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP Protein Chromotek egfp-250 recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0492S DNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492L DNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Q32850 fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid Sampler biotechrabbit BR1401801
Spermidine Sigma-Aldrich 85558
Sterile water Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving.
Tris base Life Science products Cytiva 17-1321-01 
tRNA Roche 10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 SONICS VC505 sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) Acros Organics  226310010
Water, nuclease-free Thermo R0581 nuclease-free water

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References

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
  3. Schinn, S. -M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
  4. Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
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बायोइंजीनियरिंग अंक 186
रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करके एक्सोन्यूक्लिज़-कमी सेलुलर अर्क से सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण
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Sabeti Azad, M., Cardoso Batista,… More

Sabeti Azad, M., Cardoso Batista, A., Faulon, J. L., Beisel, C. L., Bonnet, J., Kushwaha, M. Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates. J. Vis. Exp. (186), e64236, doi:10.3791/64236 (2022).

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