Summary
这里介绍详细的免疫组织化学方案，用于鉴定、验证和靶向复杂组织中功能相关的半胱天冬酶。
Abstract
已知半胱天冬酶家族介导细胞死亡以外的许多细胞途径，包括细胞分化、轴突寻路和增殖。自从鉴定细胞死亡蛋白酶家族以来，一直在寻找工具来识别和扩展特定家族成员在发育、健康和疾病状态下的功能。然而，目前广泛使用的许多市售半胱天冬酶工具并非特定于靶向半胱天冬酶。在本报告中，我们描述了我们用于识别，验证和靶向神经系统中caspase-9的方法，该方法使用新型抑制剂和具有免疫组织化学读数的遗传方法。具体来说，我们使用视网膜神经元组织作为模型来识别和验证半胱天冬酶的存在和功能。该方法能够询问细胞类型特异性凋亡和非凋亡半胱天冬酶-9功能，并且可以应用于其他感兴趣的复杂组织和半胱天冬酶。了解半胱天冬酶的功能有助于扩展当前细胞生物学的知识，并且由于它们参与疾病，也有利于确定潜在的治疗靶点。
Introduction
半胱天冬酶是调节疾病1，2中发育细胞死亡，免疫反应和异常细胞死亡的蛋白酶家族。虽然众所周知，半胱天冬酶家族的成员在各种神经退行性疾病中被诱导，但了解哪种半胱天冬酶驱动疾病病理学更具挑战性3。此类研究需要工具来识别、表征和验证单个半胱天冬酶家族成员的功能。从机制和治疗的角度来看，解析相关的个体半胱天冬酶都很重要，因为文献中有多项研究提供了半胱天冬酶不同作用的证据4，5。因此，如果目标是针对疾病中的半胱天冬酶以获得治疗益处，那么针对相关家庭成员的特定目标至关重要。检测组织中半胱天冬酶水平的传统技术包括蛋白质印迹和酶法和荧光法3，6。然而，这些措施都不允许对半胱天冬酶水平进行细胞特异性检测，在某些情况下，裂解的半胱天冬酶通常无法通过传统的蛋白质分析措施检测到。众所周知，半胱天冬酶可以在同一组织中发挥不同的凋亡和非凋亡作用7，因此需要仔细表征细胞特异性半胱天冬酶水平，以准确了解发育和疾病途径。
这项研究显示了半胱天冬酶在神经血管缺氧缺血 - 视网膜静脉阻塞（RVO）模型中的激活和功能7，8。在视网膜等复杂组织中，有多种细胞类型可能受到 RVO 诱导的缺氧缺血的影响，包括神经胶质细胞、神经元和脉管系统7。在成年小鼠视网膜中，通过免疫组织化学（IHC）7测量，健康组织中半胱天冬酶的表达很少，但在发育过程中 情况并非如此9或视网膜疾病模型10，11。IHC是一种在生物医学研究中成熟的技术，可以验证疾病和病理靶点，通过空间定位和蛋白质量化来识别新角色。如果蛋白质印迹或荧光分析无法检测到裂解的半胱天冬酶产物，也无法通过定位检测不同半胱天冬酶的特定细胞位置或询问半胱天冬酶信号通路，则应使用IHC。
为了确定RVO中功能相关的半胱天冬酶，将IHC与经过验证的半胱天冬酶抗体和细胞标志物一起使用。先前在实验室进行的研究表明，半胱天冬酶-9在缺血性中风和半胱天冬酶-9的抑制模型中被迅速激活，具有高度特异性的抑制剂，可防止神经元功能障碍和死亡12。由于视网膜是中枢神经系统（CNS）的一部分，因此它可作为模型系统来查询和进一步研究半胱天冬酶-9在神经血管损伤中的作用13。为此，利用RVO小鼠模型研究半胱天冬酶-9的细胞特异性位置和分布及其在神经血管损伤中的意义。RVO是由血管损伤引起的工作年龄成年人失明的常见原因14。发现半胱天冬酶-9在内皮细胞中以非凋亡方式表达，但不在神经元中表达。
作为一种组织，视网膜的优点是可以可视化为平面安装，允许欣赏血管网络，或作为横截面，突出神经元视网膜层。横截面中半胱天冬酶蛋白表达的定量提供了背景，通过识别半胱天冬酶在视网膜中的定位，半胱天冬酶在视网膜神经元连接和视觉功能中具有潜在关键意义。在鉴定和验证之后，使用鉴定的半胱天冬酶的诱导细胞特异性缺失来实现目标半胱天冬酶的靶向。对于潜在的治疗查询，使用特定工具来抑制活化的半胱天冬酶来测试感兴趣的半胱天冬酶的相关性。对于半胱天冬酶-9，细胞通透性高选择性抑制剂7，15，使用Pen1-XBIR3。对于本报告，使用了具有C57BL / 6J背景的2个月大的男性C57BL / 6J菌株和他莫昔芬诱导的内皮半胱天冬酶-9敲除（iEC Casp9KO）菌株。这些动物暴露于RVO小鼠模型，C57BL / 6J用半胱天冬酶-9选择性抑制剂Pen1-XBir3处理。所描述的方法可以应用于中枢和外周系统中的其它疾病模型7，15。
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Protocol
该协议遵循视觉和眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。啮齿动物实验由哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准和监测。
1.视网膜组织的制备和冷冻切片
- 通过给予腹膜内麻醉（氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（5-10mg / kg））对动物实施安乐死，并使用蠕动泵用4%多聚甲醛（PFA）灌注接受RVO的小鼠（详见8 ）。
注意：在进行安乐死和灌注之前，用脚趾捏住动物以确认麻醉深度。有关灌注的详细信息可以在16中找到。 - 使用镊子小心地摘除眼球来收获眼睛，并将眼球放入 1 mL 的 4% PFA 中。将眼睛在4°C下放置过夜。 清洗眼睛三次，持续10分钟，加入1mL的1x PBS并将它们放入摇床中。
- 将眼睛浸入 1 mL 的 30% 蔗糖中 3 天，直到它们沉降到管底部，表明蔗糖的吸收。
- 使用30 G注射器用最佳切割温度化合物填充眼睛，直到眼睛具有圆形外观（约50μL）。
- 将眼睛嵌入具有最佳切割温度化合物的冷冻机中，直到眼睛被覆盖并在-80°C下冷冻，直到准备冷冻切片。
- 切片使用低温恒温器将20μm的眼睛嵌入载玻片上。
- 从低温模架上取出最佳切割温度的化合物块。
- 通过添加最佳切割温度化合物并将其放在卡盘上，将其放在低温恒温器卡盘上。将其留在低温恒温器内，直到冻结。
- 继续在20μm处切割块，直到看到视网膜组织。
注意：这可以用30倍放大倍率的光学显微镜（3倍物镜，10倍目镜）确认。组织可以通过颜色和形状与OCT培养基区分开来。 - 在显微镜载玻片中收集视网膜组织，每张载玻片四个部分。
注意：有关视网膜切片的建议放置，请参见 图1A 。
- 使用对治疗和基因型进行去标识化的 ID 标记载玻片。
- 将载玻片储存在-20°C直至染色。
2. 免疫组化
注意：使用固定的冷冻保存组织进行免疫组织化学以维持细胞形态。选择在 体内7中获取的光学相干断层扫描（OCT）图像水平的部分。使用从低温恒温器或从150μm到视网膜组织的切片收集的前两个系列的载玻片。
- 将载玻片放在黑暗潮湿的载玻片室中。
- 透化和阻塞：用 300 μL 1x PBS 洗涤视网膜横截面 5 分钟以去除 OCT 并在之后丢弃。
- 通过在室温（RT）下加入300μL的1x PBS和0.1%Triton X-1002小时来透化组织，然后丢弃。
- 通过加入 300 μL 封闭缓冲液（10% 正常山羊血清 （NGS）、1% 牛血清白蛋白 （BSA） 在 1x PBS 中，过滤）封闭组织，并在 4 °C 下放置过夜。
- 一抗：在封闭缓冲液中稀释一抗。使用的一抗包括1：800的抗cl-半胱天冬酶-9，1：50的抗CD31和1：150的抗半胱天冬酶-7-488（直接标记抗体）。
注意：遵循制造商的建议，适当稀释一抗。- 将封闭缓冲液从切片上倒出，并将 100 μL 一抗混合物涂在视网膜载玻片上。
- 将横截面在4°C孵育过夜。
- 用 300 μL 1x PBS 洗涤切片四次，持续 5 分钟。
注意：如果组织切片非常脆弱，则应使用毛细管作用将纸巾涂在载玻片的角落，以避免视网膜切片移位。 - 为避免在同一宿主物种中产生的一抗交叉标记，请在应用直接标记的抗体之前用二抗完成染色。
- 二抗：将二抗稀释在封闭缓冲液中，浓度为0.1%。例如，要检测抗cl-caspase-9（一种在兔子中产生的抗体），请使用山羊抗兔-568 次级。
- 将 200 μL 二抗混合物涂于视网膜上。
- 将组织在室温下孵育2小时。
- 用 300 μL 1x PBS 洗涤切片四次，持续 5 分钟。
- 用 300 μL DAPI 以 0.02% 的稀释度对细胞核染色 5 分钟。
- 用 300 μL 1x PBS 洗涤一次 5 分钟。
- 使用 500 μL 氟卡口-G 培养基将盖玻片放在视网膜切片上，以保留荧光信号，并小心地将盖玻片放在载玻片顶部，避免气泡。
3. 共聚焦成像
- 用共聚焦显微镜采集染色切片的图像。
- 打开共聚焦显微镜。
- 将幻灯片放在载物台上。
- 调整焦点以清楚地看到视网膜部分。
注意：每个切片至少拍摄四张图像，每个视网膜拍摄四张图像。有关建议的成像区域，请参阅视网膜成像示意图（图1B，C）。
- 使用具有Z-stack采集功能的共聚焦显微镜，使用20x或40x物镜对半胱天冬酶，血管和核染色进行成像。
注意：实验中所有成像的成像参数和软件设置应该是恒定的。20倍物镜提供了视网膜层的概述，这些层由核染色明确定义。40倍物镜提供更多蜂窝细节。- 通过单击 采集设置为每个通道设置适当的曝光和激光强度时间。
- 通过单击 Z 系列设置 Z 堆栈以可视化整个切片，并设置向上和向下参数以覆盖组织的深度。
- 按照冷冻切片期间分配的屏蔽ID保存图像。
4. 半胱天冬酶水平的定量
- 将 405、470、555 和 640 通道的图像文件拖到 FIJI 的控制台。
- 单击“ 图像>颜色”>合并通道。
- 按如下方式为文件指定颜色：红色为 555，绿色为 470，灰色为 405，青色为 640。
- 通过单击图像 >堆栈> Z 项目来压缩 Z 堆栈。
- 单击 投影类型：最大强度。
- 通过单击打开通道界面 >颜色通道 工具。
- 打开 亮度和对比度 界面。
- 选择 每个通道的参数。
- 转到频道，然后选择一个 频道 。
- 将光标放在半胱天冬酶表达的单元格顶部并注释像素值。
- 将光标放在背景顶部并注释像素值。
- 测试参数
- 转到 亮度和对比度界面。
- 单击 “选择”。
- 插入最小显示值（半胱天冬酶表达细胞的注释像素值）。
- 插入最大显示值（背景的带注释的像素值）。
- 单击“ 确定”。
- 对所有通道重复步骤 4.8-4.9。
- 通过从盲组织中选择随机图像来测试参数。
注意：仅当背景值不足以用于其他图像时，才编辑亮度和对比度参数。 - 设置参数后，打开图像文件并压缩 Z 堆栈。
- 添加半胱天冬酶通道和异凝集素、血管标志物通道的亮度和对比度参数。
- 使用点工具使用血管标志物与半胱天冬酶表达的共定位作为阳性区域的读数来量化血管阳性区域的数量。
- 重复步骤4.14，但使用Hoechst作为神经元阳性区域的标记。
- 为每个图像在电子表格上注释值。
- 按部分平均值。
- 平均截面值 - 这将是每只眼睛的读数。
5. 内皮细胞半胱天冬酶-9相关性的遗传确认
- 使用从接受RVO7的Casp9FL / FL-VECad-CreERT2小鼠获得的视网膜。
- 如上文第 2 节所述，对视网膜进行半胱天冬酶-9（缺失的半胱天冬酶）、半胱天冬酶-7（一种下游效应半胱天冬酶）、血管标志物和 DAPI 的免疫染色。
- 成像和量化，如上文第 3 节和第 4 节所述。
6. 靶向RVO中的半胱天冬酶-9
- 从接受RVO的小鼠获得眼睛，然后像7一样将半胱天冬酶-9抑制剂Pen1-XBir3局部应用于眼睛。
- 对视网膜进行免疫染色，以检测半胱天冬酶-7（一种下游效应半胱天冬酶）、血管标志物和 DAPI，如上文第 2 节所述。
- 成像和量化，如上文第 3 节和第 4 节所述。
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Representative Results
所述协议允许用户分析和量化视网膜组织中的半胱天冬酶-9水平。此外，它还提供了进一步鉴定、验证和特异性靶向半胱天冬酶-9和下游底物的工具。总结的步骤允许对荧光显微照片中的半胱天冬酶水平和细胞特异性进行可量化分析。所有图均显示了代表性的显微照片和未受伤和 1 天 P-RVO 视网膜横截面中总视网膜、内皮细胞和神经元中指示的半胱天冬酶水平的量化。视网膜横截面允许在用 Hoechst 染色时可视化视网膜神经节层 （RGL）、内核层 （INL） 和外核层 （ONL） 中的视网膜核。此外，视网膜血管在视网膜丛状层中或RGL和INL之间以及INL和ONL之间可见。由于血管的组织学性质，当视网膜被切片时，血管将呈现为断开和分离，为丛状层提供。 图2 将半胱天冬酶-9确定为高度调节的1天P-RVO。 图3 通过使用诱导的内皮细胞敲除小鼠验证了内皮半胱天冬酶-9的功能相关性。 图4 显示靶向活性半胱天冬酶-9药理学阻断半胱天冬酶-9-半胱天冬酶-7下游靶标的诱导。该协议识别半胱天冬酶的细胞定位和半胱天冬酶表达的神经元视网膜层。
图1：视网膜成像方案 。 （A）建议在显微镜载玻片中放置视网膜切片。（B）视网膜成像区域的概述。（C）在20倍物镜下表示视网膜视图。视网膜层：RGL = 视网膜神经节层，INL = 内核层，ONL = 外核层。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：RVO 在内皮细胞和神经元中诱导半胱天冬酶-9。 （A） 未受伤和用 cl-caspase-9 1：800（绿色）、异凝集素 1：200（红色）和 DAPI（白色）染色的 1 天 P-RVO 的代表性视网膜横截面。（B）用cl-caspase-9定量神经元的数量（有关抗体的详细信息，请参见 材料表 ）。（C）用cl-半胱天冬酶-9定量内皮细胞的数量。（D）表达cl-半胱天冬酶-9的细胞总数。未受伤，n = 6;1 天 P-RVO，n = 5。误差线表示 SEM ±平均值;单因素方差分析，费舍尔LSD测试。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：内皮半胱天冬酶-9 的内皮细胞缺失阻断半胱天冬酶-7 的 RVO 诱导。 （A） iEC Casp9WT 和 iEC Casp9KO 同窝小鼠 1 天 P-RVO 的代表性视网膜横截面，用半胱天冬酶-7（绿色）、cl-半胱天冬酶-9（蓝色）、CD31、血管标志物（红色）和 DAPI（白色）染色。（B）用cl-半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-7量化视网膜内细胞的数量。（C）用cl-半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-7定量内皮细胞的数量。（D）表达cl-半胱天冬酶-9或半胱天冬酶-7的细胞总数。iEC Casp9WT， n = 6-12;iEC Casp9KO， n = 3-8.误差线表示 SEM ±平均值;单因素方差分析，费舍尔LSD测试。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：半胱天冬酶-9活性的抑制抑制半胱天冬酶-7表达P-RVO。 （A）未受伤和未用Pen1-XBIR3处理或未处理的1天P-RVO的代表性视网膜横截面，用半胱天冬酶-7（绿色），异凝集素（红色）和DAPI（白色）染色。（B）用半胱天冬酶-7定量内皮细胞的数量。（C）用半胱天冬酶-7定量白细胞的数量。（D）用半胱天冬酶-7量化每个神经元层的神经元数量。（E）表达半胱天冬酶-7的细胞总数。未受伤的笔1盐水，n = 6;未受伤的Pen1-XBIR3，n = 5;1天P-RVO笔1盐水，n = 5;1 天 P-RVO Pen1-XBIR3，n = 3。误差线表示 SEM ±平均值;单因素方差分析，费舍尔LSD测试。缩写：RGL = 视网膜神经节层，INL = 内核层，ONL = 外核层。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
半胱天冬酶是一个多成员蛋白酶家族，最好研究它们在细胞死亡和炎症中的作用;然而，最近发现了一些家庭成员的各种非死亡功能4，5。我们对半胱天冬酶功能的大部分理解来自细胞培养的工作和人类疾病的推断数据。虽然可以理解半胱天冬酶在疾病中的异常诱导、激活或失活，但从功能上确定半胱天冬酶是否驱动疾病病理一直具有挑战性。许多用于评估特定半胱天冬酶的工具可检测多个家族成员，从而削弱了使用这些试剂获得的数据的功能相关性17。在这里，我们提供了一个以视网膜为例来研究复杂组织中的半胱天冬酶的方案。在神经系统中，半胱天冬酶表达在产前和产后下调。这允许使用特异性抗体来测试疾病模型中半胱天冬酶水平的变化。
虽然该协议的重点是图像处理和分析，但该技术的成功还依赖于仔细的组织制备，以及IHC和显微成像，以确保数据的一致性，有效性和可靠性。必须注意使用相同的参数对整个数据集进行成像。图像质量差、对比度低和焦点模糊将无法提供可靠的数据。在对视网膜的P-RVO区域进行切片和成像时，应避免撕裂和折叠，因为这些区域可能会导致伪影。还应避免直接损坏的区域。进行成像的研究者需要对组织的治疗不知情。为了进行分析，建议两名对治疗组不知情的独立观察者进行分析。此外，小鼠一抗不应用于小鼠损伤模型，因为二抗与脉管系统非特异性结合。另一种方法是使用直接偶联的一抗。
细胞计数的另一种方法是定量表达面积的百分比。当无法进行细胞计数时（例如，如果半胱天冬酶表达局限于神经元过程或感光器片段），则可以使用。在各种损伤模型中，中央和周边视网膜受到的影响不同。该方法可以适用于专门分析不同的视网膜区域。如果进行BRVO，则应从眼睛的受伤部分选择切片。该协议还提供了不同细胞标志物的染色，以确定半胱天冬酶的表达位置。
该方法的局限性包括它不能区分给定细胞中高水平和低水平的半胱天冬酶信号。此外，使用核染色来识别神经元层很方便，但不能明确指示神经元表达（神经胶质细胞和白细胞也存在于这些层中）。其他神经元标记可用于验证神经元表达。还有多种抗体可用于评估半胱天冬酶表达;这些抗体最适合人半胱天冬酶-9，其中有全长/裂解（CL）半胱天冬酶-9、自裂半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3-裂解半胱天冬酶-9的抗体。
IHC信号的平均强度经常被报告为一种量化方法。然而，来自红细胞的背景噪音或自发荧光会产生不准确的结果。细胞特异性定量可以测定和区分背景、非特异性染色和自发荧光。
该协议可用于测量单个半胱天冬酶表达的组织范围变化，特定细胞类型（例如内皮细胞）中表达的变化以及特定位置的特定细胞类型的变化，例如不同视网膜层中的神经元。这种灵活性允许实验者查询疾病状态如何改变单个半胱天冬酶水平。现有/替代方法使用蛋白质印迹分析进行半胱天冬酶信号传导的半定量比较，尽管该方法不会提供该协议所获得的细胞定位的明确分离。值得注意的是，在 图3D中，与RGL相比，半胱天冬酶-9抑制在减少INL和ONL中的神经元半胱天冬酶-9方面更有效。这种分辨率很难通过其他方法实现。此外，当对整个组织进行生化分析时，变化的半胱天冬酶水平可能太低而无法拾取，因为复杂组织中有许多不同的细胞类型。
抗体必须由用户验证，为探测的半胱天冬酶提供特异性。半胱天冬酶可以级联作用（即，引发剂激活效应，然后导致结果 - 死亡，炎症，细胞信号传导）。该协议可用于在损坏后不同时间点收集的样本;在这里给出的示例中，样本是在RVO后的不同时间收集的。在先前发表的工作中，已经发现半胱天冬酶-9在RVO7后1小时内增加，这导致了进一步的验证和靶向研究。在确定内皮半胱天冬酶-9作为RVO病理学的潜在驱动因素后，使用具有诱导性内皮细胞半胱天冬酶-9KO的小鼠来验证内皮半胱天冬酶-9。使用诱导细胞特异性半胱天冬酶KO小鼠提供了另一个级别的特异性，并避免了组成型半胱天冬酶-9KO18所见的发育死亡。它还避免了其他家庭成员的代偿性变化，这些变化已被证明发生在组成型半胱天冬酶KO小鼠19中。此外，使用细胞特异性诱导半胱天冬酶KO小鼠可以鉴定半胱天冬酶调节组织中病理的细胞类型。该协议还提供了询问治疗方法疗效的步骤，靶向RVO中的活性半胱天冬酶-9。这种方法也可以应用于其他组织，包括大脑。
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Disclosures
作者声明以下竞争利益：C.M.T.拥有以下专利申请US20200164026，US20190142915和US20150165061。C.M.T.和S.S.在美国20140024597拥有专利申请。C.M.T.、A.M.P.和M.I.A.拥有US2020058683的专利申请。C.M.T.和YJ的专利申请为WO2018013519。M.I.A和C.M.T在纽约市哥伦比亚大学受托人的专利申请WO/2020/223212中被列为发明人。其余作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划（NSF-GRFP）资助DGE - 1644869和美国国立卫生研究院（NIH）国家神经疾病和中风研究所（NINDS）的支持，奖励号F99NS124180 NIH NINDS多样性专业F99（CKCO），国家眼科研究所（NEI）5T32EY013933（AMP），国家神经系统疾病和中风研究所（RO1 NS081333， R03 NS099920 to CMT）和国防部陆军/空军（DURIP到CMT）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
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