Summary
Presentato qui un protocollo per la preparazione e la calibrazione tampone di estratti cellulari da ceppi knockout di esonucleasi V di Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD e ΔrecB). Questo è un approccio rapido, facile e diretto per l'espressione in sistemi di sintesi proteica privi di cellule utilizzando modelli lineari di DNA.
Abstract
La sintesi proteica priva di cellule (CFPS) è recentemente diventata molto popolare nel campo della biologia sintetica grazie ai suoi numerosi vantaggi. L'utilizzo di modelli di DNA lineare per CFPS consentirà inoltre alla tecnologia di raggiungere il suo pieno potenziale, riducendo il tempo sperimentale eliminando le fasi di clonazione, trasformazione ed estrazione del plasmide. Il DNA lineare può essere rapidamente e facilmente amplificato mediante PCR per ottenere alte concentrazioni del modello, evitando potenziali tossicità di espressione in vivo . Tuttavia, i modelli lineari di DNA sono rapidamente degradati dalle esonucleasi che sono naturalmente presenti negli estratti cellulari. Ci sono diverse strategie che sono state proposte per affrontare questo problema, come l'aggiunta di inibitori della nucleasi o la modifica chimica delle estremità lineari del DNA per la protezione. Tutte queste strategie costano tempo e risorse extra e devono ancora ottenere livelli di espressione proteica vicini al plasmide. Un protocollo dettagliato per una strategia alternativa è presentato qui per l'utilizzo di modelli di DNA lineare per CFPS. Utilizzando estratti cellulari da cellule knockout carenti di esonucleasi, i modelli lineari di DNA rimangono intatti senza richiedere alcuna modifica finale. Presentiamo le fasi di preparazione del lisato cellulare da Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD ceppo mediante lisi sonicazione e calibrazione tampone per Mg-glutammato (Mg-glu) e K-glutammato (K-glu) specificamente per DNA lineare. Questo metodo è in grado di raggiungere livelli di espressione proteica paragonabili a quelli del DNA plasmidico in E. coli CFPS.
Introduction
I sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS) sono sempre più utilizzati come metodo rapido, semplice ed efficiente per l'ingegneria dei biosensori, la produzione decentralizzata e la prototipazione di circuiti genetici1. Grazie al loro grande potenziale, i sistemi CFPS sono utilizzati regolarmente nel campo della biologia sintetica. Tuttavia, finora i sistemi CFPS si basano su plasmidi circolari che possono limitare la tecnologia dal raggiungere il suo pieno potenziale. La preparazione del DNA plasmidico dipende da molti passaggi che richiedono molto tempo durante la clonazione e grandi quantità di isolamento del DNA. D'altra parte, l'amplificazione PCR da un plasmide, o un modello di DNA sintetizzato, può essere utilizzata per preparare semplicemente modelli CFPS entro poche ore 2,3. Pertanto, l'applicazione del DNA lineare offre una soluzione promettente per la CFPS. Tuttavia, il DNA lineare viene rapidamente degradato dalle esonucleasi naturalmente presenti negli estratti cellulari4. Esistono soluzioni che affrontano questo problema, come l'uso della proteina GamS λ-fago5 o il DNA contenente siti Chi6 come agenti protettivi, o proteggere direttamente il DNA lineare modificando chimicamente le sue estremità 2,7,8,9. Tutti questi metodi richiedono integrazioni per l'estratto cellulare, che sono costosi e richiedono tempo. È noto da tempo che il complesso esonucleasi V (RecBCD) degrada il DNA lineare nei lisati cellulari4. Recentemente, abbiamo dimostrato che il DNA lineare può essere protetto molto meglio nei lisati da cellule eliminate per i geni esonucleasi (recBCD)10.
In questo protocollo, i passaggi per la preparazione di lisati privi di cellule dal ceppo E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD mediante lisi sonicazione sono descritti in dettaglio. La lisi sonicazione è una tecnica comune e conveniente impiegata da diversi laboratori11,12. Gli estratti prodotti da questo ceppo non hanno bisogno dell'aggiunta di alcun componente aggiuntivo o modifica del modello di DNA per supportare l'espressione da modelli lineari di DNA. Il metodo si basa sulla fase essenziale dell'ottimizzazione del tampone per gli estratti cellulari specificamente per l'espressione lineare del DNA da promotori nativi di E. coli. È stato dimostrato che questa specifica ottimizzazione del tampone per l'espressione lineare del DNA è la chiave per i promotori nativi σ70 per produrre un'elevata produzione di proteine senza l'integrazione di proteina GamS o DNA Chi, evitando anche la purificazione dei prodotti PCR10. La concentrazione ottimale di Mg-glu per l'espressione lineare del DNA è risultata simile a quella del DNA plasmide. Tuttavia, la concentrazione ottimale di K-glu ha mostrato una differenza sostanziale tra DNA lineare e plasmide, probabilmente a causa di un meccanismo correlato alla trascrizione10. La funzionalità delle proteine espresse con questo metodo è stata dimostrata per diverse applicazioni, come lo screening rapido degli interruttori e la valutazione dell'attività delle varianti enzimatiche10.
Questo protocollo fornisce una soluzione semplice, efficiente ed economica per l'utilizzo di modelli di DNA lineare in sistemi privi di cellule di E. coli semplicemente utilizzando estratti cellulari ΔrecBCD mutanti e calibrazione specifica per DNA lineare come modello.
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Protocol
1. Preparazione dei supporti e del buffer
- Preparazione del mezzo 2xYT+P (solido e liquido)
- Preparare fluidi liquidi e solidi come descritto nella Tabella 1, quindi sterilizzare mediante autoclave.
NOTA: Questo protocollo richiede una piastra di agar 2xYT+P contenente cloramfenicolo (10 μg/ml). Il volume dei mezzi liquidi è proporzionale al volume del lisato richiesto. Qui viene utilizzato un volume iniziale di 5 L di fluido liquido 2xYT+P. Tuttavia, il volume può essere regolato secondo necessità, sapendo che 1 L della coltura cellulare si traduce in 2-3 ml del lisato cellulare finale.
- Preparare fluidi liquidi e solidi come descritto nella Tabella 1, quindi sterilizzare mediante autoclave.
- Preparazione di cloramfenicolo (34 mg/ml)
- Pesare 0,34 g di cloramfenicolo, aggiungere etanolo a 10 ml e sciogliere mescolando. Aliquot 1 mL ciascuno in più provette e conservare a -20 °C per utilizzarlo in seguito.
- Preparazione del buffer S30A
- Preparare il tampone S30A secondo la Tabella 2, puntando a 2 L di questo tampone.
Nota : ancora una volta, il volume di questo buffer è proporzionale al volume del lisato richiesto. - Prima dell'autoclave, regolare il pH del tampone a 7,7 utilizzando acido acetico glaciale.
- Autoclavare il buffer.
- Mantenere questo tampone a 4 °C dopo l'autoclave.
- Prima dell'uso, aggiungere DTT (filtrato da un filtro a membrana da 0,22 μm) al tampone S30A per raggiungere una concentrazione finale di 2 mM (2 mL di stock da 1 M DTT a 1 L di tampone S30A).
Nota : ancora una volta, il volume di questo buffer è proporzionale al volume del lisato richiesto.
- Preparare il tampone S30A secondo la Tabella 2, puntando a 2 L di questo tampone.
- Preparazione della soluzione energetica
NOTA: Questa soluzione energetica si basa sul documento Sun et al. 13 (concentrazione di stock 14x). La tabella 3 riassume i componenti necessari per la preparazione del materiale di soluzione energetica, con numeri di catalogo per tutte le sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo.- Preparare le soluzioni madre secondo la Tabella 3 e tenerle in ghiaccio.
- Calibrare il pH come richiesto per i componenti indicati, con tampone Tris 2 M (60,57 g di Tris base in un volume di 250 mL di acqua sterile) o KOH 15% (15 g di KOH in un volume di 100 mL di acqua sterile) come indicato nella Tabella 3.
- In una provetta da 15 ml, aggiungere il volume di ciascun componente nell'ordine indicato nella tabella 3.
- Aliquot la soluzione energetica, 150 μL per tubo.
- Congelare le aliquote su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
- Preparazione della soluzione di aminoacidi (AA)
NOTA: La soluzione di aminoacidi è preparata dal kit RTS Amino Acid Sampler. Ciascuno dei 20 aminoacidi è fornito in questo kit come volume di 1,5 ml a 168 mM, ad eccezione della leucina che è a 140 mM. Qui, la soluzione madre preparata è concentrata 4x, piuttosto che la soluzione di lavoro richiesta. La concentrazione finale della soluzione di amminoacidi è di 6 mM per tutti gli amminoacidi, ad eccezione della leucina che è a 5 mM.- Scongelare i 20 tubi di amminoacidi mediante vortice e incubare a 37 °C fino a completa dissoluzione.
NOTA: Cys potrebbe non dissolversi completamente. - In una provetta da 50 ml, aggiungere 12 ml di acqua sterile e 1,5 ml ciascuno degli amminoacidi nell'ordine indicato nella tabella 4.
- Vortice fino a quando la soluzione è abbastanza limpida, incubare a 37 °C se necessario.
NOTA: Cys potrebbe non dissolversi completamente. - Aliquot 500 μL della soluzione di amminoacidi per provetta su ghiaccio.
- Congelare le aliquote su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
- Scongelare i 20 tubi di amminoacidi mediante vortice e incubare a 37 °C fino a completa dissoluzione.
- Preparazione di soluzioni per la calibrazione del buffer
- Preparare la soluzione madre per Mg-glu (100 mM) e K-glu (3 M) come indicato nella Tabella 5. Effettuare una diluizione seriale (in volume di 1 ml) da questi materiali di partenza per Mg-glu (da 0 a 20 mM) e K-glu (da 20 a 300 mM) come indicato nel file supplementare 1 per le fasi di taratura.
NOTA: Queste concentrazioni di stock sono per la fase di calibrazione e potrebbe essere necessario modificare durante l'impostazione dell'esperimento finale. Le concentrazioni più elevate degli stock testati per questo protocollo sono 1 M e 4,5 M rispettivamente per Mg-glu e K-glu.
- Preparare la soluzione madre per Mg-glu (100 mM) e K-glu (3 M) come indicato nella Tabella 5. Effettuare una diluizione seriale (in volume di 1 ml) da questi materiali di partenza per Mg-glu (da 0 a 20 mM) e K-glu (da 20 a 300 mM) come indicato nel file supplementare 1 per le fasi di taratura.
- Preparazione del brodo di soluzione PEG8000
- Preparare 50 ml di soluzione di PEG8000 al 40% (20 g di PEG8000 in un volume di 50 ml di acqua sterile).
2. Coltura cellulare e preparazione del lisato (esperimento di 4 giorni)
- Giorno 1
- Streak ceppo BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (Tabella 6) da -80 °C di glicerolo su una piastra di agar 2xYT+P contenente 10 μg/mL di cloramfenicolo. In alternativa, BL21 Rosetta2 ΔrecB (Tabella 6) può essere utilizzato anche10.
- Incubare per una notte a 37 °C.
- Giorno 2
- Inoculare una singola colonia dalla piastra di agar di cui sopra in 10 mL di 2xYT+P integrato con 10 μg/mL di cloramfenicolo.
- Incubare per una notte a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
- Giorno 3
- Fare una sottocoltura diluendo la coltura notturna 100 volte in 4 L di mezzo fresco 2xYT+P contenente 10 μg/ml di cloramfenicolo.
NOTA: Ad esempio, 40 ml di coltura notturna vengono aggiunti a 3960 ml di terreno fresco. Dopo la diluizione, il mezzo da 4 L viene diviso in 4 matraccio (volume 5 L) in modo che ogni matraccio contenga 1 L. - Incubare a 37 °C, 200 giri/min per circa 3-4 ore di crescita per raggiungere un OD600 di 1,5-2,0. Diluire la coltura di 4x se si misura OD600 > 0,8.
NOTA: Il tempo esatto di incubazione può variare a seconda del ceppo, dell'inoculo iniziale, degli oggetti da laboratorio e degli strumenti utilizzati. I ceppi knockout ΔrecB/ΔrecBCD hanno tassi di crescita paragonabili a quelli del parente BL21 Rosetta2 (Figura supplementare 1). - Metti la cultura sul ghiaccio.
- Ruotare le cellule a 5.000 x g per 12 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante mediante decantazione.
- Risospendere i pellet di cella in 800 ml di S30A+DTT refrigerato.
NOTA: il volume di S30A+DTT è 5 volte inferiore al volume originale della coltura cellulare. Ad esempio, per un volume iniziale di 1 L della coltura cellulare, risospendere i pellet cellulari in 200 mL di S30A+DTT. Si consiglia inoltre di eseguire questo passaggio in una cella frigorifera a 4 °C, oltre a mantenere tutti i materiali sul ghiaccio. - Ruotare le cellule a 5.000 x g per 12 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante mediante decantazione.
- Ripetere i passaggi 2.3.5 e 2.3.6.
- Risospendere i pellet cellulari in 160 ml di S30A+DTT refrigerato.
NOTA: questa volta il volume di S30A+DTT è 25 volte inferiore al volume originale della coltura cellulare. Ad esempio, per un volume iniziale di 1 L della coltura cellulare, risospendere i pellet cellulari in 40 ml di S30A + DTT. Anche in questo caso, si consiglia di eseguire questo passaggio in una cella frigorifera a 4 °C, nonché di mantenere i materiali sul ghiaccio. - Trasferire le celle in provette refrigerate e prepesate da 50 ml.
- Ruotare le cellule a 2.000 x g per 8 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante mediante decantazione.
- Ruotare le celle a 2.000 x g per 4 minuti a 4 °C, quindi rimuovere con cautela il surnatante rimanente utilizzando una pipetta.
- Rimisurare il peso del tubo per calcolare il peso del pellet cellulare.
- Mantenere il pellet cellulare a -80 °C.
- Fare una sottocoltura diluendo la coltura notturna 100 volte in 4 L di mezzo fresco 2xYT+P contenente 10 μg/ml di cloramfenicolo.
- Giorno 4
- Prelevare i pellet cellulari da -80 °C e scongelarli su ghiaccio per 1-2 ore.
- Risospendere i pellet cellulari in 0,9 ml di tampone S30A + DTT per grammo del peso del pellet. Pipettare lentamente per risospendere le cellule, evitando il più possibile la schiuma superiore, se presente.
- Introdurre 1 mL di aliquote delle celle risospese in microtubi da 1,5 mL e conservarli su ghiaccio o su un blocco freddo pre-refrigerato a 4 °C (è preferibile utilizzare blocchi metallici).
NOTA: Se l'ultima aliquota è molto inferiore a 1 ml, è meglio scartarla piuttosto che sonicare un volume sub-ottimale. Il volume ottimale (1 ml) per la sonicazione è stato determinato per questa configurazione (tubo, sonicatore e sonda) e può variare per uno diverso. - Sonicare ogni tubo in un sonicatore (sonda da 3 mm, frequenza 20 kHz), con una configurazione del 20% di ampiezza per tre cicli (sonicazione di 30 s, pausa di 1 minuto).
NOTA: L'energia totale erogata nei tre cicli è stata di ~ 266 Joule (~ 80-110 Joule per ciclo). Durante questa fase, tenere i tubi sul blocco freddo che è circondato da ghiaccio. Alternare tra due blocchi freddi per evitare il surriscaldamento della sonda (anche il blocco freddo di standby viene mantenuto freddo sul ghiaccio). Entrambi i blocchi freddi sono stati pre-raffreddati in frigo il giorno prima della sonicazione. - Girare il lisato a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Raccogliere il surnatante (lisato cellulare) con una pipetta e trasferirlo in una provetta da 50 ml.
- Incubare il lisato cellulare a 37 °C a 200 giri/min agitando per 80 min.
- Girare il lisato a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Raccogliere il surnatante e l'aliquota 30 μL ciascuno in microtubi da 1,5 mL pre-raffreddati, mantenendo tutti i tubi su ghiaccio.
- Congelare le aliquote di lisato su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
3. Calibrazione del tampone senza cellule per il DNA lineare
NOTA: Il tampone privo di cellule è stato calibrato per concentrazioni ottimali di Mg-glu e K-glu come descritto in Sun et al.13. Il file supplementare 1 è necessario per le fasi di calibrazione. Le reazioni sono state impostate su un volume finale di 10,5 μL ciascuno. Gli estratti sono stati calibrati utilizzando 1 nM di DNA lineare (vedere la sezione 4 sotto) o plasmide. Gli esperimenti possono essere eseguiti lo stesso giorno in cui vengono preparati i tamponi, oppure i tamponi preparati possono essere congelati a -80 °C per eseguire l'esperimento in un altro giorno. Per tutte le fasi di calibrazione, ogni componente è stato scongelato sul ghiaccio prima di miscelare e pipettare in una piastra da 384 pozzetti.
- Preparare un Master Mix, secondo la scheda 'Preparazione buffer' nel file Excel Supplementary File 1, contenente: (a) estratto cellulare (33% del volume totale di reazione), (b) DNA reporter (come DNA lineare e/o plasmide) ad una concentrazione finale di 1 nM, (c) tampone privo di cellule (PEG8000, soluzione AA e soluzione energetica) e (d) K-glu ad una concentrazione finale di 80 mM.
- Per un volume di reazione di 10,5 μL, prelevare 1,05 μL (reazione totale al 10%) di diverse concentrazioni di scorte concentrate di Mg-glu 10x (intervalli di concentrazione finali: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 e 20 mM) e aggiungere 9,45 μL (reazione totale al 90%) del Master Mix. Mescolare delicatamente.
NOTA: Utilizzare tubi a otto strisce PCR per preparare le diluizioni e miscelare con una pipetta multicanale. Se necessario, può essere utilizzato un diverso intervallo di concentrazioni di Mg-glu. - Pipettare 10 μL delle reazioni di cui sopra in una micropiastra a fondo quadrato da 384 pozzetti, coprirla con un sigillo adesivo e misurare l'espressione genica come output di fluorescenza. Registrare i dati di fluorescenza con un lettore di piastre (Es: 485 nm; Em: 528 nm) a intervalli regolari (ad esempio, 5 min) per 8 ore di incubazione a 30 °C con scuotimento orbitale continuo a 307 cpm.
NOTA: Se necessario, ruotare la micropiastra da 384 pozzetti (<2.500 x g, 1 min, temperatura ambiente) prima di iniziare l'acquisizione dei dati. Le misurazioni dell'end-point sono state utilizzate per confrontare l'espressione GFP nelle diverse composizioni del buffer. I valori di fluorescenza possono essere convertiti in unità standardizzate per il plotting (vedi sotto). - Identificare la concentrazione di Mg-glu che si traduce nel più alto valore di fluorescenza al punto finale.
NOTA: Se non si è sicuri della concentrazione ottimale di Mg-glu ottenuta, ripetere il punto 3.2 con intervalli di concentrazione più diversi. - Con la concentrazione ottimizzata di Mg-glu, procedere alla calibrazione K-glu per un intervallo di concentrazioni (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 e 240 mM), utilizzando gli stessi volumi indicati al punto 3.2. Esegui l'esperimento e identifica il più alto valore di fluorescenza tra le concentrazioni di K-glu testate. Questo indica la composizione tampone ottimale per Mg-glu e K-glu per questo lisato.
NOTA: Se non si è sicuri della concentrazione ottimale di K-glu ottenuta, ripetere il passaggio con intervalli di concentrazione più diversi. - Una volta stabiliti i valori di Mg-glu e K-glu, preparare provette stock della composizione tampone ottimizzata in base al volume del lotto ottenuto. Utilizzare la scheda «Preparazione tampone» nel file supplementare 1 per calcolare il numero di tubi tampone necessari, ovvero 38 μL per provetta, e conservare a -80 °C.
4. Preparazione lineare del DNA
NOTA: Per la calibrazione del lisato, viene utilizzato il plasmide P70a-deGFP. Questo plasmide è stato mantenuto in E. coli KL740 cl857+ (Tabella 6) per miniprep utilizzando il Plasmid Miniprep Kit, o maxiprep usando il Plasmid Maxiprep Kit. I frammenti lineari di DNA utilizzati come modelli di espressione nelle reazioni libere da cellule sono stati amplificati con PCR utilizzando i primer e i modelli elencati nella Tabella 7 e nella Tabella 8.
- La PCR si amplifica dal plasmide P70a-deGFP utilizzando DNA polimerasi con oligo primer elencati nella Tabella 7. Impostare le reazioni PCR in un volume di 50 μL, secondo il protocollo del produttore, utilizzando il programma del termociclatore: [98 °C per 2 min; 40 cicli x (98 °C per 30 s → 66 °C per 30 s → 72 °C per 60 s); 72 °C per 10 min; 4 °C per ∞].
- Digerire il DNA modello nelle reazioni PCR aggiungendo 1 μL di enzima di restrizione DpnI per 50 μL di reazione PCR e incubare a 37 °C per 1 ora. Quindi, purificare la reazione PCR utilizzando un kit di pulizia PCR e DNA ed eluire in acqua priva di nucleasi.
- Verificare i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% (1x TAE) prima dell'uso.
- Quantificare i prodotti PCR purificati (o i preparati plasmidici) utilizzando Nanodrop (ND-1.000).
NOTA: Se si utilizza una DNA polimerasi/tampone direttamente compatibile con la reazione cellulare a valle, la fase di purificazione (fase 2) può essere saltata completamente e la concentrazione di DNA non purificato misurata mediante un saggio fluorometrico con colorante legante il DNA (vedi Batista et al.10).
5. Esecuzione sperimentale
NOTA: oltre a utilizzare il file supplementare 1 per calibrare lo stock tampone per ciascun lotto di lisato preparato (sopra), si consiglia di utilizzare la scheda "Preparazione della reazione" nel file per impostare le successive reazioni prive di cellule. Come in precedenza, il volume delle reazioni è fissato a 10,5 μL per reazione, di cui solo 10 μL vengono infine pipettati nella piastra a 384 pozzetti per l'acquisizione dei dati. Qui, 5 nM di ogni modello vengono utilizzati per l'espressione senza celle. È importante essere coerenti quando si pipettano le reazioni: utilizzare la stessa pipetta e il tipo di puntali. Erogare con attenzione per evitare bolle nel pozzo o liquidi che si attaccano alle pareti del pozzo. Se necessario, girare verso il basso il piatto (<2.500 x g, 1 min, temperatura ambiente).
- Calcolare i volumi da pipettere inserendo le descrizioni e le repliche necessarie per campione nella scheda "Preparazione della reazione" del file supplementare 1.
NOTA: se è richiesto un volume di reazione diverso da 10,5 μL, questo può essere inserito anche nel file supplementare 1. Il file calcolerà il numero di provette di scorte tampone precedentemente ottimizzate e le provette di estrazione cellulare da scongelare sul ghiaccio. - Etichettare un microtubo da 1,5 mL per la preparazione della miscela master ottimale (separatamente per DNA lineare e plasmide), aggiungere i volumi corretti del tampone e del lisato e mescolare delicatamente.
NOTA: A causa delle differenze nelle concentrazioni ottimali di K-glu nei loro tamponi, è necessario utilizzare separatamente copie della scheda "Preparazione della reazione" per il DNA lineare e plasmide. - Pipettare prima i campioni di DNA, poi con acqua priva di nucleasi e infine con l'Optimal Master Mix (MM) dal punto 5.2. Mescolare delicatamente la reazione priva di cellule con la pipetta appena prima di aggiungerla al lettore di piastre ed evitare eventuali bolle.
NOTA: Utilizzare un tubo a otto strisce PCR per miscelare il volume di reazione per una replica aggiuntiva. Ad esempio, se si prevedono triplicati tecnici, preparare una miscela per quattro reazioni e lasciare un volume morto nella provetta per ridurre gli errori di pipettaggio durante l'aggiunta dei campioni alla piastra. - Impostare le reazioni nel lettore di piastre (Ex 485 nm; Em 528 nm). Le corse cinetiche hanno registrato dati di fluorescenza a intervalli regolari (ad esempio, 5 minuti) per 8 ore di incubazione a 30 °C, con scuotimento orbitale continuo a 307 cpm.
NOTA: le misurazioni dell'end-point sono state riportate come punto temporale di 8 ore. I valori di fluorescenza raccolti sono in unità arbitrarie (u.a.), ma possono essere convertiti in unità standardizzate per il plotting (vedi sotto).
6. Quantificazione relativa di FITC e GFP
NOTA: l'espressione di GFP viene esportata dal lettore di piastre in unità di fluorescenza arbitrarie (u.a.). Tuttavia, si consiglia di utilizzare unità di misura standardizzate per confrontare i valori di fluorescenza tra diverse impostazioni (lotti, apparecchiature, utenti e laboratori). Di seguito sono presentati i passaggi dettagliati per convertire i valori di fluorescenza (u.a.) in valori equivalenti a FITC ed eGFP (μM), utilizzando curve standard di NIST-FITC e eGFP ricombinante. Conservare la soluzione madre NIST-FITC a 4 °C e conservare l'eGFP ricombinante a -20 °C. Assicurarsi che la soluzione madre e le diluizioni seriali siano protette dalla luce. Al momento della consegna, si raccomanda di aliquote l'eGFP ricombinante in volumi più piccoli per evitare cicli multipli di congelamento-scongelamento.
- Preparare una soluzione di 100 mM di borato di sodio, pH 9,5, e conservare a temperatura ambiente o a 4 °C.
- Preparare 12 diluizioni (70 μL ciascuna) per la curva standard, 2x per passo (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562, 0,781, 0,390, 0,195, 0,097, 0,048 e 0 μM) dello standard FITC tracciabile NIST dal materiale madre da 50 μM utilizzando la soluzione di borato di sodio. Preparare la serie di diluizione in triplice copia.
- Analogamente al punto 6.2, preparare diluizioni seriali (70 μL ciascuna) dall'eGFP ricombinante utilizzando la soluzione di borato di sodio (1,2, 0,3, 0,075, 0,0188, 0,0047, 0,0012, 0,0003, 0,00007 e 0 μM). Per il calcolo della molarità, considerare l'intera dimensione della proteina (28 kDa) e la concentrazione dell'eGFP purificato (1 g/L). Preparare la serie di diluizione in triplice copia.
- Aggiungere 20 μL di ogni diluizione (nove pozzetti ciascuno = tre serie di diluizioni x tre repliche tecniche) in una micropiastra a fondo quadrato da 384 pozzetti, coperta da un sigillo adesivo, e incubare in un lettore di piastre per la misurazione.
NOTA: Qui, le impostazioni utilizzate erano Eccitazione: 485/20, Emissione: 528/20, con guadagno 50. Tuttavia, ulteriori combinazioni di lunghezza d'onda/guadagno possono essere utilizzate anche per calibrare altre molecole fluorescenti e/o impostazioni di guadagno. Per calcolare il fattore di conversione, sono necessarie le stesse impostazioni di lunghezza d'onda e guadagno per acquisire i dati di fluorescenza GFP dagli esperimenti senza celle e dai dati della curva standard. - Utilizzare l'intervallo di segnale lineare (qui, ad esempio, [FITC] ≤ 0,781 μM) per adattare la pendenza [y = ax e R2] per ogni condizione.
NOTA: La gamma può differire per le diverse macchine e soluzioni standard utilizzate. - Salvare i dati per la calibrazione FITC ed eGFP per calcolare le misure relative per il laboratorio seguendo l'esempio nella Tabella 9. Dividere i valori ottenuti in unità arbitrarie di fluorescenza (u.a.) per il valore della pendenza della curva "a" (y = ax) per stimare la produzione di GFP in termini di FITC o eGFP.
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Representative Results
Risultati rappresentativi sono mostrati qui dopo la calibrazione del lisato per i livelli ottimali di Mg-glutammato e K-glutammato separatamente per DNA lineare e plasmidico (Figura 1). La concentrazione ottimale di Mg-glutammato è simile tra gli estratti di Δ recB e ΔrecBCD a 8 mM (Figura 1B). Tuttavia, la concentrazione ottimale di K-glutammato per il DNA plasmidico è di 140 mM, mentre la concentrazione ottimale di K-glutammato per il DNA lineare per lo stesso estratto è di 20 mM (Figura 1C). In un'analisi comparativa dell'espressione di GFP in estratti da cellulerecBCD WT e Δ, si è visto che la composizione tampone degli estratti deve essere specificamente calibrata per un'espressione ottimale dal DNA lineare e plasmidico utilizzato negli estratti con delezione di esonucleasi V.
Dopo le fasi di calibrazione, i livelli di espressione GFP sono stati confrontati dal DNA lineare e plasmidico (5 nM) nell'estratto direcBCD WT e Δ (Figura 1D). L'espressione di GFP dal DNA lineare ha raggiunto rispettivamente il 102% e il 138% dell'espressione del DNA plasmidico negli estratti dei ceppi ΔrecB e ΔrecBCD. Insieme, questi risultati mostrano che l'espressione dal DNA lineare, utilizzando un promotore nativo di E. coli σ70, può raggiungere lo stesso livello di quella dell'espressione plasmidica quando il lisato cellulare viene preparato da tali mutanti e il tampone privo di cellule è specificamente calibrato per il DNA lineare.
Figura 1: Ottimizzazione del tampone differenziale per DNA lineare e plasmidico in estratti di ΔrecB/ΔrecBCD. (A) Un amplicone lineare del DNA da 1361 bp è stato amplificato dal plasmide p70a-deGFP e utilizzato come modello per l'espressione genica per la calibrazione del buffer. (B) Taratura del tampone mg-glutammato con 1 nM di ciascun tipo di DNA utilizzando concentrazioni diverse da 0 a 20 mM (con K-glutammato fissato a 80 mM). Le caselle quadrate indicano i punti di concentrazione scelti. P = DNA plasmide, L = DNA lineare. (C) Dopo aver selezionato la concentrazione ottimale di Mg-glutammato per ciascun lisato, il K-glutammato è stato titolato da 20 a 240 mM. Le caselle quadrate indicano i punti di concentrazione scelti. P = DNA plasmide, L = DNA lineare. I dati mostrati nelle mappe di calore (B) e (C) provengono da un singolo esperimento. (D) Dopo la calibrazione del tampone, sono state eseguite reazioni libere da cellule con 5 nM di ciascun tipo di DNA. L'estratto BL21 Rosetta2 non supporta l'espressione lineare del DNA, mentre gli estratti differenzialmente ottimizzati dai ceppi ΔrecB e ΔrecBCD mostrano un'espressione lineare del DNA (verde) simile ai livelli di DNA plasmidico (blu). I dati dell'endpoint mostrati sono ± SD medi per tre repliche effettuate nello stesso giorno e raccolte dopo 8 ore di incubazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione visiva del protocollo. Flusso di lavoro per la preparazione del lisato cellulare e l'ottimizzazione del lisato per il DNA lineare come modello nella sintesi CFPS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Elenco dei componenti per la preparazione di fluidi liquidi e solidi 2xYT+P. La quantità (in grammi) di ciascun componente è specificata per 1 L di supporto. Scalabilità verticale proporzionale in base alle esigenze. I supporti devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Elenco dei componenti per la preparazione del buffer S30A+DTT. La quantità (in grammi) di ciascun componente è specificata per 1 L di tampone S30A. Scalabilità verticale proporzionale in base alle esigenze. Il tampone S30A deve essere sterilizzato in autoclave e quindi raffreddato (4 °C) prima dell'uso. Il tampone DTT deve essere preparato e filtrato separatamente come indicato (in tubo da 15 ml) e conservato a -20 °C. Prima di utilizzare il buffer S30A, aggiungere 2 mL di DTT (da 1 M di stock) a 1 L di buffer S30A. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Elenco dei componenti per la preparazione della soluzione energetica. La quantità (in grammi) o il volume di ciascun componente è specificata (nella colonna G) per la preparazione di un volume specificato (nella colonna H) di soluzioni madre per la concentrazione indicata (nella colonna F). Il pH di ciascun componente deve essere regolato se necessario, come indicato (nelle colonne I e J). Lo stock di soluzione energetica 14x viene preparato mescolando il volume elencato di ciascun componente (nella colonna K) nell'ordine elencato. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Elenco dei componenti per la preparazione della soluzione madre di amminoacidi. Per la preparazione della soluzione madre di aminoacidi 4x, tutti gli amminoacidi devono essere miscelati nell'ordine elencato. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 5. Elenco dei componenti per la preparazione delle soluzioni di taratura del lisato. La quantità (in grammi) di Mg-glutammato e K-glutammato di soluzioni madre è specificata per preparare 50 mL della concentrazione indicata di ciascun tampone. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 6: Elenco dei ceppi batterici utilizzati in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 7: Elenco dei primer utilizzati in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 8: Plasmide utilizzato in questo protocollo per la calibrazione del lisato e come modello per l'amplificazione lineare del DNA mediante PCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 9: Conversione FITC ed eGFP. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Figura supplementare 1. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Qui, mostriamo che il lisato cellulare preparato da E. coli BL21 Rosetta2 con un knockout genomico per l'operone recB o recBCD supporta un'elevata espressione proteica da modelli lineari di DNA. Questo protocollo elabora una procedura di calibrazione del lisato passo-passo specifica per i modelli di DNA lineare (Figura 2), che è un passo critico che porta all'alta espressione da promotori σ70 nel DNA lineare, raggiungendo livelli vicini al plasmide per concentrazioni di DNA equimolare. Questo protocollo evidenzia l'importanza della calibrazione del tampone in base al tipo di DNA (lineare o plasmide) da utilizzare nell'applicazione finale.
Il protocollo può aiutare a evitare la clonazione del plasmide, che fornisce significativi guadagni in termini di tempo e costi. I frammenti di DNA lineare possono essere sintetizzati da fornitori commerciali e/o amplificati mediante PCR in laboratorio. Lo stesso processo utilizzando il DNA plasmidico richiederebbe almeno 1 settimana in più, tenendo conto della clonazione, della verifica della sequenza e delle fasi di preparazionedel DNA 10. Si raccomanda di preparare grandi volumi di estratti cellulari e modelli lineari di DNA per ridurre al minimo la variabilità da lotto a lotto tra gli esperimenti14,15.
Questo metodo ha dimostrato di essere robusto e utilizzato in tutti i laboratori10. I risultati di questi estratti sono stati coerenti tra repliche biologiche, diversi lotti di estratti e diversi ceppi10. La robustezza del protocollo è stata testata anche attraverso diversi parametri sperimentali: metodi di lisi cellulare, temperature, modelli di DNA e diverse concentrazioni di DNA. Il metodo è già stato utilizzato per lo screening rapido e la caratterizzazione di costrutti genetici per due applicazioni rilevanti: caratterizzazione della libreria toehold switch e screening dell'attività enzimatica10.
Sebbene in questo studio siano stati ottenuti alti livelli di espressione dal DNA lineare negli estratti di ΔrecB/ΔrecBCD dal ceppo parentale altamente produttivo E. coli BL21 Rosetta2, la metodologia richiederebbe l'ingegneria del genoma per un nuovo ceppo di interesse. Al contrario, l'integrazione con agenti protettivi per il DNA lineare, come GamS5 o Chi DNA6, è più facile da applicare per un nuovo ceppo, ma più costosa e richiede più tempo.
Il protocollo fornito qui faciliterà l'uso di modelli lineari di DNA in sistemi privi di cellule e accelererà i cicli di progettazione-costruzione-test per la comunità di biologia sintetica. Una più facile espressione senza cellule da modelli lineari di DNA negli estratti di ΔrecB/ΔrecBCD può essere implementata per la produzione di piccole molecole di interesse, biosimilari e altre applicazioni point-of-care on-demand.
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Disclosures
Nessuno
Acknowledgments
ACB e JLF riconoscono il sostegno finanziario della sovvenzione ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF e JB riconoscono il sostegno finanziario della sovvenzione ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA e JLF riconoscono il sostegno finanziario della sovvenzione ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB riconosce il sostegno del CER a partire da "COMPUCELL" (numero di sovvenzione 657579). Il Centre de Biochimie Structurale riconosce il sostegno dell'infrastruttura francese per la biologia strutturale integrata (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK riconosce il sostegno finanziario del dipartimento MICA dell'INRAe, dell'Université Paris-Saclay, della regione Ile-de-France (IdF) DIM-RFSI e di ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti attraverso il premio Consolidator Award (865973 to CLB) del Consiglio europeo della ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5?-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
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