Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Påvisning af homologe rekombinationsmellemprodukter via nærhedsligering og kvantitativ PCR i Saccharomyces cerevisiae

Published: September 11, 2022 doi: 10.3791/64240
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, 2Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, 3Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

Summary

D-loop capture (DLC) og D-loop extension (DLE) assays udnytter princippet om nærhedsligation sammen med kvantitativ PCR til at kvantificere D-loop-dannelse, D-loop-udvidelse og produktdannelse på stedet for et inducerbart dobbeltstrenget brud i Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

DNA-skader, herunder DNA-dobbeltstrengede brud og interstrengede tværbindinger, der opstår under S- og G2-faserne i cellecyklussen, kan repareres ved homolog rekombination (HR). Derudover repræsenterer HR en vigtig mekanisme til replikationsgaffelredning efter standsning eller sammenbrud. Reguleringen af de mange reversible og irreversible trin i denne komplekse vej fremmer dens troskab. Den fysiske analyse af rekombinationsmellemprodukterne dannet under HR muliggør karakterisering af disse kontroller af forskellige nukleoproteinfaktorer og deres interactors. Selvom der er veletablerede metoder til at analysere specifikke begivenheder og mellemprodukter i rekombinationsvejen, har detektionen af D-loop-dannelse og udvidelse, to kritiske trin i denne vej, vist sig at være udfordrende indtil for nylig. Her beskrives effektive metoder til påvisning af nøglehændelser i HR-vejen, nemlig DNA-dobbeltstrenget bruddannelse, D-loop-dannelse, D-loop-forlængelse og dannelse af produkter via break-induceret replikation (BIR) i Saccharomyces cerevisiae . Disse assays registrerer deres relevante rekombinationsmellemprodukter og produkter med høj følsomhed og er uafhængige af cellulær levedygtighed. Detekteringen af D-loops, D-loop-udvidelsen og BIR-produktet er baseret på nærhedsligation. Sammen giver disse assays mulighed for at studere HR's kinetik på befolkningsniveau for fint at adressere funktionerne af HR-proteiner og regulatorer på betydelige trin i vejen.

Introduction

Homolog rekombination (HR) er en high-fidelity mekanisme til reparation af DNA dobbeltstrengede pauser (DSB'er), inter-streng tværbindinger og ssDNA-huller samt en vej til DNA-skadetolerance. HR adskiller sig fra fejlbehæftede veje til reparation/tolerance af DNA-skader, såsom ikke-homolog end-joining (NHEJ) og translesionssyntese, idet den bruger et intakt, homologt dupleks-DNA som donor til at skabelon reparationshændelsen. Desuden er mange af de vigtigste mellemprodukter i HR-vejen reversible, hvilket giver mulighed for udsøgt regulering af de enkelte pathway-trin. Under faserne S, G2 og M i cellecyklussen konkurrerer HR med NHEJ om reparation af de to-endede DSB'er1. Derudover er HR afgørende for DNA-replikation til reparation af replikationsrelateret DNA-skade, herunder ssDNA-huller og ensidige DSB'er, og som en mekanisme for DNA-læsion bypass2.

Et kritisk mellemprodukt i HR-vejen er forskydningssløjfen eller D-loop (figur 1). Efter slutresektion indlæses den centrale rekombinase i reaktionen, Rad51, på det nyligt resekterede ssDNA af det ødelagte molekyle og danner et spiralformet filament2. Rad51 udfører derefter en homologiundersøgelse for at identificere en passende homolog donor, typisk søsterkromatid i somatiske celler. D-loopet dannes, når Rad51-ssDNA-filamentet invaderer et homologt duplex-DNA, hvilket fører til Watson-Crick-baseparring af den ødelagte streng med donorens komplementære streng og fortrænger den modsatte donorstreng. Forlængelse af 3'-enden af den ødelagte streng med en DNA-polymerase erstatter de baser, der gik tabt under DNA-skadehændelsen, og fremmer opløsningen af det udvidede D-loop-mellemprodukt til et dsDNA-produkt gennem den synteseafhængige strengglødning (SDSA), dobbelt-Holliday-krydset (dHJ) eller den brudinducerede replikation (BIR) HR-underveje.

Assays, der fysisk overvåger mellemprodukterne i HR-vejen, tillader analyse af de genetiske krav til hvert trin (dvs. vejanalyse). DSB-formation, enderesektion, dHJ'er, BIR-replikationsbobler og HR-produkter observeres let ved Southern blotting 3,4,5,6,7. Alligevel undlader Southern blotting at rapportere om spirende og udvidede D-sløjfer, og derfor kræves en alternativ metode til pålidelig måling af disse ledmolekyler 4,8,9. En meget anvendt strategi til at analysere spirende D-loop-dannelse er kromatin-immunoprecipitation (ChIP) af Rad51 kombineret med kvantitativ PCR (qPCR)10,11. Rad51-tilknytning til dsDNA målt ved ChIP-qPCR er imidlertid uafhængig af sekvenshomologi og Rad51-tilbehørsfaktoren Rad5410,11. I modsætning hertil afhænger et mærkbart signal ved hjælp af metoden til D-loop-analyse, der præsenteres her, kaldet D-loop capture (DLC) assay, af DSB-dannelse, sekvenshomologi, Rad51 og Rad51-tilbehørsproteinerne Rad52 og Rad548. Konstateringen af, at Saccharomyces cerevisiae Rad51-promoveret D-loop-dannelse afhænger af Rad54 in vivo, er i overensstemmelse med adskillige in vitro-rekonstitutionseksperimenter, der indikerer, at Rad54 er nødvendig for homologisøgning og D-loop-dannelse ved spirende gær Rad518,12,13,14,15.

De nuværende tilgange til måling af D-loop-udvidelse, primært gennem semikvantitativ PCR, er ligeledes problematiske. Et typisk PCR-baseret assay til påvisning af D-loop-forlængelse forstærker en unik sekvens som følge af rekombination mellem et brudsted og en ektopisk donor og den efterfølgende rekombinationsassocierede DNA-syntese via en primer opstrøms for homologiområdet på den ødelagte streng og en anden primer nedstrøms for homologiområdet på donorstrengen. Ved hjælp af denne metode kræver påvisning af rekombinationsassocieret DNA-syntese den ikke-essentielle Pol δ processivitetsfaktor Pol3216. Dette fund er i modstrid med observationen om, at POL32-deletion kun har en mild effekt på genkonvertering in vivo17. Desuden løser disse PCR-baserede assays ikke tidsmæssigt D-loop-udvidelse og BIR-produktdannelse, hvilket tyder på, at signalet skyldes dsDNA-produkter snarere end ssDNA-mellemprodukter17,18,19. D-loop-udvidelsen (DLE) blev for nylig udviklet for at løse disse uoverensstemmelser. DLE-analysen kvantificerer rekombinationsassocieret DNA-syntese på et sted ~ 400 basepar (bp) nedstrøms for den oprindelige 3 'invaderende ende9. Ved denne metode er D-loop-forlængelse uafhængig af Pol32 og kan påvises inden for 4 timer efter DSB-induktion, mens BIR-produkter først observeres ved 6 timer. Faktisk bemærkede en nylig publikation fra Haber- og Malkova-laboratorierne, at anvendelse af denne metode til fremstilling af genomisk DNA entydigt resulterer i ssDNA-bevarelse 9,20.

Her er DLC- og DLE-analyserne beskrevet detaljeret. Disse assays er afhængige af nærhedsligation for at detektere spirende og udvidede D-sløjfer i S. cerevisiae (figur 2)8,9. BIR-produkter kan kvantificeres ved hjælp af det samme analysesystem. For begge assays induceres DSB-dannelse på et HO-endonukleaseskæringssted placeret på URA3-locus på kromosom (Chr.) V ved ekspression af HO-endonukleasen under kontrol af en galactose-inducerbar promotor. Rad51-medieret DNA-strenginvasion fører til spirende D-loop-dannelse på stedet for en ektopisk donor placeret på LYS2-stedet på Chr. II. Da højre side af DSB mangler homologi til donoren, er reparation via SDSA og dHJ dannelse ikke mulig. Indledende reparation af DSB ved BIR er mulig, men dannelsen af levedygtige produkter hæmmes af tilstedeværelsen af centromeren21. Dette bevidste design forhindrer produktiv DSB-reparation og undgår derved genoptagelse af vækst af celler med reparerede DBS'er, som ellers kunne overhale kulturen i løbet af tidsbaneanalysen.

I DLC-analysen bevarer psoralen-tværbindingen af de to tråde af heteroduplex-DNA'et i D-loopet rekombinationsmellemproduktet. Efter restriktionsenzymets restaurering på den ødelagte (resekterede) streng og fordøjelse giver tværbindingen mulighed for ligering af de unikke sekvenser opstrøms for de homologe brudte og donor-DNA'er. Ved hjælp af qPCR kvantificeres niveauet af kimært DNA-molekyle, der er til stede i hver prøve. I DLE-analysen er tværbinding ikke påkrævet, og restriktionsenzymets restaurering og fordøjelse efterfulgt af intramolekylær ligering forbinder i stedet 5'-enden af det ødelagte molekyle til den nyligt udvidede 3'-ende. Igen bruges qPCR til at kvantificere de relative mængder af dette kimære produkt i hver prøve. I mangel af restriktionsenzymgendannelse rapporterer DLE-analysen om de relative niveauer af BIR (dsDNA) -produktet, der dannes efter D-loop-udvidelse.

Repræsentative resultater for hvert assay ved hjælp af en vildtypestamme vises, og læsere henvises til Piazza et al.8 og Piazza et al.9 til brug for disse assays til analyse af rekombinationsmutanter 8,9. Hensigten med dette bidrag er at gøre det muligt for andre laboratorier at vedtage DLC- og DLE-analyserne, og støtte til dem er tilgængelig efter anmodning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forvækst, DSB-introduktion og prøveindsamling

BEMÆRK: Tilskud af alle medier med 0,01% adenin anbefales til ade- stammer.

  1. Stribe de passende haploide stammer (se tabel 1) på gærpepton dextrose adenin (YPDA) ( 1% gærekstrakt, 2% peptone, 2% glucose, 2% agar, 0,001% adenin) og vokse i 2 dage ved 30 °C.
  2. Brug en enkelt koloni til at pode 5 ml YPDA i et 15 ml glaskulturrør. Dyrkning af kulturer til mætning ved 30 °C med omrystning eller rotation til beluftning.
  3. DLC-analyse: Forbered 5x psoralenstamopløsningen (0,5 mg/ml trioxsalen i 200-sikker ethanol) i en røghætte ved at opløse psoralen i et 50 ml konisk rør indpakket i aluminiumsfolie natten over ved stuetemperatur med kontinuerlig omrystning eller inversion. Forsegl skruepladen med en gennemsigtig film for at forhindre fordampning. Der må ikke fremstilles mere end 7 ml 5x psoralenstamopløsning pr. 50 ml konisk rør for at sikre korrekt opløsning af psoralen.
  4. Den næste dag skal du bruge 5 ml af YPDA dyrket natten over til at inokulere 50-100 ml YEP-lactat (1% gærekstrakt, 2% peptone, 2% w / w lactat, 0,001% adenin) i en passende størrelse kolbe (spirende gær vokser optimalt i en kolbe, der er mindst 5x kulturens volumen) til en OD600 på ~ 0,03.
  5. Dyrk kulturen i ~ 16 timer ved 30 ° C med omrystning ved 220 o / min. Efter ~ 16 timer måles OD600 af kulturen, og den skal være ~ 0,5-0,8. Brug ikke under- eller tilgroede kulturer.
  6. For hvert tidspunkt samles det passende volumen celler i et konisk rør og placeres på is. Dette er typisk 1 x 108 celler (ca. 7,5 ml kultur ved OD 600 1,0 for en haploid vildtypestamme) til DLC-analysen og 5 x 107 celler (ca. 2,5 ml kultur ved OD600 1,0) til DLE-analysen.
  7. For at sikre nøjagtigheden af OD 600-værdierne skal du forberede 1:5 fortyndinger til kulturer med en OD600≥0,2 for at holde OD-aflæsningen på 0,2 eller derunder. For vildtypestammer er optimale tidspunkter for DLC-analyse mellem 2 timer og 6 timer, og optimale tidspunkter for DLE-analyse er mellem 4 timer og 8 timer (se figur 3 og figur 4).
  8. DLC-analyse
    1. Før hvert tidspunkt fremstilles nok 1x psoralenopløsning (0,1 mg / ml trioxsalen, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% ethanol) i en røghætte til alle prøverne i et 50 ml konisk rør indpakket i folie. Orlov på RT.
    2. Prøverne centrifugeres ved 2 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender pelleten i 2,5 ml 1x psoralenopløsning i en røghætte og overfør til en 60 mm x 15 mm petriskål. Alternativt kan pelleten genanvendes i 2,5 ml TE1-opløsning (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) for en kontrol uden tværbinding.
    3. Krydslink prøverne. For en UV-crosslinker, der passer til langbølgepærer (365 nm), skal du placere petriskålene 1-2 cm under UV-lyskilden med låget fjernet oven på en plast- eller plexiglasplade, der er forkølet ved -20 ° C. For en UV-lysboks skal du placere petriskålene direkte oven på UV-lyskilden. Udsæt prøverne i 10 minutter med blid omrystning.
      BEMÆRK: Det anbefales at indstille UV-lyskilden oven på en orbital shaker indstillet til ~ 50 o / min.
    4. I en røghætte overføres prøven til et nyt 15 ml rør. Skyl petriskålen med 2,5 ml TE1-opløsning, og tilsæt dette til røret. Prøverne centrifugeres ved 2.500 x g i 5 minutter ved 4 °C, supernatanten bortskaffes korrekt, og pelleten opbevares ved -20 ° C. Prøverne kan opbevares i op til 1 uge, før de går videre til næste trin.
  9. DLE-analyse
    1. Prøverne centrifugeres ved 2 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Cellepellet vaskes i 2,5 ml kold TE1-opløsning, før centrifugeringen gentages, og pellets opbevares ved -20 °C. Prøver kan opbevares i op til 1 uge, før de går videre til næste trin.
  10. Til prøveindsamling ved 0 timer indsamles prøverne inden tilsætning af 20% galactose. For efterfølgende tidspunkter induceres DSB-dannelse ved at tilføje 20% galactose til kulturerne til en endelig koncentration på 2%. De resterende prøver indsamles som beskrevet ovenfor, pellet, og fryses i forhold til tiden efter DSB-induktion (dvs. 4 timers prøven opsamles 4 timer efter tilsætning af 20% galactose).

2. Celle spheroplasting, lysis og restriktion site restaurering

  1. Tø prøverne op på is. Forvarm et tørt bad til 30 °C.
  2. Prøverne gensuspenderes i 1 ml sfæroplasteringsbuffer (0,4 M sorbitol, 0,4 M KCl, 40 mM natriumphosphatbuffer pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) og overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  3. Der tilsættes 3,5 μL zymolyaseopløsning (2 % glucose, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml zymolyase 100T; 17,5 μg/ml zymolyase slutkoncentration). Bland forsigtigt ved at trykke eller inversionere. Inkuber ved 30 °C i 15 min., og læg dem derefter på is. I løbet af 15 minutters inkubation opnås flydende nitrogen eller tøris.
  4. Der centrifugeres i 3 minutter ved 2 500 x g ved 4 °C, og prøverne lægges på is. Prøverne vaskes 3x i 1 ml sfæroplastrende buffer. Prøverne centrifugeres i 3 minutter ved 2 500 x g ved 4 °C.
  5. Prøverne resuspenderes i 1 ml kold 1x restriktionsenzymbuffer (50 mM kaliumacetat, 20 mM Trisacetat, 10 mM magnesiumacetat, 100 μg/ml BSA pH ~8,0 ved RT) og centrifuge i 3 minutter ved 16.000 x g ved 4 °C. Placer prøverne på is. Gentag vasken 1x.
  6. Resuspender prøverne i 1 ml kold 1x restriktionsenzymbuffer. Prøven (0,5 ml hver) opdeles i to 1,5 ml mikrocentrifugerør. Prøverne centrifugeres i 3 minutter ved 16 000 x g ved 4 °C.
  7. Resuspender et rør fra hver prøve i 180 μL 1,4x restriktionsenzymbuffer med hybridiserende oligoer (se tabel 2) og et rør i 180 μL 1,4x restriktionsenzymbuffer uden hybridiserende oligoer. Hver hybridiserende oligo resuspenderes i 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) og anvendes i en slutkoncentration på 7 nM. 1x TE erstatter de hybridiserende oligoer i 1,4x restriktionsenzymbufferen uden hybridiserende oligoer.
    BEMÆRK: De hybridiserende oligoer skal opbevares ved -20 °C i små alikvoter ved arbejdsfortyndingen. Koncentrationen af hybridiserende oligoer kan kræve optimering; se Diskussion.
  8. Fastfrys prøverne i flydende nitrogen eller tøris/ethanol og opbevares ved -80 °C. Prøver kan opbevares på dette stadium i flere måneder.

3. Restriktionsenzymfordøjelse og intramolekylær ligering

  1. Tø prøverne op på is. Forvarm et tørt bad til 65 °C og et andet til 37 °C.
  2. 36 μL af prøven pipetteres til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør på is. Den resterende prøve returneres straks til -80 °C til opbevaring.
  3. Tilsæt 4 μL 1% SDS (0,1% endelig koncentration) og bland ved forsigtigt at banke på siden af røret. Inkuberes ved 65 °C i 15 minutter med blidt tryk hvert 5. minut. Prøver lægges på is umiddelbart efter inkubationen.
    BEMÆRK: Denne SDS-behandling fremmer denaturering af DNA-associerede proteiner, opløselighed af den nukleare kuvert og kromatintilgængelighed forud for restriktionsenzymfordøjelsen og intramolekylære ligeringstrin.
  4. Tilsæt 4,5 μL 10% Triton X-100 (1% endelig koncentration) og bland ved pipettering. Der tilsættes 20-50 U restriktionsenzym (EcoRI-HF eller HindIII-HF) til hver prøve og inkuberes ved 37 °C i 1 time med blid omrøring hvert 20.-30. min. I løbet af denne tid forvarmes et tørt bad til 55 °C, og der forudindstilles et vandbad til 16 °C.
  5. Der tilsættes 8,6 μL 10 % SDS (1,5 % slutkoncentration) til hver prøve og blandes ved pipettering og tapning. Inkuberes ved 55 °C i 10 min. Der tilsættes 80 μL 10 % Triton X-100 (6 % endelig koncentration) til hver prøve og blandes ved pipettering.
  6. Der tilsættes 660 μL 1x ligeringsbuffer uden ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2,5 μg/ml BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA-ligase (8 U/prøve) til hver prøve og blandes ved skånsom inversion. Inkuberes ved 16 °C i 1,5 time med inversion hvert 30. minut. Prøverne lægges på is umiddelbart efter inkubationen.

4. DNA-oprensning

  1. Forvarm et tørt bad til 65 °C og et andet til 37 °C. Der tilsættes 1 μL 10 mg/ml proteinase K (fremstillet i 1x TE pH 8,0) til hver prøve (12,5 μg/ml slutkoncentration). Der inkuberes ved 65 °C i 30 minutter, og prøverne lægges på is umiddelbart efter inkubationen, indtil de er afkølet.
  2. Overfør prøverne til 2 ml rør. Ved arbejde i en stinkskab tilsættes et tilsvarende volumen (~800 μL) phenol/chloroform/isoamylalkohol (P/C/IA; pH 8,0) til hver prøve. Hvirvel prøverne i ~30 s og centrifuge prøverne i 5-10 min ved 16.000 x g i en mikrocentrifuge.
  3. 600 μL af den øverste fase af hver prøve fjernes forsigtigt i et nyt 1,5 ml rør. Bortskaf den nederste fase og 2 ml rør korrekt.
  4. Udfælde DNA'et ved at tilsætte et 1/10 volumen af 3 M natriumacetat pH 5,2 (~ 60 μL) til hver prøve efterfulgt af 1 volumen isopropanol (~ 660 μL). Vend prøverne 5x-10x og inkuber ved RT i 30 min.
  5. Prøverne lægges på is i 2 minutter, og prøverne centrifugeres derefter ved 16.500 x g i 15 minutter ved 4 °C i en mikrocentrifuge. Sæt prøverne tilbage på is, hæld supernatanten af, og tøm røret på et papirhåndklæde.
  6. Dna-pellet vaskes med 200 μL 70% ethanol. Der centrifugeres ved 16.500 x g i 3 minutter ved 4 °C, prøverne lægges tilbage på is, supernatanten hældes af, og restalkoholen fjernes med en pipet. Prøverne tørres med rørets hætter åbne ved 37 °C i 15-20 min.
  7. Resuspender DNA-pellets i 50 μL 1x TE ved hvirveldannelse. Inkuberes ved RT i 30 min, hvirvel, og inkuberes derefter ved 37 °C i et tørt bad i 30 min. Hvirvel prøverne igen, og læg dem derefter på is. Prøver kan opbevares på dette stadium ved -20 °C i flere måneder, men det tilrådes at fortsætte straks for decrosslinking (kun DLC) og qPCR-trin.

5. Psoralen tværbindingsvending (kun til DLC-assay)

  1. Pipet 9 μL renset DNA i et PCR-rør på is. Der tilsættes 1 μL 1 M KOH (0,1 M slutkoncentration). Prøverne inkuberes ved 90 °C i 30 minutter i en termocyklator.
  2. Der tilsættes 19,73 μL natriumacetatopløsning (0,1 M natriumacetat, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). Prøver kan opbevares på dette stadium ved -20 ° C i flere måneder, men det tilrådes at gå straks til qPCR-trinnet.

6. Kvantitativ PCR, kontrol og analyse

  1. Ved hjælp af 2 μL renset DNA, med eller uden tværbinding, opsættes en 20 μL qPCR-reaktion i henhold til producentens anvisninger. Indstil hver reaktion i to eksemplarer. For både DLC- og DLE-assays er der fem kontrolreaktioner og en DLC/DLE-kvantificeringsreaktion eller i alt seks reaktioner pr. prøve, der køres i to eksemplarer. Supplerende tabel S1 og supplerende tabel S2 indeholder en skabelon til opsætning af disse reaktioner og analyser, og sekvenserne af qPCR-primerne er angivet i tabel 3.
  2. qPCR-cykelforhold skal optimeres for hvert qPCR-sæt.
    1. Brug følgende DLC qPCR-betingelser, afhængigt af de anvendte qPCR-sæt: indledende denaturering (95 °C i 3 minutter); 50 runder forstærkning (95 °C for 15 s, 61 °C for 25 s, 72 °C for 15 s med en enkelt anskaffelse) analyse af smeltekurven (95 °C for 5 s, 65 °C for 1 min., 97 °C ved kontinuerlig anskaffelse); og køling (37 °C i 30 s).
    2. Brug følgende qPCR-betingelser for DLE-assayet: indledende denaturering (95 °C i 5 min.) 50 runder forstærkning (95 °C for 15 s, 60 °C for 30 s, 72 °C for 15 s med en enkelt anskaffelse) analyse af smeltekurven (95 °C for 5 s, 65 °C for 1 min., 97 °C ved kontinuerlig anskaffelse); og køling (37 °C i 30 s). Bemærk, at optimering til forskellige qPCR-maskiner/-sæt kan være påkrævet.
  3. DLC-analyse
    1. Kontroller: Se listen over qPCR-primere i tabel 3. Et kort over primerbindingsstederne er vist i figur S1. For supplerende sekvensfiler for de relevante genomiske funktioner og ampliconer skal du kontrollere A plasmid Editor (ApE) -filerne; Supplerende sekvensfiler 1-5.
      1. Genomisk DNA ved ARG4: Brug olWDH1760/olWDH1761 til at amplificere dsDNA placeret ved ARG4. Brug denne reaktion som en indlæsningskontrol, og normaliser alle andre reaktioner undtagen DLC-signalreaktionen på denne kontrol.
      2. Intramolekylær ligeringseffektivitet ved DAP2: Brug 1.904 bp-fragmentet skabt af EcoRI-fordøjelsen til intramolekylær ligering parallelt med DLC-ligeringen. Forstærkning på tværs af dette ligeringskryds rapporterer om den intramolekylære ligeringseffektivitet og fungerer som en kontrol, som DLC-signalet normaliseres til.
      3. DSB-induktion: Brug olWDH1766/olWDH1767 til at forstærke et område, der spænder over det inducerede DSB.
      4. Psoralen tværbinding og resektion: Brug olWDH2019/olWDH2020 til at forstærke den unikke PhiX-region nedstrøms for EcoRI-genkendelsesstedet. Uden tværbindingsvending skal du bruge forholdet mellem ssDNA (ingen tværbinding) over ARG4 (tværbundet dsDNA) til at bestemme tværbindingseffektiviteten. Med tværbindingsvending vil resektion føre til et progressivt fald fra 1 til 0,5 af signalet i forhold til ARG4.
      5. EcoR I genkendelsessted restaurering og skæring: Brug olWDH1768 / olWDH1764 til at forstærke et område, der spænder over det restaurerede EcoRI-genkendelsessted opstrøms for DSB på den resekterede streng. olWDH1769/olWDH1763 forstærker en region, der spænder over EcoRI-restriktionsenzymstedet ved DAP2. Udfør EcoRI-spaltning på dette sted til brug som intramolekylær ligeringskontrol.
    2. DLC-signal: Brug olWDH1764/olWDH1765 til at forstærke det kimære DNA-molekyle skabt ved intramolekylær ligering af den resekterede (invaderende) streng og donoren.
    3. Analyse: Beregn gennemsnits- og standardafvigelsen for Cp-værdierne for hver af duplikatreaktionerne. Brug ARG4 genomiske DNA qPCR Cp-værdier som reference til at normalisere alle de andre kontrol qPCR'er. Normaliser DLC-signalet til den intramolekylære ligeringskontrol ved DAP2. Se figur 3 for typiske DLC-signalværdier ved 2 timer.
  4. DLE-analyse
    1. Kontroller: Se listen over qPCR-primere i tabel 3. Et kort over primerbindingsstederne er vist i figur S1. For supplerende sekvensfiler for de relevante genomiske funktioner og ampliconer skal du kontrollere A plasmid Editor (ApE) filer (Supplementary Sequence Files 1-5).
      1. Genomisk DNA ved ARG4: Se pkt. 6.3.1.1.
      2. Intramolekylær ligeringseffektivitet ved YLR050C: Brug HindIII-fordøjelsen til at skabe et 765 bp-fragment, der vil gennemgå intramolekylær ligering parallelt med DLE-ligeringen. Forstærkning på tværs af dette ligeringskryds rapporterer om den intramolekylære ligeringseffektivitet og fungerer som en kontrol, som DLE-signalet normaliseres til.
      3. DSB indslusning: Se afsnit 6.3.1.3.
      4. Hind III genkendelsessted restaurering og skæring: Brug olWDH2010 / olWDH2012 og olWDH2009/2011 til at forstærke et område, der spænder over HindIII-restriktionsenzymstederne på den ødelagte streng, hvor den er blevet resekteret og udvidet, henholdsvis.
    2. DLE-signal: Brug olWDH2009/olWDH2010 til at forstærke det kimære DNA-molekyle skabt ved intramolekylær ligering af den resekterede ende af den invaderende streng opstrøms for DSB til den nyligt forlængede ende nedstrøms for DSB.
    3. Analyse: Beregn gennemsnits- og standardafvigelsen for Cp-værdierne for hver af duplikatreaktionerne. Brug ARG4 genomiske DNA qPCR Cp-værdier som reference til at normalisere alle de andre kontrol qPCR'er. Normaliser DLE-signalet til den intramolekylære ligeringskontrol ved YLR050C. Typiske DLE-signalværdier ved 6 timer er rapporteret i figur 4 og tidligere publikationer9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DLC-analyse
DLC-analysen registrerer både spirende og udvidede D-sløjfer dannet ved invasionen af en stedsspecifik DSB i en enkelt donor (figur 2). Psoralen tværbinding forbinder fysisk den ødelagte streng og donoren via heteroduplex-DNA'et i D-loopet. Restriktionsenzym site restaurering med en lang, hybridiserende oligo på den resekterede streng af pausen muliggør restriktion enzym spaltning, efterfulgt af ligering af den brudte streng til den proksimale donor til dannelse af et kimært produkt, der kvantificeres af qPCR. DLC-signalet afhænger især af psoralen-tværbindingen, den hybridiserende oligo, den centrale rekombinase, Rad51 og Rad51-tilbehørsfaktorerne Rad52 og Rad548. Sletning af DNA-helicaser/topoisomeraserne Sgs1-Top3-Rmi1, Mph1 og Srs2 fører til et øget DLC-signal.

Figur 3 viser de repræsentative resultater for standard vildtypestammen ved 2 timer efter DSB-induktion i tre eksemplarer med og uden hybridiserende oligo. En prøve, der mangler i et nøgletrin, psoralen tværbinding, vises også i to eksemplarer.

Som vist i figur 3 er psoralen tværbinding et kritisk skridt. Der er praktisk talt intet detekterbart signal uden det8. Tværbindingseffektivitet måles ud fra forholdet mellem ssDNA og dsDNA-amplifikation. I modsætning til dsDNA oplever ssDNA minimal psoralen tværbinding, og dermed indikerer et højt signal vellykket tværbinding. Tværbindingseffektiviteten varierer afhængigt af tiden mellem prøveindsamling og forberedelse til qPCR (figur 3, nederste venstre panel). Jo længere tid der går mellem prøveindsamling og forberedelse, jo mindre signal vil der blive observeret for qPCR-styringen af tværbindingseffektiviteten. Betydelig intersamplevariation i signalet, der observeres for qPCR-styringen af tværbindingseffektiviteten, giver anledning til bekymring, og tidsforløbet bør kasseres.

ARG4 Cp-værdier er ens mellem de med- og uden-hybridiserende oligoprøver (figur 3, øverste venstre panel). En lav Cp-værdi indikerer, at der er mere amplifierbart DNA til stede. Dette forklarer, hvorfor ARG4 Cp-værdierne for de ikke-tværbindende prøver er signifikant lavere: tværbinding interfererer med qPCR-forstærkning. Denne forskel mellem med- og uden-tværbindingsprøverne gælder for alle qPCR'er undtagen EcoRI-spaltnings-qPCR-kontrollen, som vil forstærke ssDNA / ikke-tværbundet dsDNA. Alle qPCR-kontroller, men ikke DLC-signalet, normaliseres til ARG4 qPCR-signalet.

For alle prøverne er den intramolekylære ligering qPCR-kontrol inden for det passende interval (figur 3, øverste midterpanel), og der er robust DSB-induktion, som det fremgår af det lave signal til qPCR-kontrollen, der forstærker på tværs af HO-endonukleasegenkendelsesstedet (figur 3, øverste højre panel). I de medhybridiserende oligoprøver observeres effektiv EcoRI-skæring, og denne qPCR-kontrol giver et lavt signal (figur 3, nederste midterpanel). Omvendt giver de uden-hybridiserende oligo med tværbindingsprøver et højt signal, svarende til hvad der er vist for tværbindingseffektiviteten qPCR-kontrol, da uskåret ssDNA i dette tilfælde forstærkes og normaliseres til ARG4 qPCR-signalet (dsDNA).

I modsætning til de andre qPCR'er normaliseres qPCR-signalet for DLC-assayet til den intramolekylære ligation qPCR-kontrol, da det kimære molekyle kvantificeret af DLC qPCR afhænger af ligering. Det mediane DLC-signal ved 2 timer med hybridiserende oligo er 0,030 ± 0,0055 (figur 3, nederst til højre), i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater for dette assay8. Som forventet afhænger dette signal af både hybridiserende oligo og psoralen tværbinding.

DLE-analyse
DLE-analysen giver mulighed for nøjagtig overvågning af D-loop-forlængelse som reaktion på et stedspecifikt DSB (figur 2). Det blev tidligere påvist, at DLE-signalet afhænger af Rad51, den centrale rekombinase i reaktionen, som medierer strenginvasion og derfor er nødvendig for rekombinationsassocieret DNA-syntese9. Derudover afhænger DLE-signalet af den katalytiske underenhed af Pol δ, Pol3 (DR, AP, WDH, ikke-offentliggjorte data), men ikke den ikke-væsentlige procesivitetsfaktor Pol32. I modsætning til DLC-signalet, som først bliver detekterbart ved 2 timer efter DSB-induktion, øges DLE-signalet først mærkbart ved 4 timer efter DSB-induktion, stiger dramatisk mellem 4 timer og 6 timer og begynder at plateau derefter, hvor meget af stigningen i signal mellem 6 timer og 8 timer kan tilskrives BIR-produktdannelse8, 9.

Da det kimære ligationsprodukt, der er kvantificeret i DLE-analysen, er enkeltstrenget, er cellesfæroplasterings- og lysistrinnet kritisk. Nedsat DLE-signal kan skyldes problemer med dette trin, som kan frigive nukleaser og føre til nedbrydning af målet ssDNA.

Figur 4 viser repræsentative resultater for standard vildtypestammen ved 6 timer efter DSB-induktion i tre eksemplarer med og uden hybridiserende oligoer. Vildtypeprøven uden hybridiserende oligoer repræsenterer dsDNA BIR-produktet alene, mens med-oligo-signalet er afledt af både ssDNA i den udvidede D-loop og dsDNA BIR-produktet. En tredje prøve er inkluderet som et eksempel på et mislykket eksperiment.

ARG4 Cp-værdierne var ens mellem de med- og uden-hybridiserende oligoprøver (figur 4, øverste venstre panel). ARG4 Cp-værdier var mærkbart lavere for den mislykkede prøve, hvilket indikerer, at denne prøve har mere genomisk DNA end de vellykkede prøver. qPCR-signalerne til qPCR-kontrollerne, men ikke DLE-signalet, blev normaliseret til ARG4 qPCR-signalet. Den intramolekylære ligering qPCR-kontrol afslørede et acceptabelt signal for de med- og uden-hybridiserende oligoprøver (mellem ~ 0,15-0,35), men et væsentligt lavere signal for den mislykkede prøve (figur 4, øverste midterste panel). I denne mislykkede prøve forårsagede den høje mængde genomisk DNA, der blev indikeret af ARG4 qPCR-kontrollen, sandsynligvis, at den intramolekylære ligering mislykkedes, da en høj koncentration af genomisk DNA vil føre til intermolekylær ligering.

I alle tre stikprøver var der robust DSB-induktion (figur 4, øverste højre panel). Hind III spaltning på både de resekterede og udvidede tråde afhænger af tilstedeværelsen af de hybridiserende oligoer. På den udvidede streng afhænger det desuden af D-loop-forlængelse. Der var således en signifikant forskel i forstærkning på tværs af HindIII-spaltningsstedet på den resekterede streng mellem med- og uden-oligoprøverne (figur 4, nederste venstre panel) og en mindre forskel i forstærkning på tværs af hindIII-genkendelsesstedet på den udvidede streng mellem disse prøver (figur 4, bund-midterpanel).

Da DLE-signalet afhænger af intramolekylær ligering, normaliseres det til den intramolekylære ligering qPCR-kontrol. Det mediane DLE-signal ved 6 timer med hybridiserende oligoer var 0,53 ± 0,17 (figur 4, nederst til højre), i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater for dette assay9. DLE-signalet til vildtypeprøven uden hybridiserende oligoer var ligeledes kompatibelt med denne tidligere offentliggørelse. DLE-signalet var lavere end forventet for den mislykkede prøve, hvilket sandsynligvis afspejler problemerne med den ovenfor nævnte prøve.

Tilbageførsel af tværbinding
Psoralen interkaleret mellem ApT/TpA-basepar i dsDNA kan gennem sine furan- og pyronringe blive kovalent forbundet med en eller begge modsatrettede thyminbaser ved UV-bestråling, hvilket resulterer i (overvejende furan) monoaddukter eller interstrengede di-addukter (dvs. tværbindinger), henholdsvis22. Disse modifikationer forventes at blokere DNA-polymerasens progression og dermed hæmme DNA-syntesereaktionen integreret i kvantitativ PCR. Derfor kan de fleste dsDNA-skabeloner ikke forstærkes (figur 5A, B). I modsætning hertil gør fraværet af basepar i ssDNA det mindre tilbøjeligt til psoralen tværbinding. Det forstærkes således lettere end dsDNA, hvilket forvrænger den relative kvantificering af ssDNA versus dsDNA og af dsDNA-ampliconer af forskellig længde og ApT/TpA-indhold (figur 5A,B). For at overvinde disse begrænsninger blev der anvendt en base- og varmekatalyseret vending af psoralen tværbindingsvending trin23 forud for den kvantitative PCR. Denne metode efterlader kun de mindre arter af pyron-side mono-addukter23,24. Det førte til en 80 gange genopretning af genomisk dsDNA og intramolekylære ligerationskontrolampliconer, hvilket indikerer, at langt de fleste skabelonmolekyler havde mindst en furan-side monoadduct eller inter-streng tværbinding (figur 5B, C). Sammenligningen af Cp-værdierne for dsDNA genomisk DNA-kontrol før og efter tværbindingsvending giver et skøn over tværbindingseffektiviteten, som skal være inden for det område, der er vist her. Ud over korte ampliconer kan denne procedure gendanne skabeloner op til 3 kb lange (figur S2). Der blev ikke observeret nogen ændring for ssDNA-ampliconen, hvilket var i overensstemmelse med mangel på psoralen-tværbinding til ssDNA (figur 5B-D). Det viser også, at tværbindingsreverseringsproceduren ikke påviseligt beskadiger DNA23. Genvinding af DLC kimæramplicon, som indeholder et tværbundet dsDNA-segment ligeret til et ikke-tværbundet ds-ssDNA-segment (50 bp og 118 bp/nt; Figur 5A) var mellemliggende til dsDNA og ssDNA ampliconer, med en 8 gange forbedring i genopretning (figur 5B, C). Crosslink-vending påvirkede ikke de relative niveauer af de to dsDNA-ampliconer, idet den intramolekylære ligationskontrol forblev i området 0,2-0,25 i forhold til den genomiske DNA-kontrol (figur 5E). Det ændrede imidlertid den relative mængde af ssDNA-ampliconen i forhold til dsDNA-genomisk DNA-kontrol fra et 40 gange overskud til det forventede 0,5 gange for et ssDNA i forhold til en dsDNA-skabelon (figur 5D). Ligeledes faldt det delvist ssDNA DLC-signal fra 6,6 x 10-2 til 6,6 x 10-3 i forhold til dsDNA intramolekylære ligeringskontroller (figur 5F). Dette får os til at estimere antallet af D-loop-ledmolekyler ved en interkromosomal donor detekteret ved denne tilgang 4 timer efter DSB-induktion til at være et gennemsnit på 1,3% af de samlede brudte molekyler i cellepopulationen. Sådanne absolutte estimater kunne ikke foretages med psoralenbaseret forvrængning af dsDNA og ssDNA-amplifikation, hvilket fremhæver værdien af dette yderligere tværbindingsvendingstrin.

Figure 1
Figur 1: Homolog rekombination og opløsningsunderveje. Efter DNA-skader, der resulterer i en en- eller to-endede DSB (vist) eller et ssDNA-hul, afslører 5' til 3' resektion af DNA-enderne 3' ssDNA-udhæng, hvorpå Rad51-glødetråden dannes, hjulpet af dens tilbehørsfaktorer. Rad51 søger derefter i genomet efter et intakt duplex-DNA (dvs. donoren), hvorpå reparationshændelsen skal placeres. Denne proces kulminerer i DNA-strenginvasion, hvor den ødelagte streng Watson-Crick-base parres med den komplementære streng af den dobbeltstrengede DNA-donor, fortrænger den modsatte streng og danner den spirende D-loop. Denne D-loop kan enten vendes for at tillade Rad51-homologisøgning at vælge en anden donor eller udvides med en DNA-polymerase for at erstatte de baser, der går tabt under DNA-skadehændelsen. Tre HR-underveje er tilgængelige for at løse dette udvidede D-loop-mellemprodukt til et produkt. For det første kan den udvidede D-loop forstyrres af en helicase, hvilket tillader den nyligt forlængede ende af bruddet at gløde til den anden ende i en proces, der kaldes synteseafhængig strengglødning (SDSA). Udfyldning af DNA-syntese og ligering fører derefter til produktdannelse. Alternativt kan den anden ende af pausen udglødes til den fordrevne donorstreng og danne et dobbelt-Holliday-kryds (dHJ). Nukleolytisk opløsning af dHJ resulterer i enten en crossover (CO) eller ikke-crossover (NCO), mens dHJ-opløsning (ikke vist) kun resulterer i NCO-produkter. Endelig resulterer manglende aktivering af den anden ende af DSB i break-induceret replikation (BIR), en mutagent proces, hvor tusindvis af basepar kopieres fra donoren til den ødelagte streng. Denne proces kan strække sig så langt som den konvergerende replikationsgaffel eller slutningen af kromosomet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Forudsætningen for D-loop capture (DLC), D-loop extension (DLE) og break-induced replication (BIR) produktdannelsesanalyser. DSB-formationen er drevet af en stedsspecifik endonuklease under kontrol af GAL1-arrangøren . DSB induktion fører til dannelsen af en spirende D-sløjfe. I DLC-analysen bevarer interstrenget tværbinding af DNA'et denne struktur, som derefter ekstraheres. Restriktionsenzym site restaurering opnås via hybridisering med et langt oligonukleotid, og derefter fordøjes DNA'et og ligeres for at danne et produkt, der kan kvantificeres ved kvantitativ PCR (qPCR). DLE-analysen adskiller sig ved, at DNA'et ikke er tværbundet, og i stedet dannes det intramolekylære ligationsprodukt mellem de to ender af ssDNA på den ene side af bruddet, idet 3'-enden er blevet forlænget med en DNA-polymerase. qPCR bruges igen til at kvantificere dannelsen af det kimære ligationsprodukt. Detektion af D-loop-forlængelse via DLE-assayet kræver ligeledes restriktionsenzymgendannelse. I modsætning hertil detekteres det dobbeltstrengede BIR-produkt ved hjælp af DLE-assayprimerne uden hybridiserende oligonukleotider. R angiver, at et restriktionsenzymsted er kompetent til enzymspaltning; (R) angiver et restriktionsenzymsted, der ikke kan skæres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative resultater fra DLC-analyseanalyse af D-loops ved 2 timer efter DSB-induktion. Prøver blev indsamlet, forberedt og analyseret af qPCR som beskrevet i denne protokol. Blå symboler repræsenterer resultater for standard wild type stammen med hybridiserende oligoer for n = 3. Grønne symboler repræsenterer resultater for wild type-stammen uden hybridisering af oligoer for n = 3. Den tykke røde linje viser medianen. De lilla symboler repræsenterer prøver uden psoralen tværbinding, men med hybridiserende oligoer for n = 2. Symboler angiver, at prøverne stammer fra den samme kultur. Intereksperimentelle forskelle i tværbindingseffektivitet kan introducere variabilitet i visse qPCR-kontroller, men er ikke problematiske, så længe der ikke er nogen variation mellem prøver i disse qPCR-kontroller inden for et eksperiment. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative resultater fra DLE-analyseanalyse 6 timer efter DSB-induktion. Prøver blev indsamlet, forberedt og analyseret af qPCR som beskrevet i denne protokol. Blå symboler repræsenterer resultater for standard wild type stammen med hybridiserende oligoer for n = 3. Grønne symboler repræsenterer resultater for wild type-stammen uden hybridisering af oligoer for n = 3. Den tykke røde linje viser medianen. Bemærk, at de med- og uden-hybridiserende oligoprøver stammer fra de samme kulturer. Den lilla diamant repræsenterer en mislykket prøve uden hybridisering af oligoer for n = 1. Symboler angiver, at prøverne stammer fra den samme kultur. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative resultater fra psoralen tværbindingsvending . (A) Psoralen-DNA mono-addukter (*) og inter-strengede tværbindinger (X) forekommer specifikt på dsDNA og forhindrer dets forstærkning af DNA-polymeraser, i modsætning til ssDNA-skabeloner. Denne forskel introducerer en bias i kvantificeringen af dsDNA- og ssDNA-holdige skabeloner ved qPCR. Denne bias kan overvindes ved vending af psoralen tværbinding. (B) Repræsentative Cp-værdier af dsDNA (genomisk, ligering), ssDNA og blandede ds-ssDNA (DLC) ampliconer opnået 4 timer efter DSB-induktion. Data repræsenterer individuelle værdier og medianen af fire biologiske replikater. (C) Forstærkningsgendannelse ved tværbindingsvending, beregnet ud fra Cp-værdierne i (B). (D) ssDNA-amplifikationen i forhold til den genomiske dsDNA-kontrol med og uden psoralen tværbindingsvending. Ved vending amplificeres ssDNA-ampliconen ved de forventede 0,5 af den genomiske dsDNA-kontrol. (E) dsDNA intramolekylær ligeringskontrol i forhold til den genomiske dsDNA-kontrol med og uden psoralen tværbindingsvending. (F) DLC-signalet i forhold til dsDNA-ligeringskontrollen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Nuværende DLC/DLE-analysesystem og de foreslåede ændringer. Ovenfor: Nuværende DLC/DLE-analysested og donor vises. Nedenfor: Planlagte ændringer af DLC/DLE-analysestedet og donoren. (I) 117 bp HO endonukleaseskæringsstedet er angivet med gult. For at forhindre forstyrrende virkninger under overvågning af D-loop-forstyrrelser vil venstre side af HOcs (74 bp) blive introduceret i donoren, således at rekombination mellem de to skaber en perfekt matchet D-loop, der mangler en 3'-klap. (II) For at gøre systemet reparerbart og dermed mere fysiologisk indsættes DNA, der er homologt med donoren (angivet med blågrøn og lilla), i højre side af HOcs. (III) Invasion og forlængelse af strengen til højre for HOcs overvåges ved hjælp af sekvenser, der er unikke for den side af bruddet (angivet med orange). (IV) Yderligere jævnt fordelte restriktionsenzymsteder og sekvenser, der er unikke for donoren, vil gøre det muligt at overvåge D-loop-forlængelse (via invasion fra venstre side af HOcs) på fjernere steder. I dette modificerede system kan synteseafhængig strengglødning (SDSA) eller dobbelt-Holliday-krydsdannelse (dHJ) forekomme på de steder, der er vist i blågrøn eller lilla. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Kort over de qPCR-primere, der anvendes i DLC- og DLE-assays. Kort over de genomiske loci, der anvendes til analyse i DLC- og DLE-assays, deres relevante funktioner og de omtrentlige primerbindingssteder (se tabel 3 for en liste over qPCR-primere). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Kvalitativ vurdering af tværbindingsvending på store ampliconer. Genomisk DNA blev fremstillet af tværbundne eller ikke-tværbundne prøver, hvor det som beskrevet i protokollen er angivet afsnit 1-5. Ikke-kvantitativ PCR blev brugt til at forstærke 3 kbp-segmentet, der spænder over homologiområdet, der deles mellem pausestedet og donoren. Bemærk, at på grund af forskellene i amplifikationseffektivitet mellem tværbundet og ikke-tværbundet DNA og den begrænsede mængde prøve var det ikke muligt at standardisere input-DNA'et. Klik her for at downloade denne fil.

Tabel 1: S. cerevisiae stamme anvendt til DLC og DLE assay analyse. Genotype af den haploide spirende gærstamme, der anvendes i denne undersøgelse. Stammen er tilgængelig efter anmodning. Yderligere stammer, der er tilgængelige til DLC/DLE-analyseanalyse, findes i Piazza et al.8 og Piazza et al.9. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Hybridisering af oligonukleotider anvendt til DLC- og DLE-analyse. Sekvenserne af de lange, hybridiserende oligonukleotider, der anvendes i DLC- og DLE-assays. Yderligere SDS-PAGE oprensning af hybridiserende oligonukleotider af den brugerdefinerede oligonukleotidudbyder anbefales. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: qPCR-primere, der bruges til DLC- og DLE-analyse. qPCR-primerparrene til DLC- og DLE-assays og beskrivelser af deres formål. Bemærk, at olWDH1764, olWDH2009 og olWDH2010 bruges i to qPCR'er. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel S1: Skabelon til DLC-analyse qPCR-opsætning og analyse. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel S2: Skabelon til DLE-assay qPCR-opsætning og analyse. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende sekvensfiler 1-5. Supplerende sekvensfiler for de relevante genomiske træk og ampliconer. Sekvensfilerne er i ApE-filformatet; ApE er en frit tilgængelig software til visning og redigering af DNA-sekvenser. ApE-filer er også kompatible med al større sekvensredigeringssoftware. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De præsenterede assays giver mulighed for påvisning af spirende og udvidede D-sløjfer (DLC-assay), D-loop-udvidelse (DLE-assay) og BIR-produktdannelse (DLE-assay uden hybridiserende oligonukleotider) ved hjælp af nærhedsligering og qPCR. ChIP-qPCR af Rad51 til steder fjernt fra DSB har tidligere været brugt som proxy for Rad51-medieret homologisøgning og D-loop-dannelse. Dette ChIP-qPCR-signal er imidlertid uafhængigt af sekvenshomologien mellem brudstedet og en potentiel donor samt den Rad51-associerede faktor Rad54 og er således mere tilbøjelig til at repræsentere en forbigående sammenhæng mellem Rad51-ssDNA-filamentet og dsDNA snarere end en D-loop mellemliggende10,11. I modsætning hertil afhænger DLC-signalet af DSB-formation, Rad51, Rad52, Rad54 og delt sekvenshomologi mellem DSB og donorstedet analyserede8. Desuden observeres øgede DLC-signaler i fravær af Mph1- og Srs2-helicases og Sgs1-Top3-Rmi1-helicase-topoisomerase-komplekset, i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at disse tre faktorer kan adskille Rad51/Rad54-fremstillede spirende D-loops in vitro 8,25,26,27. DLE-analysen repræsenterer ligeledes en forbedring i forhold til tidligere metoder til at følge rekombinationsassocieret DNA-syntese, da den kan skelne mellem D-loop-udvidelse og BIR-produktdannelse19.

Som diskuteret ovenfor er qPCR-kontrollerne, herunder dem til genomisk DNA, DSB-induktion, psoralen-tværbinding, intramolekylær ligering og oligonukleotidhybridisering, afgørende for succesen og reproducerbarheden af disse assays. Rå genomiske DNA qPCR-værdier skal være omtrent ækvivalente på tværs af prøver. Lave Cp-værdier for ARG4 genomisk DNA-kontrol indikerer overskydende DNA, og antallet af indsamlede celler bør justeres. Høje Cp-værdier for denne kontrol indikerer utilstrækkelig DNA-genopretning eller forurening med reagenser, der forstyrrer qPCR. Efter spheroplasting kan cellelyse observeres ved hjælp af et standard lysmikroskop og lige store mængder prøve og sterilt vand. Hvis der ikke observeres tilstrækkelig lysis ved tilsætning af vand, skal zymolyaseopløsningen genfremstilles, eller inkubationen ved 30 °C skal forlænges. Prøven kan også gå tabt eller forurenende stoffer indføres under DNA-oprensning ved P / C / IA-ekstraktion. For effektiv genvinding af DNA bør man sikre, at pH-værdien i P/C/IA er justeret til ~8,0, og at den nederste fase ikke forstyrres, mens den øvre fase fjernes. Endelig kan ineffektiv resuspension af DNA-pellet i 1x TE resultere i lave Cp-værdier. En længere inkubation ved 37 °C og hvirveldannelse vil forbedre resuspensionen af DNA-pelleten.

Ud over den genomiske DNA-genomiske DNA-kontrol bør DSB-induktions- og restriktionsenzymspaltningskontrolreaktionerne også være ens på tværs af prøver. HO-endonuklease eller restriktionsenzymskæring på DSB's sted eller restriktionsenzymgenkendelsessted forhindrer forstærkning i hele denne region; derfor er typiske normaliserede qPCR-værdier for disse kontrolelementer tæt på nul, og en høj qPCR-værdi indikerer utilstrækkelig spaltning. Hvis der observeres et højt signal på DSB's sted, skal galactoseopløsningen laves om. For mutanter med en kendt cellecyklusdefekt bør DSB-induktion kvantificeres ved at plettere lige store mængder kultur dyrket i henhold til protokollen (se afsnit 1) om YPDA- og YPA-medier suppleret med galactose. Kolonier, der vokser på medier, der indeholder galactose, repræsenterer gær, hvor slutsammenføjning skabte en uadskillelig HOcs. Hvis der er væsentligt flere slutsammenføjningshændelser i en mutant af interesse i forhold til vildtypen, skal der anvendes en korrektion for at kompensere for denne forskel i DSB-induktion, som vil påvirke DLC/DLE-signalet.

Tre primerpar (olWDH1764/olWDH1768, olWDH2010/olWDH2012 og olWDH2009/olWDH2011) vurderer restriktionsenzymets restaurering ved hybridiserende oligoer og skæring af EcoRI-HF- og HindIII-HF-restriktionsenzymerne. Desuden afhænger de intramolekylære ligeringskontroller også af tilstrækkelig restriktionsenzymfordøjelse. Således har en prøve med lav intramolekylær ligeringseffektivitet og et højt signal for et af disse tre primerpar utilstrækkelig restriktionsenzymskæring. Yderligere restriktionsenzym bør tilvejebringes i efterfølgende præparater, og restriktionsenzymets effektivitet bør vurderes på genomisk DNA. Primerparret olWDH1769/olWDH1763 repræsenterer en ekstra kontrol for DLC-analysen, som måler EcoRI-spaltning ved DAP2, hvor intramolekylær ligeringseffektivitet også måles. En prøve med et tilstrækkeligt intramolekylært ligeringssignal, men et højt signal for et af disse tre primerpar, har utilstrækkelig restriktionsenzymgendannelse ved hybridiserende oligoer. For at løse dette problem bør der indsamles duplikatprøver, og koncentrationen af de berørte hybridiserende oligoer bør varieres. Typiske qPCR-værdier opnået for disse reaktioner med og uden hybridiserende oligoer findes i figur 3 og figur 4 og i Piazza et al.8 og Piazza et al.9.

For både DLC- og DLE-analysen betragtes en intramolekylær ligationseffektivitet på 0,15-0,35 som normaliseret til den genomiske DNA-kontrol som normal. Da detektion af spirende og udvidede D-sløjfer og BIR-produktet er afhængig af effektiv ligering, skal prøver med lave ligeringssignaler kasseres. Den 10x ligeringsbuffer, der mangler ATP, bør opbevares ved 4 °C i højst 6 måneder. Indsamling af for mange celler kan føre til intermolekylær ligering, hvilket vil resultere i lav intramolekylær ligeringseffektivitet og DLC / DLE-signal.

Selvom disse kontroller til DLC- og DLE-assays rapporterer om næsten alle følsomme trin, er det stadig muligt at opnå ikke-fysiologiske værdier for DLC- eller DLE-signalet, når disse kontroller er inden for det passende interval. Et lavt DLC- eller DLE-signal kan skyldes fejl i cellesfærisketrinnet, som er ekstremt følsomt. Man bør kun behandle nogle få prøver parallelt og holde dem ved 4 °C hele tiden. Et højt/lavt DLC/DLE-signal kan også være resultatet af indsamling af for mange/få celler på hvert tidspunkt. Dette problem kan løses ved at indsamle flere OD600s celler på hvert tidspunkt for hver prøve.

Der er flere tekniske og konceptuelle begrænsninger for DLC- og DLE-analyserne i deres nuværende form. For det første er den psoralen-medierede inter-strengs tværbindingstæthed ~ 1 ud af 500 bp8. Derfor kan et øget DLC-signal enten indikere, at der er flere D-loops i befolkningen, at den gennemsnitlige længde af D-loops i befolkningen er steget (forudsat at D-loops kan være mindre end 500 bp) eller begge dele. Desuden falder sandsynligheden for, at en D-loop vil blive fanget af DLC-assayet, med faldende D-loop-længde. I betragtning af at meget korte D-sløjfer kan tegne sig for en betydelig brøkdel af den samlede D-loop-population i visse mutante baggrunde, skal denne begrænsning af analysen overvejes ved fortolkning af resultaterne. For det andet kræver DLC-analysen DNA-tværbinding, mens DLE-analysen ikke gør det. Tidligere betød det for et givent eksperiment, at DLC- og DLE-prøver skulle indsamles og analyseres separat. Metoden vist i figur 5 opnår robust tværbindingsvending, hvilket letter behovet for at indsamle flere prøver fra samme kultur. Indførelsen af et andet EcoRI-restriktionsenzymsted på den ødelagte streng, nedstrøms for HindIII-genkendelsesstedet, vil muliggøre sekventiel DLC- og DLE-analyse.

Ud over disse tekniske begrænsninger tillader DLC- og DLE-analysesystemet i øjeblikket ikke genvinding af levedygtige HR-produkter, fordi højre side af den inducerbare DSB mangler homologi til donoren. For bedre at forstå kinetikken og mekanismen for anden endes engagement og syntese kan systemet ændres, således at reparation ved hjælp af en proximal eller distal homologiregion, der deles mellem den anden ende af pausen og donoren, er mulig (figur 6). Fremadrettet kan det vise sig at være indsigtsfuldt at kombinere DLC- og DLE-assays med andre teknologier, såsom ChIP-qPCR, high-throughput kromosomkonformationsoptagelse (Hi-C) og in vivo D-loop-kortlægning for at opnå en omfattende analyse af kinetikken og reguleringen af trinene i HR-vejen, herunder bruddannelse, enderesektion, Rad51-filamentdannelse, spirende D-loop-dannelse, D-loop-udvidelse, D-loop-vending, andet endeengagement, anden endesyntese og opløsning28.

Sammenfattende tillader DLC- og DLE-assays kvantificering af spirende og udvidede D-loops, D-loop-udvidelse og BIR-produktdannelse ved hjælp af princippet om nærhedsligation. Disse assays repræsenterer store fremskridt på området, da de er de første til at tillade semikvantitativ måling af D-loop dannelse og udvidelse uafhængig af cellulær levedygtighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Arbejdet i Heyer-laboratoriet er støttet af tilskud GM58015 og GM137751 til W.-D.H. Forskning i Piazza-laboratoriet støttes af Det Europæiske Forskningsråd (ERC-StG 3D-loop, stor aftale 851006). D.R. er støttet af T32CA108459 og A.P. Giannini Foundation. Vi takker Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) for at dele sine DLC/DLE-analyseresultater og for yderligere at validere ændringerne i de analyser, der er beskrevet i denne protokol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup Sigma-Aldrich L1375 For media preparation
Agar Fisher BP1423500 For media preparation
Bacto peptone BD Difco 211840 For media preparation
Bacto yeast extract BD Difco 212750 For media preparation
D-(+)-glucose BD Difco 0155-17-4 For media preparation
Trioxsalen Sigma-Aldrich T6137 For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T US Biological Z1004 For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF New England Biolabs R3101 Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF New England Biolabs R3104 Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 Sigma-Aldrich P2069 DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480 Roche 5015278001 qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white Roche 4729692001 96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix BioRad 1725271 qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001 qPCR kit used by the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
  4. Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
  5. Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
  6. Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
  7. Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
  8. Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
  9. Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
  10. Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
  11. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
  12. Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
  13. Wright, W. D., Heyer, W. -D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
  14. Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
  15. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
  16. Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
  17. Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
  18. Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
  19. Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
  20. Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
  21. Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
  22. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  23. Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
  24. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
  25. Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
  26. Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
  27. Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
  28. Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).

Tags

Genetik udgave 187 D-loop genomstabilitet ledmolekyle Rad51 break-induceret replikation
Påvisning af homologe rekombinationsmellemprodukter <em>via</em> nærhedsligering og kvantitativ PCR i <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A.,… More

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A., Heyer, W. D. Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (187), e64240, doi:10.3791/64240 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter