Summary
Hier wird ein detailliertes immunhistochemisches Protokoll vorgestellt, um funktionell relevante Caspasen in komplexen Geweben zu identifizieren, zu validieren und gezielt anzugehen.
Abstract
Es ist bekannt, dass die Familie der Caspasen viele zelluläre Wege über den Zelltod hinaus vermittelt, einschließlich Zelldifferenzierung, axonaler Wegfindung und Proliferation. Seit der Identifizierung der Familie der Zelltodproteasen wurde nach Werkzeugen gesucht, um die Funktion bestimmter Familienmitglieder in Entwicklungs-, Gesundheits- und Krankheitszuständen zu identifizieren und zu erweitern. Viele der derzeit kommerziell erhältlichen Caspase-Tools, die weit verbreitet sind, sind jedoch nicht spezifisch für die angestrebte Caspase. In diesem Bericht beschreiben wir den Ansatz, den wir verwendet haben, um Caspase-9 im Nervensystem unter Verwendung eines neuartigen Inhibitors und genetischer Ansätze mit immunhistochemischen Auslesungen zu identifizieren, zu validieren und anzugreifen. Insbesondere haben wir das retinale neuronale Gewebe als Modell verwendet, um das Vorhandensein und die Funktion von Caspasen zu identifizieren und zu validieren. Dieser Ansatz ermöglicht die Abfrage zelltypspezifischer apoptotischer und nicht-apoptotischer Caspase-9-Funktionen und kann auf andere komplexe Gewebe und Caspasen von Interesse angewendet werden. Das Verständnis der Funktionen von Caspasen kann dazu beitragen, das aktuelle Wissen in der Zellbiologie zu erweitern, und kann auch vorteilhaft sein, um potenzielle therapeutische Ziele aufgrund ihrer Beteiligung an Krankheiten zu identifizieren.
Introduction
Die Caspasen sind eine Familie von Proteasen, die den Entwicklungszelltod, die Immunantwort und den aberranten Zelltod bei Krankheit 1,2 regulieren. Obwohl bekannt ist, dass Mitglieder der Caspase-Familie bei einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen induziert werden, ist es schwieriger zu verstehen, welche Caspase die Krankheitspathologie antreibt3. Solche Studien erfordern Werkzeuge, um die Funktion einzelner Caspase-Familienmitglieder zu identifizieren, zu charakterisieren und zu validieren. Die Analyse der relevanten einzelnen Caspasen ist sowohl aus mechanistischer als auch aus therapeutischer Sicht wichtig, da die Literatur mehrere Studien enthält, die die vielfältigen Rollen von Caspasen belegen 4,5. Wenn das Ziel also darin besteht, eine Caspase bei einer Krankheit für einen therapeutischen Nutzen zu nutzen, ist es wichtig, die relevanten Familienmitglieder gezielt anzusprechen. Traditionelle Techniken zum Nachweis von Caspase-Spiegeln im Gewebe umfassen Western Blotting und enzymatische und fluorometrische Ansätze 3,6. Keine dieser Maßnahmen ermöglicht jedoch einen zellspezifischen Nachweis von Caspase-Spiegeln, und in einigen Szenarien können gespaltene Caspasen oft nicht durch herkömmliche Proteinanalysemaßnahmen nachgewiesen werden. Es ist bekannt, dass Caspasen unterschiedliche apoptotische und nicht-apoptotische Rollen im selben Gewebe spielen können7, daher ist eine sorgfältige Charakterisierung der zellspezifischen Caspase-Spiegel erforderlich, um die Entwicklungs- und Krankheitswege genau zu verstehen.
Diese Studie zeigt die Aktivierung und Funktion von Caspase in einem Modell der neurovaskulären Hypoxie-Ischämie - retinale Venenokklusion (RVO)7,8. In einem komplexen Gewebe wie der Netzhaut gibt es mehrere Zelltypen, die von der bei RVO induzierten Hypoxie-Ischämie betroffen sein können, einschließlich Gliazellen, Neuronen und Gefäßsystem7. In der adulten Netzhaut der Maus gibt es sehr wenig Expression von Caspasen in gesundem Gewebe, gemessen durch Immunhistochemie (IHC)7, aber das ist nicht der Fall während der Entwicklung9 oder in Modellen der Netzhauterkrankung10,11. IHC ist eine Technik, die in der biomedizinischen Forschung gut etabliert ist und die Validierung von Krankheits- und pathologischen Zielen, die Identifizierung neuer Rollen durch räumliche Lokalisierung und die Quantifizierung von Proteinen ermöglicht hat. In Fällen, in denen gespaltene Caspase-Produkte nicht durch Western Blot oder fluorometrische Analyse nachgewiesen werden können, noch die spezifische Zellposition verschiedener Caspasen oder die Abfrage von Caspase-Signalwegen durch Lokalisierung, sollte IHC verwendet werden.
Um die Caspase(n) funktionell relevant in RVO zu bestimmen, wurde IHC mit validierten Antikörpern für Caspasen und zelluläre Marker verwendet. Die früheren Studien, die im Labor durchgeführt wurden, zeigten, dass Caspase-9 in einem Modell des ischämischen Schlaganfalls und der Hemmung von Caspase-9 mit einem hochspezifischen Inhibitor, der vor neuronaler Dysfunktion und Tod geschützt war, schnell aktiviert wurde12. Da die Netzhaut Teil des zentralen Nervensystems (ZNS) ist, dient sie als Modellsystem, um die Rolle von Caspase-9 bei neurovaskulären Verletzungen abzufragen und weiter zu untersuchen13. Zu diesem Zweck wurde das Mausmodell von RVO verwendet, um die zellspezifische Lage und Verteilung von Caspase-9 und seine Bedeutung für neurovaskuläre Verletzungen zu untersuchen. RVO ist eine häufige Ursache für Erblindung bei Erwachsenen im erwerbsfähigen Alter, die auf eine Gefäßverletzung zurückzuführenist 14. Es wurde festgestellt, dass Caspase-9 in Endothelzellen nicht-apoptotisch exprimiert wurde, aber nicht in Neuronen.
Als Gewebe hat die Netzhaut den Vorteil, dass sie entweder als Flatmount visualisiert wird, was eine Wahrnehmung der vaskulären Netzwerke ermöglicht, oder als Querschnitte, die die neuronalen Netzhautschichten hervorheben. Die Quantifizierung der Caspase-Proteinexpression in Querschnitten liefert den Kontext, welcher Caspase potenziell entscheidend für die neuronale Konnektivität und Sehfunktion der Netzhaut ist, indem die Lokalisation der Caspase(n) in der Netzhaut identifiziert wird. Nach der Identifizierung und Validierung wird das Targeting der interessierenden Caspase durch induzierbare zellspezifische Deletion der identifizierten Caspase erreicht. Für mögliche therapeutische Fragestellungen wurde die Relevanz der interessierenden Caspasen mit spezifischen Werkzeugen zur Hemmung der aktivierten Caspase getestet. Für Caspase-9 wurde ein zellpermierter hochselektiver Inhibitor 7,15, Pen1-XBIR3 verwendet. Für diesen Bericht wurden 2 Monate alter, männlicher C57BL/6J-Stamm und Tamoxifen-induzierbarer endothelialer Caspase-9-Knockout-Stamm (iEC Casp9KO) mit einem C57BL/6J-Hintergrund verwendet. Diese Tiere wurden dem Mausmodell von RVO ausgesetzt und C57BL/6J wurde mit dem selektiven Caspase-9-Inhibitor Pen1-XBir3 behandelt. Die beschriebene Methodik kann auf andere Krankheitsmodelle im zentralen und peripheren System angewendet werden 7,15.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Nagetierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Columbia University genehmigt und überwacht.
1. Vorbereitung von Netzhautgewebe und Kryosektion
- Euthanasieren Sie die Tiere durch Verabreichung von intraperitonealer Anästhesie (Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg)) und perfundiert die Mäuse, die einer RVO unterzogen wurden (siehe8 für Einzelheiten) mit 4% Paraformaldehyd (PFA) unter Verwendung einer Peristaltikpumpe.
HINWEIS: Kneifen Sie das Tier zusammen, um die Tiefe der Anästhesie zu bestätigen, bevor Sie mit der Euthanasie und Perfusion fortfahren. Details zur Perfusion finden Sie in16. - Ernten Sie die Augen durch sorgfältige Enukleation mit einer Pinzette und geben Sie den Globus in 1 ml 4% PFA. Lassen Sie die Augen über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie die Augen dreimal für 10 Minuten, fügen Sie 1 ml 1x PBS hinzu und legen Sie sie in den Shaker.
- Tauchen Sie die Augen 3 Tage lang in 1 ml 30% Saccharose, bis sie sich auf dem Boden der Röhre absetzen, was auf eine Absorption der Saccharose hinweist.
- Füllen Sie die Augen mit einer 30-G-Spritze mit optimaler Schnitttemperatur, bis das Auge ein abgerundetes Aussehen hat (ca. 50 μL).
- Die Augen in ein Kryofell mit optimaler Schnitttemperatur einbetten, bis die Augen bedeckt sind, und bei -80 °C einfrieren, bis sie zur Kryosektion bereit sind.
- Schnitt bettete die Augen in 20 μm mit einem Kryostaten auf Glasobjektträger ein.
- Entfernen Sie den optimalen Schneidtemperatur-Verbundblock aus der Kryoform.
- Legen Sie es auf das Kryostatfutter, indem Sie eine optimale Schneidtemperaturverbindung hinzufügen und den Block auf das Spannfutter legen. Lassen Sie es im Kryostaten, bis es gefriert.
- Fahren Sie fort, den Block bei 20 μm zu schneiden, bis das Netzhautgewebe zu sehen ist.
HINWEIS: Dies kann mit einem Lichtmikroskop bei 30-facher Vergrößerung (3x Objektiv, 10x Okulare) bestätigt werden. Gewebe können von den OCT-Medien durch Farbe und Form unterschieden werden. - Sammeln Sie das Netzhautgewebe in Objektträgern in einer Reihe von vier Abschnitten pro Objektträger.
HINWEIS: Siehe Abbildung 1A für die empfohlene Platzierung von Netzhautabschnitten.
- Beschriften Sie die Objektträger mit einer ID, die die Behandlung und den Genotyp anonymisiert.
- Lagern Sie die Objektträger bis zur Färbung bei -20 °C.
2. Immunhistochemie
HINWEIS: Verwenden Sie festes kryokonserviertes Gewebe für die Immunhistochemie, um die Zellmorphologie aufrechtzuerhalten. Wählen Sie Abschnitte, die sich auf der Ebene der in vivo aufgenommenen Bilder der optischen Kohärenztomographie (OCT) befinden 7. Verwenden Sie die ersten beiden Objektträgerserien, die aus dem Kryostaten oder Abschnitten von 150 μm in das Netzhautgewebe gesammelt wurden.
- Legen Sie die Dias in eine dunkle und feuchte Objektträgerkammer.
- Permeabilisierung und Blockierung: Waschen Sie die Netzhautquerschnitte mit 300 μL 1x PBS für 5 min, um das OCT zu entfernen und anschließend zu entsorgen.
- Permeabilisieren Sie das Gewebe durch Zugabe von 300 μL 1x PBS mit 0,1% Triton X-100 für 2 h bei Raumtemperatur (RT) und verwerfen Sie es danach.
- Blockieren Sie das Gewebe durch Zugabe von 300 μL Blockierpuffer (10% normales Ziegenserum (NGS), 1% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS, gefiltert) und lassen Sie es über Nacht bei 4 °C stehen.
- Primäre Antikörper: Verdünnen Sie primäre Antikörper im Blockierungspuffer. Primäre Antikörper sind Anti-Cl-Caspase-9 bei 1:800, Anti-CD31 bei 1:50 und Anti-Caspase-7-488 (direkt markierter Antikörper) bei 1:150.
HINWEIS: Befolgen Sie die Empfehlung des Herstellers für die geeignete Verdünnung der primären Antikörper.- Gießen Sie die blockierenden Pufferabschnitte ab und tragen Sie 100 μL des primären Antikörpercocktails auf die Netzhautobjektträger auf.
- Die Querschnitte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Abschnitte viermal für 5 min mit 300 μL 1x PBS.
HINWEIS: Wenn die Gewebeabschnitte sehr zerbrechlich sind, sollten Waschungen kapillar entfernt werden, indem ein Gewebe auf die Ecke des Objektträgers aufgetragen wird, um eine Verschiebung der Netzhautabschnitte zu vermeiden. - Um eine Kreuzmarkierung von primären Antikörpern zu vermeiden, die in derselben Wirtsspezies aufgezogen wurden, schließen Sie die Färbung mit sekundären Antikörpern ab, bevor Sie die direkt markierten Antikörper auftragen.
- Sekundäre Antikörper: Verdünnen Sie die sekundären Antikörper im Blockierpuffer bei einer Konzentration von 0,1%. Um beispielsweise Anti-Cl-Caspase-9, einen Antikörper, der bei Kaninchen gezüchtet wurde, nachzuweisen, verwenden Sie Ziegen-Anti-Kaninchen-568 sekundär.
- Tragen Sie 200 μL des sekundären Antikörpercocktails auf die Netzhaut auf.
- Inkubieren Sie das Gewebe für 2 h bei RT.
- Waschen Sie die Abschnitte viermal für 5 min mit 300 μL 1x PBS.
- Färben Sie die Kerne für 5 min mit 300 μL DAPI in einer Verdünnung von 0,02%.
- Einmal für 5 min mit 300 μL 1x PBS waschen.
- Legen Sie ein Deckglas mit 500 μL Fluoromount-G-Medien auf die Netzhautabschnitte, wodurch das Fluoreszenzsignal erhalten bleibt, und legen Sie das Deckglas vorsichtig auf die Oberseite des Objektträgers, um Blasen zu vermeiden.
3. Konfokale Bildgebung
- Nehmen Sie Bilder der gefärbten Abschnitte mit konfokaler Mikroskopie auf.
- Schalten Sie das konfokale Mikroskop ein.
- Platzieren Sie die Folie auf der Bühne.
- Passen Sie den Fokus an, um den Netzhautschnitt klar zu sehen.
HINWEIS: Nehmen Sie mindestens vier Bilder pro Abschnitt und vier Abschnitte pro Netzhaut auf. Vorgeschlagene Bildgebungsbereiche finden Sie im Schema der Netzhautbildgebung (Abbildung 1B, C).
- Bildkaspase, vaskuläre und nukleare Färbung mit einem konfokalen Mikroskop mit Z-Stack-Erfassung unter Verwendung eines 20x- oder 40x-Objektivs.
HINWEIS: Die Bildgebungsparameter und die Softwareeinrichtung sollten für alle Bildgebungsverfahren in einem Experiment konstant sein. Das 20x-Objektiv gibt einen Überblick über die Netzhautschichten, die durch die Kernfärbung gut definiert sind. Das 40x-Objektiv bietet mehr zelluläre Details.- Stellen Sie die entsprechenden Belichtungs- und Laserintensitätszeiten pro Kanal ein, indem Sie auf Einstellungen für die Erfassung klicken.
- Stellen Sie den Z-Stack ein, um den gesamten Abschnitt zu visualisieren, indem Sie auf die Z-Serie klicken und die Parameter nach oben und unten einstellen, um die Tiefe des Gewebes abzudecken.
- Speichern Sie die Bilder nach der maskierten ID, die während der Kryosektion zugewiesen wurde.
4. Quantifizierung des Caspase-Gehalts
- Ziehen Sie Bilddateien von 405, 470, 555 und 640 Kanälen auf die FIJI-Konsole.
- Klicken Sie auf Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen.
- Weisen Sie den Dateien Farben wie folgt zu: Rot zu 555, Grün zu 470, Grau zu 405, Cyan zu 640.
- Komprimieren Sie den Z-Stapel, indem Sie auf Bild > Stapel > Z-Projekt klicken.
- Klicken Sie auf Projektionstyp: Max. Intensität.
- Öffnen Sie die Kanalschnittstelle, indem Sie auf das Werkzeug Bild- > Farbkanäle klicken.
- Öffnen Sie die Benutzeroberfläche Helligkeit und Kontrast .
- Wählen Sie Parameter pro Kanal aus.
- Gehen Sie zu Kanäle und wählen Sie einen Kanal aus.
- Setzen Sie den Cursor auf die Caspase-ausgedrückte Zelle, und kommentieren Sie den Pixelwert.
- Platzieren Sie den Cursor über dem Hintergrund und kommentieren Sie den Pixelwert.
- Prüfparameter
- Gehen Sie zur Benutzeroberfläche Helligkeit und Kontrast.
- Klicken Sie auf Auswählen.
- Geben Sie den angezeigten Mindestwert ein (kommentierter Pixelwert der Caspase-ausgedrückten Zelle).
- Fügen Sie den maximal angezeigten Wert (kommentierter Pixelwert des Hintergrunds) ein.
- Klicken Sie auf OK.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.8-4.9 für alle Kanäle.
- Testen Sie die Parameter, indem Sie zufällige Bilder von verblindetem Gewebe auswählen.
HINWEIS: Bearbeiten Sie Helligkeits- und Kontrastparameter nur, wenn der Hintergrundwert für andere Bilder nicht ausreicht. - Sobald die Parameter eingestellt sind, öffnen Sie die Bilddateien und komprimieren Sie den Z-Stack.
- Fügen Sie die Helligkeits- und Kontrastparameter für den Caspase-Kanal und den Isolectin-Gefäßmarkerkanal hinzu.
- Verwenden Sie das Punktwerkzeug, um die Anzahl der vaskulären positiven Bereiche zu quantifizieren, indem Sie die Kolokalisierung des vaskulären Markers mit Caspase-Expression als Auslesen positiver Bereiche verwenden.
- Wiederholen Sie Schritt 4.14, verwenden Sie jedoch Hoechst als Marker für neuronal positive Bereiche.
- Kommentieren Sie die Werte in einer Tabelle pro Bild.
- Mittelwert der Werte nach Abschnitt.
- Mittelwert der Abschnittswerte - dies ist die Anzeige pro Auge.
5. Genetische Bestätigung der Relevanz der Endothelzelle Caspase-9
- Verwenden Sie Netzhäute, die von den Casp9FL/FL-VECad-CreERT2-Mäusen erhalten wurden, die RVO7 ausgesetzt wurden.
- Immunfärbung der Netzhaut für Caspase-9 (die gelöschte Caspase), Caspase-7 (ein nachgeschalteter Effektor Caspase), vaskuläre Marker und DAPI, wie oben in Abschnitt 2 beschrieben.
- Bild und Quantifizierung wie oben in den Abschnitten 3 und 4 beschrieben.
6. Caspase-9 in RVO ins Visier nehmen
- Die Augen der Mäuse, die einer RVO unterzogen wurden, erhalten und anschließend den Caspase-9-Inhibitor Pen1-XBir3 topisch auf die Augen auftragen, wie in7.
- Immunfärbung der Netzhaut für Caspase-7 (ein nachgeschalteter Effektor Caspase), vaskuläre Marker und DAPI, wie oben in Abschnitt 2 beschrieben.
- Bild und Quantifizierung wie oben in den Abschnitten 3 und 4 beschrieben.
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Representative Results
Das beschriebene Protokoll ermöglicht es dem Benutzer, Caspase-9-Spiegel im Netzhautgewebe zu analysieren und zu quantifizieren. Darüber hinaus werden Werkzeuge vorgestellt, um Caspase-9 und nachgeschaltete Substrate weiter zu identifizieren, zu validieren und spezifisch anzusprechen. Die zusammengefassten Schritte ermöglichen eine quantifizierbare Analyse des Caspase-Spiegels und der zellulären Spezifität in fluoreszierenden Mikroaufnahmen. Alle Abbildungen zeigen repräsentative Mikroaufnahmen und Quantifizierungen der angezeigten Caspase-Spiegel in der gesamten Netzhaut, Endothelzellen und Neuronen in unverletzten und 1-Tages-P-RVO-Netzhautquerschnitten. Der Netzhautquerschnitt ermöglicht die Visualisierung von Netzhautkernen in der retinalen Ganglienschicht (RGL), der inneren Kernschicht (INL) und der äußeren Kernschicht (ONL), wenn sie mit Hoechst angefärbt werden. Darüber hinaus sind retinale Blutgefäße in den retinalen plexiformen Schichten oder zwischen RGL und INL sowie zwischen INL und ONL sichtbar. Aufgrund der histologischen Natur der Blutgefäße erscheinen Blutgefäße, wenn die Netzhaut geschnitten wird, als getrennt und getrennt und versorgen die plexiformen Schichten. Abbildung 2 identifiziert Caspase-9 als stark reguliertes 1-Tages-P-RVO. Abbildung 3 validiert die funktionelle Relevanz von endothelialer Caspase-9 anhand von induzierbaren Endothelzell-Knockout-Mäusen. Abbildung 4 zeigt, dass das Targeting von aktivem Caspase-9 pharmakologisch die Induktion eines nachgeschalteten Ziels von Caspase-9-Caspase-7 blockiert. Das Protokoll identifiziert die zelluläre Lokalisation der Caspasen und der neuronalen Netzhautschichten, in denen die Caspasen exprimiert werden.
Abbildung 1: Netzhautbildgebungsschema . (A) Empfohlene Platzierung von Netzhautschnitten in den Objektträger. (B) Überblick über die Bildgebungsbereiche in der Netzhaut. (C) Darstellung der Netzhautansicht bei 20x Ziel. Netzhautschichten: RGL = retinale Ganglienschicht, INL = innere Kernschicht, ONL = äußere Kernschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: RVO induziert Caspase-9 in Endothelzellen und Neuronen. (A) Repräsentative Netzhautquerschnitte von unverletzten und 1-Tages-P-RVO, gefärbt mit cl-Caspase-9 1:800 (grün), Isolectin 1:200 (rot) und DAPI (weiß). (B) Quantifizierung der Anzahl der Neuronen mit cl-Caspase-9 (siehe Materialtabelle für Details zu den Antikörpern). (C) Quantifizierung der Anzahl der Endothelzellen mit cl-Caspase-9. (D) Gesamtzahl der Zellen, die cl-Caspase-9 exprimieren. Unverletzt, n = 6; 1 Tag P-RVO, n = 5. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± REM dar. Einweg-ANOVA, Fishers LSD-Test. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Endothelzelldeletion von endothelialer Caspase-9 blockiert die RVO-Induktion von Caspase-7. (A) Repräsentative Netzhautquerschnitte von iEC Casp9WT und iEC Casp9KO Wurfgeschwistermäusen 1 Tag P-RVO gefärbt mit Caspase-7 (grün), cl-Caspase-9 (blau), CD31, einem vaskulären Marker (rot) und DAPI (weiß). (B) Quantifizierung der Anzahl der Zellen in der inneren Netzhaut mit cl-caspase-9 und mit caspase-7. (C) Quantifizierung der Anzahl der Endothelzellen mit cl-Caspase-9 und mit Caspase-7. (D) Gesamtzahl der Zellen, die cl-Caspase-9 oder Caspase-7 exprimieren. iEC Casp9WT, n = 6-12; iEC Casp9KO, n = 3-8. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± REM dar. Einweg-ANOVA, Fishers LSD-Test. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die Hemmung der Caspase-9-Aktivität hemmt die Caspase-7-Expression P-RVO. (A) Repräsentative Netzhautquerschnitte von unverletzten und 1-Tages-P-RVO, behandelt oder unbehandelt mit Pen1-XBIR3, gefärbt mit Caspase-7 (grün), Isolectin (rot) und DAPI (weiß). (B) Quantifizierung der Anzahl der Endothelzellen mit Caspase-7. (C) Quantifizierung der Anzahl der Leukozyten mit Caspase-7. (D) Quantifizierung der Anzahl der Neuronen pro neuronaler Schicht mit Caspase-7. (E) Gesamtzahl der Zellen, die Caspase-7 exprimieren. Unverletzte Pen1 Kochsalzlösung, n = 6; unverletzter Pen1-XBIR3, n = 5; 1 Tag P-RVO Pen1 Kochsalzlösung, n = 5; 1 Tag P-RVO Pen1-XBIR3, n = 3. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± REM dar. Einweg-ANOVA, Fishers LSD-Test. Abkürzungen: RGL = retinale Ganglienschicht, INL = innere Kernschicht und ONL = äußere Kernschicht. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Caspasen sind eine mehrgliedrige Familie von Proteasen, die am besten auf ihre Rolle beim Zelltod und der Entzündung untersucht werden. In jüngerer Zeit wurden jedoch für einige Familienmitglieder eine Vielzahl von Nicht-Todesfall-Funktionen aufgedeckt 4,5. Ein Großteil unseres Verständnisses der Caspase-Funktion stammt aus der Arbeit in Zellkultur und aus Inferenzdaten menschlicher Erkrankungen. Während es geschätzt wird, dass es eine aberrante Induktion, Aktivierung oder Inaktivierung von Caspasen bei Krankheiten gibt, war es schwierig, funktionell zu bestimmen, ob die Caspasen die Krankheitspathologie vorantreiben. Viele Werkzeuge, die zur Bewertung spezifischer Caspasen verwendet werden, erkennen mehrere Familienmitglieder und untergraben die funktionelle Relevanz der mit diesen Reagenzien erhaltenen Daten17. Hier stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung von Caspasen in komplexem Gewebe am Beispiel der Netzhaut zur Verfügung. Im Nervensystem wird die Caspase-Expression prä- und postnatal herunterreguliert. Dies ermöglicht die Verwendung spezifischer Antikörper, um Veränderungen der Caspase-Spiegel in einem Krankheitsmodell zu testen.
Während der Schwerpunkt des Protokolls auf der Bildverarbeitung und -analyse liegt, hängt der Erfolg der Technik auch von einer sorgfältigen Gewebevorbereitung sowie IHC- und mikroskopischen Bildgebung ab, um die Konsistenz, Gültigkeit und Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten. Es muss darauf geachtet werden, dass die gleichen Parameter verwendet werden, um einen ganzen Datensatz abzubilden. Schlechte Bildqualität, geringer Kontrast und verschwommener Fokus liefern keine zuverlässigen Daten. Beim Schneiden und Abbilden von P-RVO-Regionen der Netzhaut sollten Risse und Faltungen vermieden werden, da diese Bereiche zu Artefakten führen können. Bereiche mit direkten Schäden sollten ebenfalls vermieden werden. Der Prüfer, der die Bildgebung durchführt, muss für die Behandlung des Gewebes blind sein. Für die Analyse wird empfohlen, dass zwei unabhängige Beobachter, die für die Behandlungsgruppe blind sind, die Analyse durchführen. Darüber hinaus sollten primäre Mausantikörper nicht in Mausverletzungsmodellen verwendet werden, da die sekundären Antikörper unspezifisch an das Gefäßsystem binden. Eine Alternative ist die Verwendung von direkt konjugierten primären Antikörpern.
Ein alternativer Ansatz zur Zellzählung ist die Quantifizierung des Prozentsatzes des Expressionsbereichs. Dies kann verwendet werden, wenn die Zellzählung nicht möglich ist (z. B. wenn die Caspase-Expression auf neuronale Prozesse oder Photorezeptorsegmente lokalisiert ist). Zentrale und periphere Netzhaut sind in verschiedenen Verletzungsmodellen unterschiedlich betroffen. Die Methode kann angepasst werden, um verschiedene Netzhautregionen gezielt zu analysieren. Bei der Durchführung von BRVO sollten Abschnitte aus dem verletzten Teil des Auges ausgewählt werden. Das Protokoll sieht auch die Färbung verschiedener Zellmarker vor, um festzustellen, wo die Caspase exprimiert wird.
Zu den Einschränkungen der Methode gehört, dass sie nicht zwischen hohen und niedrigen Caspase-Signalen in einer bestimmten Zelle unterscheidet. Darüber hinaus ist die Verwendung einer Kernfärbung zur Identifizierung neuronaler Schichten praktisch, zeigt jedoch nicht definitiv eine neuronale Expression an (Glia- und Leukozyten sind auch in diesen Schichten vorhanden). Zusätzliche neuronale Marker können verwendet werden, um die neuronale Expression zu validieren. Es gibt auch eine Vielzahl von Antikörpern, um die Caspase-Expression zu bewerten; Diese wurden am besten für humane Caspase-9 definiert, wo Antikörper für Caspase-9 in voller Länge / gespalten (CL) vorhanden sind, autogespaltene Caspase-9 und Caspase-3-gespaltene Caspase-9.
Die mittlere Intensität des IHC-Signals wird häufig als Quantifizierungsmethode angegeben. Hintergrundgeräusche oder Autofluoreszenz von roten Blutkörperchen können jedoch zu ungenauen Ergebnissen führen. Die zellspezifische Quantifizierung ermöglicht die Bestimmung und Unterscheidung von Hintergrund, unspezifischer Färbung und Autofluoreszenz.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um gewebeweite Veränderungen in der Expression einzelner Caspasen, Expressionsänderungen in einem bestimmten Zelltyp, wie einer Endothelzelle, und Veränderungen in bestimmten Zelltypen an bestimmten Orten, wie Neuronen in verschiedenen Netzhautschichten, zu messen. Diese Flexibilität ermöglicht es dem Experimentator, abzufragen, wie der Krankheitszustand einzelne Caspase-Spiegel verändert. Bestehende / alternative Methoden verwenden die Western-Blotting-Analyse für den semiquantitativen Vergleich der Caspase-Signalisierung, obwohl die Methoden nicht die klare Trennung der zellulären Lokalisierung bieten, die dieses Protokoll erreicht. In Abbildung 3D ist die Caspase-9-Hemmung im Vergleich zur RGL wirksamer bei der Reduzierung der neuronalen Caspase-9 im INL und ONL. Diese Art von Auflösung ist mit anderen Methoden schwierig zu erreichen. Wenn ein ganzes Gewebe biochemisch analysiert wird, können die sich verändernden Caspasenspiegel zu niedrig sein, um sie aufzunehmen, da es in einem komplexen Gewebe viele verschiedene Zelltypen gibt.
Die Antikörper, die vom Anwender validiert werden müssen, bieten Spezifität für die untersuchte Caspase. Caspasen können in Kaskaden wirken (d.h. Initiator aktivierender Effektor und dann zum Ergebnis führen - Tod, Entzündung, Zellsignalisierung). Dieses Protokoll kann in Proben verwendet werden, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Beschädigung entnommen wurden. In den hier vorgestellten Beispielen werden Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der RVO gesammelt. In früheren veröffentlichten Arbeiten wurde festgestellt, dass Caspase-9 innerhalb von 1 h nach RVO7 erhöht war, was zu weiteren Validierungs- und Targeting-Studien führte. Nach der Identifizierung von endothelialer Caspase-9 als potenzieller Treiber der RVO-Pathologie wurde eine Maus mit induzierbarer Endothelzelle Caspase-9KO zur Validierung von endothelialem Caspase-9 verwendet. Die Verwendung von induzierbaren zellspezifischen Caspase-KO-Mäusen bietet eine weitere Ebene der Spezifität und vermeidet den Entwicklungstod, der bei konstitutivem Caspase-9KO18 beobachtet wird. Es vermeidet auch kompensatorische Veränderungen bei anderen Familienmitgliedern, die nachweislich bei konstitutiven Caspase-KO-Mäusen auftreten19. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von zellspezifischen induzierbaren Caspase-KO-Mäusen die Identifizierung des Zelltyps, in dem die Caspase die Pathologie im Gewebe reguliert. Das Protokoll enthält auch die Schritte, um die Wirksamkeit eines therapeutischen Ansatzes zu hinterfragen, der auf aktive Caspase-9 in RVO abzielt. Dieser Ansatz kann auch auf andere Gewebe, einschließlich des Gehirns, angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären folgende Interessenkonflikte: C.M.T. hat die folgenden Patentanmeldungen US20200164026, US20190142915 und US20150165061. C.M.T. und S.S. haben eine US-amerikanische 20140024597 zum Patent angemeldet. C.M.T., A.M.P. und M.I.A. haben eine Patentanmeldung US2020058683. C.M.T. und Y.Y.J. haben eine Patentanmeldung WO2018013519. M.I.A und C.M.T sind als Erfinder in einer Patentanmeldung WO/2020/223212 der Trustees der Columbia University in der Stadt New York aufgeführt. Die übrigen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) Stipendium DGE - 1644869 und das National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) der National Institutes of Health (NIH), Preisnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (an CKCO), das National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (an AMP), das National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 an CMT) und das Department of Defense Army/Air Force (DURIP an CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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