Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Kvantifisering av immunostained caspase-9 i retinal vev

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/64237
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er en detaljert immunhistokjemiprotokoll for å identifisere, validere og målrette funksjonelt relevante caspases i komplekse vev.

Abstract

Familien av caspases er kjent for å formidle mange cellulære veier utover celledød, inkludert celledifferensiering, aksonal pathfinding og proliferasjon. Siden identifiseringen av familien av celledødsproteaser har det vært et søk etter verktøy for å identifisere og utvide funksjonen til bestemte familiemedlemmer i utviklings-, helse- og sykdomstilstander. Imidlertid er mange av de kommersielt tilgjengelige caspaseverktøyene som er mye brukt, ikke spesifikke for målrettet caspase. I denne rapporten avgrenser vi tilnærmingen vi har brukt for å identifisere, validere og målrette caspase-9 i nervesystemet ved hjelp av en ny inhibitor og genetiske tilnærminger med immunhistokjemiske avlesninger. Spesielt brukte vi retinal neuronal vev som en modell for å identifisere og validere tilstedeværelsen og funksjonen til caspases. Denne tilnærmingen muliggjør avhør av celletypespesifikke apoptotiske og ikke-apoptotiske caspase-9-funksjoner og kan brukes på andre komplekse vev og caspases av interesse. Å forstå funksjonene til caspases kan bidra til å utvide dagens kunnskap innen cellebiologi, og kan også være fordelaktig å identifisere potensielle terapeutiske mål på grunn av deres involvering i sykdom.

Introduction

Caspasene er en familie av proteaser som regulerer utviklingscelledød, immunresponser og avvikende celledød ved sykdom 1,2. Selv om det er velkjent at medlemmer av caspase-familien er indusert i en rekke nevrodegenerative sykdommer, er detmer utfordrende å forstå hvilken caspase som driver sykdomspatologi. Slike studier krever verktøy for å identifisere, karakterisere og validere funksjonen til individuelle caspase familiemedlemmer. Parsing ut de relevante individuelle caspases er viktig både fra et mekanistisk og et terapeutisk synspunkt, da litteraturen har flere studier som gir bevis for de ulike rollene til caspases 4,5. Således, hvis målet er å målrette en caspase i en sykdom for en terapeutisk fordel, er det avgjørende å ha spesifikk målretting av det aktuelle familiemedlemmet (e). Tradisjonelle teknikker for å oppdage caspase nivåer i vev inkluderer western blotting og enzymatiske og fluorometriske tilnærminger 3,6. Imidlertid tillater ingen av disse tiltakene cellespesifikk påvisning av caspasenivåer, og i noen scenarier kan spaltede caspaser ofte ikke oppdages ved tradisjonelle proteinanalysetiltak. Det er kjent at caspases kan spille forskjellige apoptotiske og ikke-apoptotiske roller i samme vev7, derfor er det nødvendig med nøye karakterisering av cellespesifikke caspasenivåer for nøyaktig forståelse av utviklings- og sykdomsveier.

Denne studien viser caspase aktivering og funksjon i en modell av nevrovaskulær hypoksi-iskemi - retinal vene okklusjon (RVO)7,8. I et komplekst vev som netthinnen er det flere celletyper som kan påvirkes av hypoksi-iskemi indusert i RVO, inkludert gliaceller, nevroner og vaskulatur7. I den voksne musehinnen er det svært lite uttrykk for caspases som er tydelig i sunt vev, målt ved immunhistokjemi (IHC)7, men det er ikke tilfelle under utvikling9 eller i modeller av retinal sykdom10,11. IHC er en teknikk som er godt etablert i biomedisinsk forskning og har tillatt validering av sykdom og patologiske mål, identifisering av nye roller gjennom romlig lokalisering og kvantifisering av proteiner. I tilfeller der spaltede caspaseprodukter ikke kan detekteres ved western blot eller fluorometrisk analyse, eller den spesifikke celleplasseringen av distinkte caspases eller undersøkelse av caspase signalveier gjennom lokalisering, bør IHC brukes.

For å bestemme kaspasen(e) som er funksjonelt relevante i RVO, ble IHC brukt med validerte antistoffer for caspaser og cellulære markører. De tidligere studiene utført i laboratoriet viste at caspase-9 raskt ble aktivert i en modell av iskemisk slag og inhibering av caspase-9 med en svært spesifikk inhibitor beskyttet mot nevronal dysfunksjon og død12. Fordi netthinnen er en del av sentralnervesystemet (CNS), fungerer det som et modellsystem for å spørre og videre undersøke rollen som caspase-9 i nevrovaskulære skader13. Til dette formål ble musemodellen til RVO brukt til å studere den cellespesifikke plasseringen og fordelingen av caspase-9 og dens implikasjon i nevrovaskulær skade. RVO er en vanlig årsak til blindhet hos voksne i arbeidsfør alder som skyldes vaskulær skade14. Det ble funnet at caspase-9 ble uttrykt på en ikke-apoptotisk måte i endotelceller, men ikke i nevroner.

Som et vev har netthinnen fordelen av å bli visualisert som enten en flatmount, noe som gjør det mulig å forstå de vaskulære nettverkene, eller som tverrsnitt, som fremhever de neuronale retinale lagene. Kvantifisering av caspaseproteinuttrykk i tverrsnitt gir kontekst, med hensyn til hvilken caspase som er potensielt kritisk i retinal neuronal tilkobling og synsfunksjon ved å identifisere lokaliseringen av caspasen (e) i netthinnen. Etter identifisering og validering oppnås målretting av caspase av interesse ved bruk av induserbar cellespesifikk sletting av caspase identifisert. For potensielle terapeutiske undersøkelser ble relevansen av caspases av interesse testet ved hjelp av spesifikke verktøy for å hemme den aktiverte caspasen. For caspase-9 permeant en celle svært selektiv hemmer 7,15, Pen1-XBIR3 ble brukt. For denne rapporten ble 2 måneder gammel, mannlig C57BL / 6J-stamme og tamoxifen-induserbar endotelial caspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stamme med C57BL / 6J bakgrunn brukt. Disse dyrene ble eksponert for musemodellen av RVO og C57BL/6J ble behandlet med den selektive kaspase-9-hemmeren Pen1-XBir3. Den beskrevne metodikken kan brukes på andre sykdomsmodeller i sentrale og perifere systemer 7,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen følger Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalelse for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning. Gnagere eksperimenter ble godkjent og overvåket av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Columbia University.

1. Fremstilling av retinalt vev og kryoseksjonering

  1. Avlive dyrene ved administrering av intraperitoneal anestesi (ketamin (80-100 mg / kg) og xylazin (5-10 mg / kg)), og perfuse musene utsatt for RVO (se8 for detaljer) med 4% paraformaldehyd (PFA) ved hjelp av en peristaltisk pumpe.
    NOTAT: Tå-klem dyret for å bekrefte anestesidybden før du fortsetter med avlivning og perfusjon. Detaljer om perfusjon finnes i16.
  2. Høst øynene ved forsiktig enukleasjon ved hjelp av tang og legg kloden i 1 ml 4% PFA. La øynene stå over natten ved 4 °C. Vask øynene tre ganger i 10 minutter, tilsett 1 ml 1x PBS og plasser dem i shakeren.
  3. Fordyp øynene i 1 ml 30% sukrose i 3 dager, til de legger seg til bunnen av røret, noe som indikerer absorpsjon av sukrose.
  4. Fyll øynene med optimal skjæretemperaturforbindelse ved hjelp av en 30 G sprøyte, til øyet har et avrundet utseende (ca. 50 μL).
  5. Legg øynene i et kryomalt med optimal skjæretemperaturblanding til øynene er dekket og frys ved -80 °C til de er klare til kryoseksjon.
  6. Seksjonen innebygde øynene ved 20 μm på glassglass ved hjelp av en kryostat.
    1. Fjern den optimale skjæretemperaturforbindelsesblokken fra kryomordet.
    2. Plasser den på cryostat chuck ved å legge til optimal skjæretemperaturforbindelse og plassere blokken på chucken. La den være inne i kryostaten til den fryser.
    3. Fortsett å kutte blokken ved 20 μm til retinalvevet er sett.
      MERK: Dette kan bekreftes med et lysmikroskop ved 30x forstørrelse (3x objektiv, 10x okularer). Vev kan skilles fra OCT-mediet ved farge og form.
    4. Samle retinalvevet i mikroskop lysbilder i en serie på fire seksjoner per lysbilde.
      MERK: Se figur 1A for foreslått plassering av retinale seksjoner.
  7. Merk lysbildene med en ID som avidentifiserer behandlingen og genotypen.
  8. Oppbevar lysbildene ved -20 °C til flekker.

2. Immunhistokjemi

MERK: Bruk fast kryopreservert vev for immunhistokjemi for å opprettholde cellemorfologi. Velg seksjoner som er på nivå med bildene av optisk koherenstomografi (OCT) som er oppnådd in vivo7. Bruk de to første seriene av lysbilder samlet fra kryostat eller seksjoner fra 150 μm inn i retinalvevet.

  1. Plasser lysbildene i et mørkt og fuktig glidekammer.
  2. Permeabilisering og blokkering: Vask retinaltverrsnittene med 300 μL 1x PBS i 5 minutter for å fjerne OCT og kaste etter.
  3. Permeabiliser vevet ved å tilsette 300 μL 1x PBS med 0,1% Triton X-100 i 2 timer ved romtemperatur (RT) og kastes etterpå.
  4. Blokker vevet ved å tilsette 300 μL blokkeringsbuffer (10 % normalt geiteserum (NGS), 1 % bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS, filtrert) og la stå over natten ved 4 °C.
  5. Primære antistoffer: Fortynn primære antistoffer i blokkerende buffer. Primære antistoffer som brukes inkluderer anti-cl-caspase-9 ved 1:800, anti-CD31 ved 1:50, og anti-caspase-7-488 (direkte merket antistoff) ved 1:150.
    MERK: Følg produsentens anbefaling for riktig fortynning av primære antistoffer.
    1. Hell blokkeringsbufferen av seksjoner og påfør 100 μL av den primære antistoffcocktailen til retinalglassene.
    2. Inkuber tverrsnittene over natten ved 4 °C.
  6. Vask seksjonene fire ganger i 5 minutter med 300 μL 1x PBS.
    MERK: Hvis vevsseksjonene er svært skjøre, bør vasker fjernes ved hjelp av kapillærvirkning ved å påføre et vev på hjørnet av lysbildet for å unngå å forskyve retinalseksjonene.
  7. For å unngå kryssmerking av primære antistoffer oppdratt i samme vertsart, fullfør fargingen med sekundære antistoffer før påføring av de direkte merkede antistoffene.
  8. Sekundære antistoffer: Fortynn sekundære antistoffer i blokkerende buffer i en konsentrasjon på 0,1%. For eksempel, for å oppdage anti-cl-caspase-9, et antistoff oppdratt i kanin, bruk geit-anti-kanin-568 sekundær.
    1. Påfør 200 μL av den sekundære antistoffcocktailen til netthinnen.
    2. Inkuber vevet i 2 timer ved RT.
    3. Vask seksjonene fire ganger i 5 minutter med 300 μL 1x PBS.
    4. Flekk kjernene i 5 minutter med 300 μL DAPI ved en fortynning på 0,02%.
  9. Vask en gang i 5 minutter med 300 μL 1x PBS.
  10. Plasser et deksel på retinalseksjonene ved hjelp av 500 μL fluoromount-G-medier, som bevarer det fluorescerende signalet, og plasser dekslet forsiktig på toppen av lysbildet, og unngå bobler.

3. Konfokal avbildning

  1. Få bilder av de fargede seksjonene med konfokalmikroskopi.
    1. Slå på konfokalmikroskopet.
    2. Plasser lysbildet på scenen.
    3. Juster fokuset for å se netthinnedelen tydelig.
      MERK: Ta minst fire bilder per seksjon og bilde fire seksjoner per netthinne. Se skjemaet for retinal imaging for foreslåtte bildeområder (figur 1B, C).
  2. Bildekaspase, vaskulær og kjernefysisk farging ved hjelp av et konfokalt mikroskop som har Z-stack-oppkjøp, ved hjelp av et 20x eller 40x objektiv.
    MERK: Bildeparameterne og programvareoppsettet skal være konstant for all bildebehandling i et eksperiment. 20x-målet gir en oversikt over retinallagene, som er godt definert av atomfargingen. 40x-målet gir flere cellulære detaljer.
    1. Angi passende eksponerings- og laserintensitetstider per kanal ved å klikke på henteinnstillinger.
    2. Still inn Z-stacken for å visualisere hele delen ved å klikke på Z-serien og sett opp og ned parametere for å dekke dybden av vevet.
  3. Lagre bildene etter den maskerte ID-en som er tildelt under kryoseksjonering.

4. Kvantifisering av caspase nivåer

  1. Dra bildefiler med 405, 470, 555 og 640 kanaler til FIJIs konsoll.
  2. Klikk på Image > Color > Merge Channels.
  3. Tildel farger til filene som følger: rød til 555, grønn til 470, grå til 405, cyan til 640.
  4. Komprimer Z-stakken ved å klikke Image > Stack > Z Project.
  5. Klikk Projeksjonstype: Maks intensitet.
  6. Åpne kanalgrensesnittet ved å klikke Bilde- > fargekanalverktøyet.
  7. Åpne grensesnittet Lysstyrke og kontrast .
  8. Velg parametere per kanal.
    1. Gå til Kanaler og velg en kanal.
    2. Plasser markøren oppå den utskrevne cellen caspase og kommenter pikselverdien.
    3. Plasser markøren oppå bakgrunnen, og kommenter bildepunktverdien.
  9. Test parametere
    1. Gå til Lysstyrke og kontrast grensesnitt.
    2. Klikk Velg.
    3. Koble til den minste viste verdien (kommentert pikselverdi for den uttrykte cellen caspase).
    4. Koble til den maksimale viste verdien (kommentert pikselverdi i bakgrunnen).
    5. Klikk på OK.
  10. Gjenta trinn 4.8–4.9 for alle kanaler.
  11. Test parametrene ved å velge tilfeldige bilder fra blindet vev.
    MERK: Rediger lysstyrke- og kontrastparametere bare hvis bakgrunnsverdien ikke er tilstrekkelig for andre bilder.
  12. Når parametrene er angitt, åpner du bildefilene og komprimerer Z-stakken.
  13. Legg til lysstyrke- og kontrastparametrene for caspasekanalen og isolektin, vaskulær markørkanal.
  14. Bruk punktverktøyet til å kvantifisere antall vaskulære positive områder ved hjelp av kolokalisering av vaskulær markør med caspaseuttrykk som avlesning av positive områder.
  15. Gjenta trinn 4.14, men bruk Hoechst som markør for nevronale positive områder.
  16. Kommenter verdiene i et regneark per bilde.
  17. Gjennomsnitt verdiene etter inndeling.
  18. Gjennomsnitt seksjonsverdiene - dette vil være avlesningen per øye.

5. Genetisk bekreftelse av relevansen av endotelcellen caspase-9

  1. Bruk netthinner hentet fra Casp9FL / FL-VECad-CreERT2-musene som ble utsatt for RVO7.
  2. Immunostain netthinnen for caspase-9 (den slettede caspase), caspase-7 (en nedstrøms effektorkaspase), vaskulære markører og DAPI som beskrevet ovenfor i avsnitt 2.
  3. Bilde og kvantifiser som beskrevet ovenfor i avsnitt 3 og 4.

6. Målretting caspase-9 i RVO

  1. Få øyne fra musene utsatt for RVO etterfulgt av påføring av caspase-9-hemmeren Pen1-XBir3 lokalt til øynene som i7.
  2. Immunostain netthinnen for caspase-7 (en nedstrøms effektor caspase), vaskulære markører og DAPI som beskrevet ovenfor i avsnitt 2.
  3. Bilde og kvantifiser som beskrevet ovenfor i avsnitt 3 og 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den beskrevne protokollen lar brukeren analysere og kvantifisere caspase-9-nivåer i retinalvevet. I tillegg presenterer den verktøy for ytterligere å identifisere, validere og spesifikt målrette mot caspase-9 og nedstrøms substrater. De oppsummerte trinnene tillater kvantifiserbar analyse av caspasenivåer og cellulær spesifisitet i fluorescerende fotomikrografier. Alle tall viser representative fotomikrografier og kvantifisering av de angitte caspasenivåene i den totale netthinnen, endotelceller og nevroner i ubesudlede og 1-dagers P-RVO retina-tverrsnitt. Retinaltverrsnittet tillater visualisering av retinale kjerner i retinal ganglion lag (RGL), indre nukleært lag (INL) og ytre nukleært lag (ONL) når farget med Hoechst. I tillegg er retinale blodkar synlige i retinal plexiformlagene eller mellom RGL og INL, og mellom INL og ONL. På grunn av blodkarets histologiske natur, når netthinnen er seksjonert, vil blodkarene vises som frakoblet og separat, og forsyne pleksiformlagene. Figur 2 identifiserer caspase-9 som sterkt regulert 1-dagers P-RVO. Figur 3 validerer funksjonsrelevansen av endotelial caspase-9 ved bruk av induserbare endotelcelle knockoutmus. Figur 4 viser at målretting mot aktiv caspase-9 farmakologisk blokkerer induksjonen av et nedstrømsmål for caspase-9-caspase-7. Protokollen identifiserer den cellulære lokaliseringen av caspasene og de neuronale retinale lagene der caspasene uttrykkes.

Figure 1
Figur 1: Retinal imaging skjema . (A) Anbefalt plassering av retinale seksjoner i mikroskopglasset. (B) Oversikt over bildeområdene i netthinnen. (C) Representasjon av retinal visning ved 20x objektiv. Retinale lag: RGL = retinal ganglionlag, INL = indre kjernelag, ONL = ytre kjernelag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: RVO induserer caspase-9 i endotelceller og nevroner. (A) Representativt retinalt tverrsnitt fra ubesudlet og 1-dagers P-RVO farget med cl-caspase-9 1:800 (grønn), isolektin 1:200 (rød) og DAPI (hvit). (B) Kvantifisering av antall nevroner med cl-caspase-9 (se materialtabell for detaljer om antistoffene). (C) Kvantifisering av antall endotelceller med cl-caspase-9. (D) Totalt antall celler som uttrykker cl-caspase-9. Ubesudlet, n = 6; 1-dagers P-RVO, n = 5. Feilfelt representerer gjennomsnittet ± SEM; Enveis ANOVA, Fishers LSD-test. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Endotelcelledelesjon av endotelkaspase-9-blokker RVO-induksjon av caspase-7. (A) Representativt retinalt tverrsnitt fra iEC Casp9WT og iEC Casp9KO kullmatmus 1-dagers P-RVO farget med caspase-7 (grønn), cl-caspase-9 (blå), CD31, en vaskulær markør (rød) og DAPI (hvit). (B) Kvantifisering av antall celler i den indre netthinnen med cl-caspase-9 og med caspase-7. (C) Kvantifisering av antall endotelceller med cl-caspase-9 og med caspase-7. (D) Totalt antall celler som uttrykker cl-caspase-9 eller caspase-7. iEC Casp9WT, n = 6-12; iEC Casp9KO, n = 3-8. Feilfelt representerer gjennomsnittet ± SEM; Enveis ANOVA, Fishers LSD-test. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Inhibering av caspase-9-aktivitet hemmer caspase-7-uttrykk P-RVO. (A) Representativt retinalt tverrsnitt fra ubesudlet og 1-dagers P-RVO behandlet eller ubehandlet med Pen1-XBIR3 farget med caspase-7 (grønn), isolektin (rød) og DAPI (hvit). (B) Kvantifisering av antall endotelceller med caspase-7. (C) Kvantifisering av antall leukocytter med caspase-7. (D) Kvantifisering av antall nevroner per nevronlag med caspase-7. (E) Totalt antall celler som uttrykker caspase-7. Ubeskjeden penn1 saltvann, n = 6; ubesudlet Pen1-XBIR3, n = 5; 1-dagers P-RVO Pen1 saltvann, n = 5; 1-dagers P-RVO Pen1-XBIR3, n = 3. Feilfelt representerer gjennomsnittet ± SEM; Enveis ANOVA, Fishers LSD-test. Forkortelser: RGL = retinal ganglionlag, INL = indre kjernelag og ONL = ytre kjernelag. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Caspases er en flersidig familie av proteaser som best studeres for deres roller i celledød og betennelse; Imidlertid har nylig en rekke ikke-dødsfunksjoner blitt avdekket for noen familiemedlemmer 4,5. Mye av vår forståelse av caspase funksjon er avledet fra arbeid i cellekultur og fra inferensielle data fra menneskelig sykdom. Selv om det er verdsatt at det er avvikende induksjon, aktivering eller inaktivering av caspases i sykdom, har det vært utfordrende å funksjonelt avgjøre om caspasene driver sykdomspatologi. Mange verktøy som brukes til å vurdere spesifikke caspaser, oppdager flere familiemedlemmer, og undergraver den funksjonelle relevansen av data oppnådd med disse reagensene17. Her gir vi en protokoll for å studere caspases i komplekst vev, ved hjelp av netthinnen som et eksempel. I nervesystemet er caspase uttrykk nedregulert pre- og postnatalt. Dette tillater bruk av spesifikke antistoffer for å teste endringer i caspase nivåer i en sykdomsmodell.

Mens fokuset på protokollen er på bildebehandling og analyse, er teknikkens suksess også avhengig av forsiktig vevspreparering, samt IHC og mikroskopisk avbildning for å sikre konsistens, gyldighet og pålitelighet av dataene. Det må tas hensyn til å bruke de samme parametrene for å avbilde et helt datasett. Bilder av dårlig kvalitet, lav kontrast og uskarpt fokus vil ikke gi pålitelige data. Ved snitting og avbildning av P-RVO-regioner i netthinnen, bør rifter og folding unngås, da disse områdene kan føre til artefakter. Områder med direkte skade bør også unngås. Etterforskeren som utfører avbildningen må være blindet for behandling av vevet. For analyse anbefales det at to uavhengige observatører, blindet for behandlingsgruppen, utfører analysen. I tillegg bør primære museantistoffer ikke brukes i museskademodeller, da de sekundære antistoffene binder seg ikke-spesifikt til vaskulaturen. Et alternativ er å bruke direkte konjugerte primære antistoffer.

En alternativ tilnærming til celletelling er kvantifisering av prosentandelen av uttrykksområdet. Dette kan brukes når celletelling ikke er mulig (f.eks. hvis caspaseuttrykk er lokalisert til nevronprosesser eller fotoreseptorsegmenter). Sentral og perifer netthinne påvirkes differensielt i ulike skademodeller. Metoden kan tilpasses for å spesifikt analysere forskjellige retinale regioner. Hvis du utfører BRVO, bør seksjoner velges fra den skadede delen av øyet. Protokollen sørger også for farging av forskjellige cellemarkører for å identifisere hvor caspasen uttrykkes.

Begrensninger av metoden inkluderer at den ikke skiller mellom høye og lave nivåer av caspase signal i en gitt celle. I tillegg er det praktisk å bruke en kjernefysisk flekk for å identifisere nevronlag, men indikerer ikke definitivt nevronuttrykk (glia og leukocytter er også tilstede i disse lagene). Ytterligere nevronale markører kan brukes til å validere nevronuttrykk. Det finnes også en rekke antistoffer tilgjengelig for å evaluere caspase uttrykk; Disse er best definert for human caspase-9, hvor det er antistoffer for full lengde/spaltet (CL) caspase-9, autoklosset caspase-9 og caspase-3-spaltet caspase-9.

Den gjennomsnittlige intensiteten til IHC-signalet rapporteres ofte som en kvantifiseringsmetode. Imidlertid kan bakgrunnsstøy eller autofluoresens fra røde blodlegemer gi unøyaktige resultater. Cellespesifikk kvantifisering muliggjør bestemmelse og diskriminering av bakgrunn, ikke-spesifikk farging og autofluoresens.

Denne protokollen kan brukes til å måle vev brede endringer i uttrykket av individuelle caspases, endringer i uttrykk i en bestemt celletype, for eksempel en endotelcelle, og endringer i bestemte celletyper på bestemte steder, for eksempel nevroner i forskjellige retinale lag. Denne fleksibiliteten gjør det mulig for eksperimentøren å spørre hvordan sykdomstilstanden endrer individuelle kaspasenivåer. Eksisterende/alternative metoder bruker western blotting-analyse for semikvantitativ sammenligning av caspasesignalering, selv om metoder ikke vil gi den klare separasjonen av cellulær lokalisering som denne protokollen oppnår. Spesielt i figur 3D er caspase-9-hemming mer effektiv for å redusere nevronal caspase-9 i INL og ONL, sammenlignet med RGL. Denne typen oppløsning er utfordrende å oppnå med andre metoder. I tillegg, når et helt vev analyseres biokjemisk, kan nivåene av caspases som endres være for lave til å plukke opp, siden det er mange forskjellige celletyper i et komplekst vev.

Antistoffene, som må valideres av brukeren, gir spesifisitet for caspase probed. Caspases kan virke i kaskader (dvs. initiator aktivere effektor og deretter føre til utfall - død, betennelse, cellesignalering). Denne protokollen kan brukes i prøver samlet på forskjellige tidspunkter etter skade; i eksemplene som presenteres her, blir prøver samlet inn på forskjellige tidspunkter etter RVO. I tidligere publisert arbeid har det blitt funnet at caspase-9 ble økt innen 1 time etter RVO7, noe som førte til ytterligere validering og målrettingsstudier. Etter å ha identifisert endotelial caspase-9 som en potensiell driver av ROVO-patologi, ble en mus med induserbar endotelcelle caspase-9KO for å validere endotelial caspase-9 brukt. Bruken av induserbare cellespesifikke caspase KO-mus gir et annet spesifisitetsnivå og unngår utviklingsdød sett med konstitutiv caspase-9KO18. Det unngår også kompenserende endringer i andre familiemedlemmer som har vist seg å forekomme i konstitutiv caspase KO mus19. Videre tillater bruk av cellespesifikke induserbare caspase KO-mus identifisering av celletypen der caspasen regulerer patologi i vevet. Protokollen gir også trinnene for å undersøke effekten av en terapeutisk tilnærming, rettet mot aktiv caspase-9 i RVO. Denne tilnærmingen kan også brukes på andre vev, inkludert hjernen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer følgende konkurrerende interesser: C.M.T. har følgende patentsøknader US20200164026, US20190142915 og US20150165061. C.M.T. og S.S. har en patentsøknad US 20140024597. C.M.T., A.M.P., og M.I.A. har en patentsøknad US2020058683. C.M.T. og Y.Y.J. har patentsøknad WO2018013519. M.I.A og C.M.T er oppført som oppfinnere på en patentsøknad WO/2020/223212 av forvalterne av Columbia University i City of New York. De resterende forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) stipend DGE - 1644869 og National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) fra National Institutes of Health (NIH), prisnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (til CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (til AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 til CMT), og Department of Defense Army / Air Force (DURIP til CMT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-Caspase-7 488 Novus Biologicals NB-56529AF488 use at 1:150
anti-cl-Caspase-9 Cell Signaling 9505-S use at 1:800
anti-CD31 BD Pharmingen 553370 use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope Biovision
FIJI 2.3.0 open source
Fluormount G Fisher 50-187-88
Forcep Roboz RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice lab generated see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649) Vector DL-1207 use at 1:200
Ketamine Hydrochloride Henry Schein NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump  Masterflex
Pen1-XBir3 lab generated see Avrutsky 2020
Prism 9.1 GraphPad
Tissue-Tek O.C.T. Fisher 14-373-65
Vis-a-View 4.0 Visitron Systems
Xylazine Akorn NDCL 59399-110-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
  2. Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, Academic Press. 79-85 (2018).
  3. Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
  4. Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
  5. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
  6. Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
  7. Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
  8. Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
  9. Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
  10. Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
  11. Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
  12. Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
  13. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
  14. Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
  15. Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
  16. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  17. McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
  18. Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
  19. Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).

Tags

Nevrovitenskap utgave 185
Kvantifisering av immunostained caspase-9 i retinal vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colón Ortiz, C. K., Potenski,More

Colón Ortiz, C. K., Potenski, A. M., Johnson, K. V., Chen, C. W., Snipas, S. J., Jean, Y. Y., Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (185), e64237, doi:10.3791/64237 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter