Summary
D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.
Abstract
세포주기의 S 및 G2 단계에서 발생하는 DNA 이중 가닥 절단 및 가닥 간 교차 결합을 포함한 DNA 손상은 상동 재조합 (HR)에 의해 복구 될 수 있습니다. 또한 HR은 정지 또는 붕괴 후 복제 포크 구조의 중요한 메커니즘을 나타냅니다. 이 복잡한 경로의 많은 가역적 및 비가역적 단계의 조절은 충실도를 촉진합니다. HR 중에 형성된 재조합 중간체의 물리적 분석은 다양한 핵 단백질 인자 및 그 상호 작용자에 의한 이러한 제어의 특성화를 가능하게합니다. 재조합 경로에서 특정 사건과 중간체를 분석하는 잘 확립된 방법이 있지만, 이 경로의 두 가지 중요한 단계인 D-루프 형성 및 확장의 검출은 최근까지 어려운 것으로 판명되었습니다. 여기에서는 HR 경로에서 주요 사건, 즉 DNA 이중 가닥 절단 형성, D-루프 형성, D-루프 확장 및 사카로마이세스 세레비시아에서 절단 유도 복제(BIR)를 통한 생성물 형성을 검출하는 효율적인 방법을 설명합니다. 이러한 분석은 관련 재조합 중간체 및 고감도의 생성물을 검출하며 세포 생존력과 무관합니다. D-루프, D-루프 확장 및 BIR 제품의 검출은 근접 결찰을 기반으로 합니다. 함께, 이러한 분석은 인구 수준에서 HR의 동역학을 연구하여 경로의 중요한 단계에서 HR 단백질 및 조절자의 기능을 미세하게 다룰 수 있습니다.
Introduction
상동 재조합(HR)은 DNA 이중 가닥 절단(DSB), 가닥 간 교차 링크 및 ssDNA 갭의 복구에 대한 고충실도 메커니즘이자 DNA 손상 내성 경로입니다. HR은 손상되지 않은 상동 말단 접합(NHEJ) 및 전이 합성과 같은 DNA 손상 복구/내성에 대한 오류가 발생하기 쉬운 경로와 다르며, 손상되지 않은 상동 이중 DNA를 기증자로 사용하여 복구 이벤트를 주형화합니다. 또한 HR 경로의 많은 주요 중간체는 가역적이므로 개별 경로 단계를 정교하게 조절할 수 있습니다. 세포 주기의 S, G2 및 M 단계 동안 HR은 2단DSB1의 수리를 위해 NHEJ와 경쟁합니다. 또한, HR은 ssDNA 갭 및 일방적 DSB를 포함한 복제 관련 DNA 손상의 복구를 위한 DNA 복제에 필수적이며, DNA병변 우회의 메커니즘으로서 2.
HR 경로의 중요한 중간은 변위 루프 또는 D 루프입니다(그림 1). 말단 절제술 후, 반응의 중심 재조합 효소 인 Rad51은 부서진 분자의 새로 절제 된 ssDNA에로드되어 나선형 필라멘트2를 형성합니다. 그런 다음 Rad51은 적절한 상동 공여체, 일반적으로 체세포에서 자매 염색분체를 확인하기 위해 상동성 검색을 수행합니다. D- 루프는 Rad51-ssDNA 필라멘트가 상동 이중 DNA를 침범 할 때 형성되며, 이는 부러진 가닥과 기증자의 상보적인 가닥의 Watson-Crick 염기 쌍으로 이어져 반대쪽 기증자 가닥을 대체합니다. DNA 중합효소에 의한 파손된 가닥의 3' 말단의 확장은 DNA 손상 이벤트 동안 손실된 염기를 대체하고 합성 의존성 가닥 어닐링(SDSA), 이중 할러데이 접합(dHJ) 또는 파손 유도 복제(BIR) HR 하위 경로를 통해 확장된 D-루프 중간체의 dsDNA 생성물로의 분해를 촉진합니다.
HR 경로에서 중간체를 물리적으로 모니터링하는 분석은 각 단계에 대한 유전 적 요구 사항의 분석 (즉, 경로 분석)을 허용합니다. DSB 형성, 말단 절제술, dHJ, BIR 복제 버블 및 HR 생성물은 서던 블로팅 3,4,5,6,7에 의해 쉽게 관찰된다. 그러나 서던 블로팅은 초기 및 확장 D-루프에 대해 보고하지 못하므로 이러한 관절 분자를 안정적으로 측정하기 위한 대체방법이 필요합니다4,8,9. 초기 D-루프 형성을 분석하기 위해 널리 사용되는 전략 중 하나는 정량적 PCR(qPCR)10,11과 결합된 Rad51의 염색질 면역침전(ChIP)입니다. 그러나, ChIP-qPCR에 의해 측정된 dsDNA와의 Rad51 연관성은 서열 상동성 및 Rad51 부속 인자Rad54 10,11과 무관하다. 대조적으로, D-루프 캡처(DLC) 분석이라고 하는 여기에 제시된 D-루프 분석 방법을 사용하는 상당한 신호는 DSB 형성, 서열 상동성, Rad51 및 Rad51 부속 단백질 Rad52 및 Rad548에 따라 달라집니다. 사카로마이세스 세레비시아에 Rad51-촉진된 D-루프 형성이 생체내 Rad54에 의존한다는 발견은 Rad54가 출아 효모 Rad51에 의한 상동성 검색 및 D-루프 형성에 필요하다는 것을 나타내는 수많은 시험관내 재구성 실험 8,12,13,14,15와 일치한다.
주로 반정량적 PCR을 통해 D-루프 확장을 측정하는 현재의 접근 방식도 마찬가지로 문제가 있습니다. D-루프 확장을 검출하기 위한 전형적인 PCR 기반 분석은 끊어진 가닥에 대한 상동성 영역의 상류에 있는 프라이머와 공여자 가닥에 대한 상동성 영역의 또 다른 프라이머 하류를 통해 절단 부위와 이소성 공여체 사이의 재조합 및 후속 재조합 관련 DNA 합성으로 인한 고유한 서열을 증폭합니다. 이 방법을 사용하여, 재조합 관련 DNA 합성의 검출은 필수적이지 않은 Pol δ 공정성 인자 Pol3216을 필요로 한다. 이 발견은 POL32 결실이 생체 내유전자 전환에 경미한 효과 만 갖는다는 관찰과 충돌합니다. 더욱이, 이러한 PCR 기반 분석은 D- 루프 확장 및 BIR 생성물 형성을 일시적으로 해결하지 못하며, 이는 신호가 ssDNA 중간체17,18,19가 아닌 dsDNA 산물에서 발생한다는 것을 시사한다. D-루프 확장(DLE) 분석은 이러한 불일치를 해결하기 위해 최근에 개발되었습니다. DLE 분석은 초기 3' 침범 말단9의 하류에 ~400 염기쌍(bp) 부위에서 재조합 관련 DNA 합성을 정량화합니다. 이 방법에 의해, D-루프 확장은 Pol32와 독립적이며 DSB 유도 후 4시간 이내에 검출될 수 있는 반면, BIR 생성물은 6h에서 처음 관찰된다. 실제로 Haber 및 Malkova 실험실의 최근 간행물에 따르면 이 게놈 DNA 준비 방법을 사용하면 ssDNA 보존 9,20이 발생합니다.
여기서, DLC 및 DLE 분석이 상세히 설명된다. 이러한 분석은 근접 결찰에 의존하여 S. cerevisiae에서 초기 및 확장 D- 루프를 감지합니다 (그림 2)8,9. BIR 제품은 이와 동일한 분석 시스템을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 두 검정 모두에서, 염색체 상의 URA3 유전자좌 (Chr.) V에 위치한 HO 엔도뉴클레아제 절단 부위에서의 DSB 형성은 갈락토스-유도성 프로모터의 조절하에 HO 엔도뉴클레아제의 발현에 의해 유도된다. Rad51 매개 DNA 가닥 침습은 Chr. II의 LYS2 유전자좌에 위치한 이소성 기증자 부위에서 초기 D- 루프 형성을 유도합니다. DSB의 오른쪽은 기증자와의 상동성이 부족하기 때문에 SDSA 및 dHJ 형성을 통한 복구가 불가능합니다. BIR에 의한 DSB의 초기 수리는 가능하지만, 생존 가능한 생성물의 형성은 중심체(21)의 존재에 의해 억제된다. 이러한 의도적인 설계는 생산적인 DSB 복구를 방지하여 시간 경과 분석 중에 배양을 추월할 수 있는 복구된 DBS가 있는 세포에 의한 성장 재개를 방지합니다.
DLC 분석에서, D- 루프 내의 헤테로 듀플렉스 DNA의 두 가닥의 소 랄렌 가교는 재조합 중간체를 보존한다. 파손된(절제된) 가닥 및 소화에 대한 제한 효소 부위 복원 후, 가교결합은 상동 파괴 및 공여자 DNA의 상류에서 고유한 서열의 결찰을 허용합니다. qPCR을 사용하여 각 샘플에 존재하는 키메라 DNA 분자의 수준을 정량화합니다. DLE 분석에서, 가교결합은 필요하지 않으며, 제한 효소 부위 복원 및 소화에 이어 분자내 결찰은 대신 부서진 분자의 5' 말단을 새로 확장된 3' 말단에 연결시킨다. 다시 말하지만, qPCR은 각 샘플에서 이 키메라 산물의 상대적인 양을 정량화하는 데 사용됩니다. 제한 효소 부위 복원이 없는 경우, DLE 분석은 D-루프 확장 후 형성되는 BIR(dsDNA) 생성물의 상대적 수준에 대해 보고합니다.
야생형 균주를 사용한 각각의 분석에 대한 대표적인 결과가 도시되어 있으며, 독자는 재조합 돌연변이체 8,9의 분석을 위한 이들 분석의 사용에 대해 Piazza et al.8 및 Piazza et al.9에 참조된다. 이 기여의 목적은 다른 실험실에서 DLC 및 DLE 분석을 채택할 수 있도록 하는 것이며 요청 시 지원이 제공됩니다.
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Protocol
1. 사전 성장, DSB 유도 및 샘플 수집
참고: Ade- 균주의 경우 모든 배지에 0.01% 아데닌을 보충하는 것이 좋습니다.
- 효모 펩톤 덱스트로스 아데닌(YPDA)(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당, 2% 한천, 0.001% 아데닌)에 적절한 반수체 균주( 표 1 참조)를 제거하고 30°C에서 2일 동안 성장시킵니다.
- 단일 콜로니를 사용하여 15mL 유리 배양 튜브에 5mL의 YPDA를 접종합니다. 폭기를 위해 흔들거나 회전하여 30°C에서 포화 상태로 배양물을 성장시킵니다.
- DLC 분석: 알루미늄 호일로 싸인 50mL 원추형 튜브에 소랄렌을 용해시켜 흄 후드에서 5x 소랄렌 원액 용액(200프루프 에탄올 중 0.5mg/mL 트리옥살렌)을 연속 흔들거나 반전시키면서 실온에서 밤새 준비합니다. 증발을 방지하기 위해 투명 필름으로 나사 상단을 밀봉하십시오. 소랄렌의 적절한 용해를 보장하기 위해 7mL 원추형 튜브당 50x 소랄렌 원액을 준비하지 마십시오.
- 다음날, 5mL의 YPDA에서 하룻밤 배양물을 사용하여 적절한 크기의 플라스크에 50-100mL의 YEP-젖산염(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% w/w 젖산염, 0.001% 아데닌)을 접종합니다(신진 효모는 배양 부피의 최소 5배인 플라스크에서 최적으로 자랍니다) ~0.03의 OD600 으로.
- 220rpm에서 진탕하면서 30°C에서 ~16시간 동안 배양물을 성장시킵니다. ~16시간 후 배양물의 OD600 을 측정하고 ~0.5-0.8이어야 합니다. 덜 자란 문화나 자란 문화를 사용하지 마십시오.
- 각 시점마다 원추형 튜브에 적절한 양의 세포를 모으고 얼음 위에 놓습니다. 전형적으로, 이는 DLC 분석을 위한 1 x 108 세포 (반수체 야생형 균주의 경우 OD 600 1.0에서 배양물의 대략 7.5 mL)이고, DLE 분석을 위한 5 x 107 세포 (OD600 1.0에서의 배양물의 대략 2.5 mL)이다.
- OD600 값의 정확성을 보장하기 위해 OD 판독값이 0.2 이하로 유지되도록 OD600≥0.2가 있는 배양에 대해 1:5 희석을 준비합니다. 야생형 균주의 경우 DLC 분석을 위한 최적의 시점은 2시간에서 6시간 사이이고 DLE 분석을 위한 최적의 시점은 4시간에서 8시간 사이입니다(그림 3 및 그림 4 참조).
- DLC 분석
- 각 시점 전에 호일로 싸인 50mL 원뿔형 튜브의 모든 샘플에 대해 흄 후드에 충분한 1x 소랄렌 용액(0.1mg/mL 트리옥살렌, 50mM Tris-HCl pH 8.0, 50mM EDTA pH 8.0, 20% 에탄올)을 준비합니다. RT에서 출발하십시오.
- 샘플을 2,500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 흄 후드의 1x 소랄렌 용액 2.5mL에 재현탁하고 60mm x 15mm 페트리 접시에 옮깁니다. 대안적으로, 가교결합이 없는 제어를 위해 2.5mL의 TE1 용액(50mM Tris-HCl pH 8.0, 50mM EDTA pH 8.0)에 펠릿을 재현탁시킨다.
- 샘플을 교차 연결합니다. 장파(365nm) 전구에 맞는 UV 가교제의 경우 -20°C에서 사전 냉각된 플라스틱 또는 플렉시 유리 판 위에 뚜껑을 제거한 상태에서 UV 광원 아래 1-2cm 페트리 접시를 놓습니다. UV 라이트 박스의 경우 페트리 접시를 UV 광원 바로 위에 놓습니다. 부드럽게 흔들어 샘플을 10분 동안 노출시킵니다.
알림: ~50rpm으로 설정된 궤도 셰이커 위에 UV 광원을 설정하는 것이 좋습니다. - 흄 후드에서 샘플을 새 15mL 튜브로 옮깁니다. 페트리 접시를 2.5mL의 TE1 용액으로 헹구고 이것을 튜브에 첨가하십시오. 샘플을 2,500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 적절하게 폐기하고, 펠릿을 -20°C에서 보관한다. 샘플은 다음 단계로 이동하기 전에 최대 1주일 동안 보관할 수 있다.
- DLE 분석
- 샘플을 2,500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 스핀을 반복하고 펠릿을 -20 ° C에서 보관하기 전에 2.5mL의 차가운 TE1 용액에서 세포 펠릿을 세척하십시오. 샘플은 다음 단계로 이동하기 전에 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
- 0 h에서 샘플 수집을 위해, 20% 갈락토오스를 첨가하기 전에 샘플을 수집한다. 후속 시점의 경우 20%의 갈락토오스를 배양물에 첨가하여 최종 농도 2%로 DSB 형성을 유도합니다. 전술한 바와 같이 나머지 샘플을 수집하고, 펠렛을 DSB 유도 후 시간을 기준으로 동결시킨다(즉, 4시간 샘플은 20% 갈락토스를 첨가한 후 4시간 수집된다).
2. 세포 구로 성형, 용해 및 제한 부위 복원
- 얼음에서 샘플을 해동하십시오. 건조 수조를 30°C로 예열합니다.
- 샘플을 1mL의 스페로플라스팅 완충액(0.4M 소르비톨, 0.4M KCl, 40mM 인산나트륨 완충액 pH 7.2, 0.5mMMgCl2)에 재현탁하고 1.5mL 미세원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 3.5 μL의 자이몰리아제 용액(2% 포도당, 50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 5 mg/mL 자이몰리아제 100T, 17.5 μg/mL 자이몰리아제 최종 농도)을 추가합니다. 두드리거나 뒤집어 부드럽게 섞습니다. 30°C에서 15분 동안 배양한 다음 얼음 위에 놓습니다. 15 분 배양 중에 액체 질소 또는 드라이 아이스를 얻습니다.
- 4°C에서 2,500 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 샘플을 1mL의 스페로플라스팅 완충액에서 3회 세척합니다. 샘플을 4°C에서 2,500 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 샘플을 차가운 1x 제한 효소 완충액 (50mM 칼륨 아세테이트, 20mM 트리스-아세테이트, 10mM 마그네슘 아세테이트, 100μg/mL BSA pH ~8.0 RT에서)에 재현탁하고 3°C에서 16,000x g 에서 4분 동안 원심분리합니다. 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 세척을 1 회 반복하십시오.
- 차가운 1x 제한 효소 버퍼 1mL에 샘플을 재현탁합니다. 시료(각각 0.5mL)를 두 개의 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 나눕니다. 샘플을 4°C에서 16,000 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 혼성화 올리고가 있는 1.4x 제한 효소 버퍼 180μL에 각 샘플의 튜브 하나를 재현탁하고( 표 2 참조) 하이브리디징 올리고가 없는 180μL의 1.4x 제한 효소 버퍼에 하나의 튜브를 재현탁합니다. 각각의 혼성화 올리고는 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0)에 재현탁시키고, 7 nM의 최종 농도로 사용한다. 1x TE는 혼성화 올리고 없이 1.4x 제한 효소 완충액에서 혼성화 올리고를 대체합니다.
참고: 혼성화 올리고는 작업 희석에서 작은 분취량으로 -20°C에서 보관해야 합니다. 혼성화 올리고의 농도는 최적화를 필요로 할 수 있고; 토론을 참조하십시오. - 샘플을 액체 질소 또는 드라이 아이스 / 에탄올에 스냅 동결하고 -80 ° C에서 보관하십시오. 샘플은이 단계에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
3. 제한 효소 소화 및 분자 내 결찰
- 얼음에서 샘플을 해동하십시오. 하나의 건조 수조를 65 ° C로, 다른 건조조를 37 ° C로 예열하십시오.
- 시료 36μL를 얼음 위의 새로운 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 넣습니다. 보관을 위해 나머지 샘플을 즉시 -80 ° C로 되돌립니다.
- 4 μL의 1% SDS(0.1% 최종 농도)를 추가하고 튜브 측면을 가볍게 두드려 혼합합니다. 65 ° C에서 15 분 동안 배양하고 5 분마다 부드럽게 두드리십시오. 배양 직후 얼음 위에 샘플을 놓습니다.
참고: 이 SDS 처리는 제한 효소 분해 및 분자 내 결찰 단계에 앞서 DNA 관련 단백질의 변성, 핵 외피의 가용화 및 염색질 접근성을 촉진합니다. - 4.5μL의 10% Triton X-100(1% 최종 농도)을 넣고 피펫팅으로 혼합합니다. 각 샘플에 20-50U의 제한 효소(EcoRI-HF 또는 HindIII-HF)를 추가하고 37-20분마다 부드러운 교반과 함께 30°C에서 1시간 동안 배양합니다. 이 시간 동안, 건조 수조를 55°C로 예열하고 수조를 16°C로 미리 설정한다.
- 각 샘플에 8.6μL의 10% SDS(1.5% 최종 농도)를 추가하고 피펫팅 및 태핑으로 혼합합니다. 55°C에서 10분 동안 배양합니다. 각 샘플에 10% Triton X-100(최종 농도 6%)을 80μL씩 넣고 피펫팅으로 혼합합니다.
- ATP (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2.5 μg / mL BSA) + 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNA 리가 아제 (8 U / 샘플)가없는 660 μL의 1x 결찰 완충액을 각 샘플에 추가하고 부드러운 반전으로 혼합합니다. 16 ° C에서 1.5 시간 동안 30 분마다 반전시킵니다. 배양 직후 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
4. DNA 정제
- 하나의 건조 수조를 65 ° C로, 다른 건조조를 37 ° C로 예열하십시오. 각 샘플(12.5μg/mL 최종 농도)에 10mg/mL 프로테이나제 K(1x TE pH 8.0에서 준비)를 1μL를 추가합니다. 65°C에서 30분 동안 배양하고 배양 직후 냉각될 때까지 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
- 샘플을 2mL 튜브로 옮깁니다. 흄 후드에서 작업하면서 각 샘플에 동일한 부피(~800μL)의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(P/C/IA, pH 8.0)을 추가합니다. 샘플을 ~ 30 초 동안 와류시키고 미세 원심 분리기에서 5 x g에서 10-16,000 분 동안 샘플을 원심 분리합니다.
- 각 샘플의 상부 단계 600μL를 새 1.5mL 튜브로 조심스럽게 제거합니다. 하부 상과 2mL 튜브를 적절하게 폐기하십시오.
- 각 샘플에 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 pH 5.2(~60μL)를 추가한 다음 1부피의 이소프로판올(~660μL)을 추가하여 DNA를 침전시킵니다. 샘플을 5x-10x 뒤집고 RT에서 30 분 동안 배양합니다.
- 샘플을 얼음 위에 2분 동안 놓은 다음, 샘플을 미세 원심분리기에서 4°C에서 15분 동안 16,500 x g 로 원심분리합니다. 샘플을 얼음으로 되돌리고 상청액을 붓고 종이 타월로 튜브를 배출하십시오.
- DNA 펠릿을 200 μL의 70% 에탄올로 세척한다. 4°C에서 3분 동안 16,500 x g 로 원심분리하고 샘플을 얼음 위에 다시 놓고 상청액을 붓고 피펫으로 잔류 알코올을 제거합니다. 튜브의 캡을 열어 37 ° C에서 15-20 분 동안 샘플을 건조시킵니다.
- 볼텍싱을 통해 DNA 펠릿을 50μL의 1x TE에 재현탁시킵니다. RT에서 30분 동안 와류하고, 이어서 37°C에서 건조 수조에서 30분 동안 인큐베이션한다. 샘플을 다시 소용돌이 한 다음 얼음 위에 놓습니다. 샘플은 이 단계에서 -20°C에서 수개월 동안 보관할 수 있지만 가교(DLC만 해당) 및 qPCR 단계를 위해 즉시 진행하는 것이 좋습니다.
5. 소랄렌 가교 반전(DLC 분석에만 해당)
- 정제된 DNA 9μL를 얼음 위의 PCR 튜브에 피펫팅합니다. 1 M KOH (0.1 M 최종 농도)의 1 μL를 첨가한다. 샘플을 열순환기에서 30분 동안 90°C에서 배양합니다.
- 19.73 μL의 아세트산나트륨 용액(0.1 M 아세트산나트륨, 9.6 mM 트리스-HCl pH 8.0, 1.0 mM EDTA pH 8.0)을 첨가한다. 샘플은 이 단계에서 -20°C에서 수개월 동안 보관할 수 있지만 즉시 qPCR 단계로 진행하는 것이 좋습니다.
6. 정량적 PCR, 대조군 및 분석
- 가교 결합 유무에 관계없이 2μL의 정제된 DNA를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 20μL qPCR 반응을 설정합니다. 각 반응을 개별적으로 설정합니다. DLC 및 DLE 분석 모두에 대해 5개의 제어 반응과 1개의 DLC/DLE 정량 반응 또는 샘플당 총 6개의 반응이 중복으로 실행됩니다. 보충 표 S1 및 보충 표 S2 는 이러한 반응 및 분석을 설정하기 위한 주형을 제공하며, qPCR 프라이머의 서열은 표 3에 열거되어 있다.
- qPCR 사이클링 조건은 각 qPCR 키트에 대해 최적화되어야 합니다.
- 사용된 qPCR 키트에 따라 다음 DLC qPCR 조건을 사용하십시오: 초기 변성(3분 동안 95°C); 50 라운드의 증폭 (단일 획득으로 15 초 동안 95 ° C, 25 초 동안 61 ° C, 15 초 동안 72 ° C); 용융 곡선 분석 (5 초 동안 95 ° C, 1 분 동안 65 ° C, 연속 획득시 97 ° C); 및 냉각 (30 초 동안 37 ° C).
- DLE 분석에 대해 다음의 qPCR 조건을 사용하십시오: 초기 변성 (5분 동안 95°C); 50 라운드의 증폭 (단일 획득으로 15 초 동안 95 ° C, 30 초 동안 60 ° C, 15 초 동안 72 ° C); 용융 곡선 분석 (5 초 동안 95 ° C, 1 분 동안 65 ° C, 연속 획득시 97 ° C); 및 냉각 (30 초 동안 37 ° C). 다른 qPCR 기계/키트에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.
- DLC 분석
- 대조군: 표 3의 qPCR 프라이머 목록을 참조하십시오. 프라이머 결합 부위의 맵이 도 S1에 도시되어 있다. 관련 게놈 특징 및 앰플리콘에 대한 보충 서열 파일은 A 플라스미드 편집기(ApE) 파일을 확인하십시오. 보충 시퀀스 파일 1-5.
- ARG4의 게놈 DNA: olWDH1760/olWDH1761을 사용하여 ARG4에 있는 dsDNA를 증폭합니다. 이 반응을 부하 제어로 사용하고 이 제어에 대한 DLC 신호 반응을 제외한 다른 모든 반응을 정규화합니다.
- DAP2에서의 분자 내 결찰 효율: DLC 결찰과 병행하여 분자 내 결찰을 위해 EcoRI 분해에 의해 생성된 1,904bp 단편을 사용합니다. 이 결찰 접합부를 통한 증폭은 분자 내 결찰 효율에 대해 보고하고 DLC 신호가 정규화되는 제어 역할을 합니다.
- DSB 유도: olWDH1766/olWDH1767을 사용하여 유도된 DSB에 걸쳐 있는 영역을 증폭합니다.
- 소랄렌 가교 및 절제술: olWDH2019/olWDH2020을 사용하여 EcoRI 인식 부위의 다운스트림에서 고유한 PhiX 영역을 증폭합니다. 가교링크 반전 없이, ARG4 (가교결합된 dsDNA)에 대한 ssDNA(가교결합 없음)의 비율을 사용하여 가교 효율을 결정한다. 가교 링크 반전을 사용하면 절제술은 ARG4에 대한 신호의 1에서 0.5로 점진적으로 감소합니다.
- 에코 R I 인식 부위 복원 및 절단: olWDH1768/olWDH1764를 사용하여 절제된 가닥에서 DSB 상류의 복원된 EcoRI 인식 부위에 걸쳐 있는 영역을 증폭합니다. olWDH1769/olWDH1763은 DAP2의 EcoRI 제한 효소 부위에 걸쳐 있는 영역을 증폭합니다. 이 부위에서 EcoRI 절단을 수행하여 분자 내 결찰 제어로 사용합니다.
- DLC 신호: olWDH1764/olWDH1765를 사용하여 절제된(침습) 가닥과 기증자의 분자 내 결찰에 의해 생성된 키메라 DNA 분자를 증폭합니다.
- 분석: 각 중복 반응에 대한 Cp 값의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. ARG4 게놈 DNA qPCR Cp 값을 참조로 사용하여 다른 모든 대조군 qPCR을 정규화합니다. DLC 신호를 DAP2의 분자 내 결찰 제어로 정규화합니다. 2h에서의 일반적인 DLC 신호 값은 그림 3 을 참조하십시오.
- 대조군: 표 3의 qPCR 프라이머 목록을 참조하십시오. 프라이머 결합 부위의 맵이 도 S1에 도시되어 있다. 관련 게놈 특징 및 앰플리콘에 대한 보충 서열 파일은 A 플라스미드 편집기(ApE) 파일을 확인하십시오. 보충 시퀀스 파일 1-5.
- DLE 분석
- 대조군: 표 3의 qPCR 프라이머 목록을 참조하십시오. 프라이머 결합 부위의 맵이 도 S1에 도시되어 있다. 관련 게놈 특징 및 앰플리콘에 대한 보충 서열 파일은 플라스미드 편집기(ApE) 파일(보충 서열 파일 1-5)을 확인하십시오.
- ARG4의 게놈 DNA : 섹션 6.3.1.1을 참조하십시오.
- YLR050C에서의 분자 내 결찰 효율 : HindIII 분해를 사용하여 DLE 결찰과 병행하여 분자 내 결찰을 겪을 765 bp 단편을 만듭니다. 이 결찰 접합부를 통한 증폭은 분자 내 결찰 효율을 보고하고 DLE 신호가 정규화되는 제어 역할을 합니다.
- DSB 유도: 섹션 6.3.1.3을 참조하십시오.
- 뒷 III 인식 부위 복원 및 절단: olWDH2010/olWDH2012 및 olWDH2009/2011을 사용하여 각각 절제 및 확장된 끊어진 가닥의 HindIII 제한 효소 부위에 걸쳐 있는 영역을 증폭합니다.
- DLE 신호: olWDH2009/olWDH2010을 사용하여 DSB 상류의 침입 가닥의 절제된 말단을 DSB의 새로 확장된 하류로 분자 내 결찰하여 생성된 키메라 DNA 분자를 증폭합니다.
- 분석: 각 중복 반응에 대한 Cp 값의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. ARG4 게놈 DNA qPCR Cp 값을 참조로 사용하여 다른 모든 대조군 qPCR을 정규화합니다. DLE 신호를 YLR050C에서 분자내 결찰 대조군으로 정규화합니다. 6h에서의 전형적인 DLE 신호 값은 도 4 및 이전 간행물9에 보고되어 있다.
- 대조군: 표 3의 qPCR 프라이머 목록을 참조하십시오. 프라이머 결합 부위의 맵이 도 S1에 도시되어 있다. 관련 게놈 특징 및 앰플리콘에 대한 보충 서열 파일은 플라스미드 편집기(ApE) 파일(보충 서열 파일 1-5)을 확인하십시오.
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Representative Results
DLC 분석
DLC 분석은 부위별 DSB가 단일 기증자로 침입하여 형성된 초기 및 확장 D-루프를 모두 감지합니다(그림 2). 소랄렌 가교결합은 D-루프 내의 헤테로듀플렉스 DNA를 통해 끊어진 가닥과 기증자를 물리적으로 연결합니다. 절단된 절단 가닥에 긴 혼성화 올리고를 사용한 제한 효소 부위 복원은 제한 효소 절단을 허용한 다음, 파손된 가닥을 근위 공여체로 연결하여 qPCR로 정량화되는 키메라 생성물을 형성합니다. 특히, DLC 신호는 소랄렌 가교결합, 하이브리드화 올리고, 중심 재조합 효소, Rad51 및 Rad51 부속 인자 Rad52 및 Rad548에 의존한다. DNA 헬리카제/토포이소머라제 Sgs1-Top3-Rmi1, Mph1 및 Srs2의 결실은 DLC 신호를 증가시킵니다.
도 3 은 올리고하이브리드화 포함 및 미포함 삼중으로 DSB 유도 후 2h에서 표준 야생형 균주에 대한 대표적인 결과를 나타낸다. 핵심 단계인 소랄렌 가교결합이 결여된 샘플도 중복으로 표시됩니다.
도 3에 도시된 바와 같이, 소랄렌 가교결합은 중요한 단계이다. 그것 없이는 감지 가능한 신호가 거의 없습니다8. 가교 효율은 dsDNA 증폭에 대한 ssDNA의 비율에 기초하여 측정된다. dsDNA와 달리 ssDNA는 최소한의 소랄렌 가교결합을 경험하므로 높은 신호는 성공적인 가교결합을 나타냅니다. 가교 효율은 샘플 수집과 qPCR 준비 사이의 시간에 따라 다릅니다(그림 3, 왼쪽 하단 패널). 샘플 수집과 준비 사이의 시간이 길수록 qPCR 제어에 대한 가교 효율 신호가 더 적게 관찰됩니다. 가교 효율 qPCR 대조군에 대해 관찰된 신호의 유의한 샘플 간 변동은 우려의 원인이며, 시간 경과는 폐기되어야 한다.
ARG4 Cp 값은 혼성화가 있는 올리고 샘플과 없는 올리고 샘플 간에 유사합니다(그림 3, 왼쪽 상단 패널). 낮은 Cp 값은 더 증폭 가능한 DNA가 존재한다는 것을 나타냅니다. 이것은 가교결합이 없는 샘플에 대한 ARG4 Cp 값이 유의하게 더 낮은 이유를 설명합니다: 가교결합은 qPCR 증폭을 방해합니다. 가교가 있는 샘플과 없는 샘플 간의 이러한 차이는 ssDNA/비가교결합된 dsDNA를 증폭하는 EcoRI 절단 qPCR 대조군을 제외한 모든 qPCR에 적용됩니다. DLC 신호가 아닌 모든 qPCR 컨트롤은 ARG4 qPCR 신호로 정규화됩니다.
모든 샘플에 대해 분자 내 결찰 qPCR 대조군은 적절한 범위 내에 있으며(그림 3, 상단 중간 패널), HO 엔도뉴클레아제 인식 부위를 가로질러 증폭되는 qPCR 대조군에 대한 낮은 신호에서 알 수 있듯이 강력한 DSB 유도가 있습니다(그림 3, 오른쪽 상단 패널). 하이브리드화 올리고 샘플에서 효율적인 EcoRI 절단이 관찰되며 이 qPCR 제어는 낮은 신호를 제공합니다(그림 3, 하단 중간 패널). 반대로, 혼성화 없는 올리고와 가교결합 샘플은 가교 효율 qPCR 대조군에 대해 보여지는 것과 유사한 높은 신호를 주는데, 이는 이 경우, 절단되지 않은 ssDNA가 ARG4 qPCR 신호(dsDNA)로 증폭되고 정규화되기 때문이다.
다른 qPCR과 달리, DLC qPCR에 의해 정량화된 키메라 분자는 결찰에 의존하기 때문에 DLC 분석에 대한 qPCR 신호는 분자내 결찰 qPCR 대조군으로 정규화됩니다. 하이브리드화 올리고를 사용한 2시간의 DLC 신호 중앙값은 0.030 ± 0.0055(그림 3, 오른쪽 하단 패널)이며, 이는 이 분석법8에 대해 이전에 발표된 결과와 일치합니다. 예상된 바와 같이, 이 신호는 혼성화 올리고 및 소랄렌 가교결합 둘 다에 의존한다.
DLE 분석
DLE 분석을 사용하면 사이트별 DSB에 대한 응답으로 D 루프 확장을 정확하게 모니터링할 수 있습니다(그림 2). DLE 신호는 가닥 침습을 매개하는 반응의 중심 재조합 효소 인 Rad51에 의존하므로 재조합 관련 DNA 합성에 필요하다는 것이 이전에 입증되었습니다9. 또한, DLE 신호는 Pol δ, Pol3(DR, AP, WDH, 미공개 데이터)의 촉매 서브유닛에 의존하지만 비필수 공정성 인자 Pol32에 의존하지 않는다. DSB 유도 후 2 시간에 처음으로 검출 가능하게되는 DLC 신호와는 대조적으로, DLE 신호는 DSB 유도 후 4 시간에 처음으로 눈에 띄게 증가하고, 4 h와 6 h 사이에서 극적으로 상승하고, 그 후 정체되기 시작하며, 6 h와 8 h 사이의 신호 증가의 대부분은 BIR 생성물 형성에 기인합니다8, 9.
DLE 분석에서 정량화된 키메라 결찰 산물은 단일 가닥이므로 세포 스페로플라스팅 및 용해 단계가 중요합니다. DLE 신호 감소는 뉴클레아제를 방출하고 표적 ssDNA의 분해로 이어질 수 있는 이 단계의 문제로 인해 발생할 수 있습니다.
도 4 는 하이브리드화 올리고를 포함하거나 포함하지 않은 삼중으로 DSB 유도 후 6시간에서 표준 야생형 균주에 대한 대표적인 결과를 나타낸다. 하이브리드화 올리고가 없는 야생형 샘플은 dsDNA BIR 생성물 단독을 나타내는 반면, 올리고 포함 신호는 확장된 D-루프의 ssDNA와 dsDNA BIR 산물 둘 다로부터 유도된다. 세 번째 샘플은 실패한 실험의 예로 포함됩니다.
ARG4 Cp 값은 혼성화 올리고가 있는 샘플과 없는 샘플 간에 유사했습니다(그림 4, 왼쪽 상단 패널). ARG4 실패한 샘플에 대해 Cp 값이 눈에 띄게 낮았으며, 이는 이 샘플이 성공적인 샘플보다 더 많은 게놈 DNA를 가지고 있음을 나타냅니다. DLE 신호가 아닌 qPCR 대조군에 대한 qPCR 신호는 ARG4 qPCR 신호로 정규화되었다. 분자 내 결찰 qPCR 대조군은 혼성화 올리고가 있거나 없는 샘플(~0.15-0.35 사이)에 대해 허용 가능한 신호를 나타내었지만 실패한 샘플에 대해서는 상당히 낮은 신호를 나타냈습니다(그림 4, 상단 중간 패널). 이 실패한 샘플에서 ARG4 qPCR 대조군에 의해 표시된 다량의 게놈 DNA는 고농도의 게놈 DNA가 분자간 결찰로 이어지기 때문에 분자 내 결찰이 실패했을 가능성이 있습니다.
세 샘플 모두에서 강력한 DSB 유도가 있었습니다(그림 4, 오른쪽 상단 패널). 뒷 절제된 가닥과 확장된 가닥 모두의 III 절단은 혼성화 올리고의 존재에 의존한다. 확장 된 가닥에서는 D- 루프 확장에 추가로 의존합니다. 따라서, 올리고가 있는 샘플과 없는 샘플 사이의 절제된 가닥의 Hind III 절단 부위를 가로지르는 증폭에 상당한 차이가 있었고(그림 4, 왼쪽 하단 패널) 이러한 샘플 사이의 확장된 가닥에서 HindIII 인식 부위를 가로지르는 증폭의 차이가 더 작았습니다(그림 4, 하단-중간 패널).
DLE 신호는 분자내 결찰에 의존하기 때문에 분자내 결찰 qPCR 대조군으로 정규화됩니다. 혼성화 올리고를 사용한 6시간에서의 DLE 신호 중앙값은 0.53 ± 0.17이었으며(그림 4, 오른쪽 하단 패널), 이 분석법9에 대해 이전에 발표된 결과와 일치합니다. 혼성화 올리고가 없는 야생형 샘플에 대한 DLE 신호는 이러한 선행 공보와 유사하게 상용성이었다. DLE 신호는 실패한 샘플에 대해 예상보다 낮았으며 위에서 언급한 샘플의 문제를 반영한 것 같습니다.
크로스링크 반전
dsDNA에서 ApT/TpA 염기쌍 사이에 삽입된 소랄렌은 UV 조사 시 푸란 및 파이론 고리를 통해 하나 또는 둘 다의 반대되는 티민 염기에 공유 결합되어 (주로 푸란) 모노-부가물 또는 가닥 간 디-부가물(즉, 가교결합)을 각각 생성할 수 있습니다(즉, 가교결합).22. 이러한 변형은 DNA 중합효소의 진행을 차단하여 정량적 PCR에 필수적인 DNA 합성 반응을 억제할 것으로 예상됩니다. 따라서 대부분의 dsDNA 템플릿은 증폭할 수 없습니다(그림 5A,B). 대조적으로, ssDNA에 염기쌍이 없기 때문에 소랄렌 가교결합이 덜 발생합니다. 따라서 dsDNA보다 더 쉽게 증폭되어 ssDNA 대 dsDNA 및 길이와 ApT/TpA 함량이 다른 dsDNA 앰플리콘의 상대적 정량화를 왜곡합니다(그림 5A,B). 이러한 한계를 극복하기 위해, 정량적 PCR 전에 소랄렌 가교결합 반전 단계23의 염기- 및 열-촉매 반전을 적용하였다. 이 방법은 파이론 측 모노 부가물23,24의 작은 종만을 남깁니다. 이는 게놈 dsDNA와 분자 내 결찰 제어 앰플리콘의 80배 회복으로 이어졌으며, 이는 대부분의 주형 분자가 적어도 하나의 푸란측 모노부가물 또는 가닥간 가교결합을 가지고 있음을 나타냅니다(그림 5B,C). 가교결합 반전 전후의 dsDNA 게놈 DNA 제어의 Cp 값의 비교는 가교결합 효율의 추정치를 제공하며, 이는 여기에 도시된 범위 내에 있어야 한다. 짧은 앰플리콘 외에도 이 절차는 최대 3kb 길이의 템플릿을 복원할 수 있습니다(그림 S2). ssDNA 앰플리콘에 대한 변화는 관찰되지 않았으며, 이는 ssDNA에 대한 소랄렌 가교결합의 부족과 일치하였다(도 5B-D). 또한, 가교링크 반전 절차가 검출가능하게 DNA23을 손상시키지 않는다는 것을 보여준다. 비가교결합된 ds-ssDNA 세그먼트(50bp 및 118bp/nt; 그림 5A) dsDNA 및 ssDNA 앰플리콘의 중간이었으며 회복율이 8 배 향상되었습니다 (그림 5B, C). 가교링크 반전은 두 dsDNA 앰플리콘의 상대적 수준에 영향을 미치지 않았으며, 분자 내 결찰 대조군은 게놈 DNA 대조군에 비해 0.2-0.25 범위에 남아 있었습니다(그림 5E). 그러나, dsDNA 게놈 DNA 대조군에 대한 ssDNA 앰플리콘의 상대적인 양은 dsDNA 주형에 비해 ssDNA에 대해 예상되는 40배 초과량에서 0.5배로 변경되었다(도 5D). 마찬가지로, 부분적으로 ssDNA DLC 신호는 dsDNA 분자 내 결찰 대조군에 비해 6.6 x 10-2에서 6.6 x 10-3으로 감소했습니다(그림 5F). 이로 인해 DSB 유도 후 4 시간에이 접근법에 의해 검출 된 염색체 간 기증자에서 D- 루프 관절 분자의 수는 세포 집단의 총 부서진 분자의 평균 1.3 %로 추정됩니다. 이러한 절대 추정은 dsDNA의 소랄렌 기반 왜곡 및 ssDNA 증폭으로 이루어질 수 없었으며, 이는 이러한 추가적인 가교링크 반전 단계의 가치를 강조한다.
그림 1: 상동 재조합 및 분해능 하위 경로. 한쪽 또는 양쪽 말단 DSB(표시됨) 또는 ssDNA 갭을 초래하는 DNA 손상 후, DNA 말단의 5'에서 3' 절제술은 부속 인자의 도움을 받아 Rad51 필라멘트가 형성되는 3' ssDNA 돌출부를 나타냅니다. 그런 다음 Rad51은 복구 이벤트를 템플릿화할 온전한 이중 DNA(즉, 기증자)를 찾기 위해 게놈을 검색합니다. 이 과정은 DNA 가닥 침습에서 절정에 달하며, 여기서 끊어진 가닥 Watson-Crick 염기는 이중 가닥 DNA 기증자의 상보적인 가닥과 쌍을 이루어 반대쪽 가닥을 대체하고 초기 D-루프를 형성합니다. 이 D-루프는 Rad51 상동성 검색이 다른 기증자를 선택할 수 있도록 반전되거나 DNA 손상 이벤트 동안 손실된 염기를 대체하기 위해 DNA 중합효소에 의해 확장될 수 있습니다. 이 확장된 D-loop 중간체를 제품으로 해결하기 위해 세 가지 HR 하위 경로를 사용할 수 있습니다. 첫째, 확장 된 D- 루프는 헬리 카제에 의해 중단 될 수 있으며, 새로 확장 된 브레이크 끝이 합성 종속 스트랜드 어닐링 (SDSA)이라고하는 프로세스에서 두 번째 끝으로 어닐링 할 수 있습니다. DNA 합성 및 결찰을 채우면 제품 형성이 이루어집니다. 대안적으로, 브레이크의 두 번째 끝은 변위 된 도너 스트랜드에 어닐링되어 이중 홀리데이 접합 (dHJ)을 형성 할 수 있습니다. dHJ의 핵분해능은 크로스오버(CO) 또는 비크로스오버(NCO)를 초래하는 반면, dHJ 용해(표시되지 않음)는 NCO 생성물만 생성합니다. 마지막으로, DSB의 두 번째 말단에 관여하지 않으면 수천 개의 염기쌍이 기증자에서 끊어진 가닥으로 복사되는 돌연변이 유발 과정인 절단 유도 복제(BIR)가 발생합니다. 이 과정은 수렴 복제 포크 또는 염색체의 끝까지 확장 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: D 루프 캡처(DLC), D 루프 확장(DLE) 및 차단 유도 복제(BIR) 생성물 형성 분석의 전제. DSB 형성은 GAL1 프로모터의 제어하에 부위 특이적 엔도뉴클레아제에 의해 구동된다. DSB 유도는 초기 D- 루프의 형성으로 이어진다. DLC 분석에서 DNA의 가닥간 가교는 이 구조를 보존한 다음 추출합니다. 제한 효소 부위 복원은 긴 올리고뉴클레오티드와의 혼성화를 통해 달성된 다음 DNA를 분해하고 결찰하여 정량적 PCR(qPCR)로 정량할 수 있는 생성물을 형성합니다. DLE 분석은 DNA가 가교결합되지 않고 대신 분자내 결찰 산물이 절단의 한쪽에 있는 ssDNA의 두 말단 사이에 형성되고 3' 말단은 DNA 중합효소에 의해 확장된다는 점에서 다릅니다. qPCR은 다시 키메라 결찰 산물의 형성을 정량화하는 데 사용됩니다. DLE 분석을 통한 D-루프 확장의 검출도 마찬가지로 제한 효소 부위 복원이 필요합니다. 대조적으로, 이중-가닥 BIR 생성물은 혼성화 올리고뉴클레오티드 없이 DLE 분석 프라이머를 사용하여 검출된다. R은 제한 효소 부위가 효소 절단에 적합하다는 것을 나타내고; (R)은 절단할 수 없는 제한효소 부위를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DSB 유도 후 2시간에 D-루프의 DLC 분석 분석의 대표적인 결과. 샘플을 수집하고, 준비하고, 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 qPCR에 의해 분석하였다. 파란색 기호는 n=3에 대한 혼성화 올리고를 사용한 표준 야생형 균주에 대한 결과를 나타낸다. 녹색 기호는 n=3에 대한 혼성화 올리고가 없는 야생형 균주에 대한 결과를 나타낸다. 두꺼운 빨간색 선은 중앙값을 나타냅니다. 보라색 기호는 소랄렌 가교결합이 없지만 n = 2에 대한 혼성화 올리고가 있는 샘플을 나타냅니다. 기호는 샘플이 동일한 문화권에서 파생되었음을 나타냅니다. 가교 효율의 실험 간 차이는 특정 qPCR 대조군에 가변성을 도입할 수 있지만 실험 내에서 이러한 qPCR 대조군에 샘플 간 변동성이 없는 한 문제가 되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: DSB 유도 후 6시간 동안 DLE 분석 분석의 대표적인 결과. 샘플을 수집하고, 준비하고, 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 qPCR에 의해 분석하였다. 파란색 기호는 n=3에 대한 혼성화 올리고를 사용한 표준 야생형 균주에 대한 결과를 나타낸다. 녹색 기호는 n=3에 대한 혼성화 올리고가 없는 야생형 균주에 대한 결과를 나타낸다. 두꺼운 빨간색 선은 중앙값을 나타냅니다. 혼성화 올리고가 있거나 없는 샘플은 동일한 배양물에서 유래됩니다. 보라색 다이아몬드는 n = 1에 대해 올리고를 혼성화하지 않은 실패한 샘플을 나타냅니다. 기호는 샘플이 동일한 문화권에서 파생되었음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 소랄렌 가교링크 반전의 대표적인 결과. (A) 소랄렌-DNA 모노-부가물(*) 및 가닥간 가교결합(X)은 ssDNA 주형과 달리 dsDNA에서 특이적으로 발생하며 DNA 중합효소에 의한 증폭을 방지합니다. 이러한 차이는 qPCR에 의한 dsDNA 및 ssDNA 함유 템플릿의 정량화에 편향을 도입합니다. 이러한 편향은 소랄렌 가교결합의 역전시 극복될 수 있다. (B) DSB 유도 후 4시간 후에 얻은 dsDNA(게놈, 결찰), ssDNA 및 혼합된 ds-ssDNA(DLC) 앰플리콘의 대표적인 Cp 값. 데이터는 개별 값과 4개의 생물학적 반복실험의 중앙값을 나타냅니다. (C) (B)의 Cp 값으로부터 계산된 가교링크 반전 시 증폭 회복. (d) 소랄렌 가교결합 반전을 동반하거나 포함하지 않는 게놈 dsDNA 대조군에 대한 ssDNA 증폭. 반전 시, ssDNA 앰플리콘은 게놈 dsDNA 대조군의 예상되는 0.5에서 증폭된다. (e) 소랄렌 가교결합 반전을 포함하거나 포함하지 않는 게놈 dsDNA 대조군에 대한 dsDNA 분자내 결찰 조절. (f) dsDNA 라이게이션 대조군에 대한 DLC 신호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 현재 DLC/DLE 분석 시스템 및 제안된 수정 사항. 위: 현재 DLC/DLE 분석 중단 부위와 기증자가 표시됩니다. 아래: DLC/DLE 분석 중단 부위 및 기증자에 대한 계획된 수정. (i) 117 bp HO 엔도뉴클레아제 절단 부위는 노란색으로 표시된다. D-루프 중단을 모니터링하는 동안 교란 효과를 방지하기 위해 HOcs(74bp)의 왼쪽이 공여체에 도입되어 둘 사이의 재조합이 3' 플랩이 없는 완벽하게 일치하는 D-루프를 생성합니다. (II) 시스템을 복구 할 수있게하여 생리학적으로 만들기 위해 기증자와 상동 한 DNA (청록색과 라일락으로 표시됨)가 HOcs의 오른쪽에 삽입됩니다. (III) HOcs 오른쪽의 가닥에 의한 침입 및 확장은 파손의 해당 측면에 고유 한 시퀀스 (주황색으로 표시)를 사용하여 모니터링됩니다. (IV) 추가로 균등하게 간격을 둔 제한 효소 부위 및 공여체에 고유 한 서열은 D- 루프 확장 (HOcs의 왼쪽으로부터의 침입을 통해 )이 더 먼 부위에서 모니터링 될 수있게한다. 이 변형 된 시스템에서, 합성 의존적 스트랜드 어닐링 (SDSA) 또는 이중 홀리데이 접합 (dHJ) 형성은 청록색 또는 라일락으로 표시된 부위에서 발생할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: DLC 및 DLE 분석에 사용된 qPCR 프라이머의 맵. DLC 및 DLE 분석에서 분석에 사용된 게놈 유전자좌의 지도, 이들의 관련 특징, 및 근사 프라이머 결합 부위(qPCR 프라이머 목록은 표 3 참조). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: 대형 앰플리콘에 대한 가교 반전의 정성적 평가. 게놈 DNA는 가교결합 또는 비가교결합된 샘플로부터 제조되었으며, 여기서 지시된 바와 같이, 프로토콜, 섹션 1 내지 5에 기재되어 있다. 비-정량적 PCR을 사용하여 절단 부위와 공여자들 사이에 공유되는 상동성 영역에 걸쳐 있는 3 kbp 세그먼트를 증폭하였다. 가교된 DNA와 비가교결합된 DNA 사이의 증폭 효율의 차이와 제한된 양의 샘플로 인해 입력 DNA를 표준화할 수 없었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: DLC 및 DLE 분석 분석에 사용된 S. 세레비시아에 균주. 본 연구에 사용된 반수체 출아 효모 균주의 유전자형. 변형은 요청시 제공됩니다. DLC/DLE 분석 분석에 사용할 수 있는 추가 균주는 Piazza et al.8 및 Piazza et al.9에서 찾을 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: DLC 및 DLE 분석 분석에 사용되는 혼성화 올리고뉴클레오티드. 긴, 혼성화 올리고뉴클레오티드의 서열은 DLC 및 DLE 분석에 사용된다. 맞춤형 올리고뉴클레오티드 제공자에 의한 혼성화 올리고뉴클레오티드의 추가 SDS-PAGE 정제가 권장됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: DLC 및 DLE 분석 분석에 사용된 qPCR 프라이머. DLC 및 DLE 분석에 대한 qPCR 프라이머 쌍 및 이들의 목적에 대한 설명. olWDH1764, olWDH2009 및 olWDH2010은 두 개의 qPCR에서 사용됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S1: DLC 분석 qPCR 설정 및 분석을 위한 템플릿. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S2: DLE 분석 qPCR 설정 및 분석을 위한 주형. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 시퀀스 파일 1-5. 관련 게놈 특징 및 앰플리콘에 대한 보충 서열 파일. 시퀀스 파일은 ApE 파일 형식입니다. ApE는 DNA 서열을보고 편집 할 수있는 무료로 제공되는 소프트웨어입니다. ApE 파일은 모든 주요 시퀀스 편집 소프트웨어와도 호환됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 분석은 근접 결찰 및 qPCR을 사용하여 초기 및 확장 D-루프(DLC 분석), D-루프 확장(DLE 분석) 및 BIR 생성물 형성(혼성화 올리고뉴클레오티드가 없는 DLE 분석)의 검출을 허용합니다. DSB로부터 멀리 떨어진 부위에 대한 Rad51의 ChIP-qPCR은 이전에 Rad51 매개 상동성 검색 및 D 루프 형성을 위한 프록시로서 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 ChIP-qPCR 신호는 Rad51-관련 인자 Rad54뿐만 아니라 중단 부위와 잠재적 공여체 사이의 서열 상동성과 무관하며, 따라서, D-루프 중간체10,11보다는 Rad51-ssDNA 필라멘트와 dsDNA 사이의 일시적인 연관성을 나타낼 가능성이 더 높다. 대조적으로, DLC 신호는 DSB 형성, Rad51, Rad52, Rad54, 및 DSB와검정된 공여자 부위 사이의 공유 서열 상동성에 의존한다 8. 또한, Mph1 및 Srs2 헬리카제와 Sgs1-Top3-Rmi1 헬리카제-토포이소머라제 복합체가 없을 때 증가된 DLC 신호가 관찰되며, 이는 이 세 가지 요인이 Rad51/Rad54로 만든 초기 D-루프를 시험관 내 8,25,26,27로 분해할 수 있다는 이전 보고와 일치합니다. DLE 분석은 D-루프 연장 및 BIR 생성물 형성19를 구별할 수 있기 때문에, 재조합 관련 DNA 합성을 따르는 이전의 방법에 비해 유사하게 개선된 것을 나타낸다.
위에서 논의된 바와 같이, 게놈 DNA, DSB 유도, 소랄렌 가교결합, 분자내 결찰 및 올리고뉴클레오티드 혼성화를 위한 것을 포함한 qPCR 대조군은 이들 분석의 성공 및 재현성에 매우 중요하다. 원시 게놈 DNA qPCR 값은 샘플 전체에서 거의 동일해야 합니다. ARG4 게놈 DNA 대조군에 대한 낮은 Cp 값은 과도한 DNA를 나타내며 수집된 세포 수를 조정해야 합니다. 이 대조군에 대한 높은 Cp 값은 DNA 회수가 불충분하거나 qPCR을 방해하는 시약으로 오염되었음을 나타냅니다. 구형성형술 후, 표준 광학 현미경과 동일한 부피의 시료 및 멸균수를 사용하여 세포 용해를 관찰할 수 있습니다. 물을 첨가 할 때 불충분 한 용해가 관찰되면 zymolyase 용액을 다시 만들거나 30 ° C에서 배양을 연장해야합니다. 또한 P/C/IA 추출에 의한 DNA 정제 중에 샘플이 손실되거나 오염 물질이 유입될 수 있습니다. DNA의 효율적인 회수를 위해서는 P/C/IA의 pH가 ~8.0으로 조정되고 상부 단계를 제거하는 동안 하단 단계가 방해받지 않도록 해야 합니다. 마지막으로, 1x TE에서 DNA 펠릿의 비효율적인 재현탁은 낮은 Cp 값을 초래할 수 있습니다. 37°C에서 더 긴 인큐베이션과 볼텍싱은 DNA 펠릿의 재현탁을 개선할 것이다.
게놈 DNA 게놈 DNA 제어 외에도 DSB 유도 및 제한 효소 절단 제어 반응도 샘플 간에 유사해야 합니다. HO 엔도뉴클레아제 또는 DSB 또는 제한 효소 인식 부위의 부위에서의 제한 효소 절단은 이 영역을 가로지르는 증폭을 방지하고; 따라서, 이들 대조군에 대한 전형적인 정규화된 qPCR 값은 0에 가깝고, 높은 qPCR 값은 불충분한 절단을 나타낸다. DSB 부위에서 높은 신호가 관찰되면 갈락토오스 용액을 다시 만들어야합니다. 알려진 세포 주기 결함이 있는 돌연변이체의 경우, DSB 유도는 갈락토스가 보충된 YPDA 및 YPA 배지에 프로토콜(섹션 1 참조)에 따라 성장한 동일한 양의 배양물을 도금하여 정량화해야 합니다. 갈락토오스를 함유한 배지에서 자라는 콜로니는 말단 결합이 절단할 수 없는 HOcs를 생성하는 효모를 나타냅니다. 와일드 타입에 비해 관심 있는 돌연변이에 훨씬 더 많은 최종 조인 이벤트가 있는 경우 DLC/DLE 신호에 영향을 미치는 DSB 유도의 이러한 차이를 보상하기 위해 보정을 적용해야 합니다.
3개의 프라이머 쌍(olWDH1764/olWDH1768, olWDH2010/olWDH2012 및 olWDH2009/olWDH2011)은 EcoRI-HF 및 HindIII-HF 제한 효소에 의한 혼성화 및 절단에 의한 제한 효소 부위 복원을 평가합니다. 더욱이, 분자내 결찰 조절은 또한 적절한 제한 효소 소화에 의존한다. 따라서, 분자 내 결찰 효율이 낮고 이들 3 개의 프라이머 쌍 중 하나에 대한 높은 신호를 갖는 샘플은 제한 효소 절단이 불충분하다. 후속 제제에서 추가 제한 효소가 제공되어야하며 제한 효소의 효능은 게놈 DNA에서 평가되어야합니다. olWDH1769/olWDH1763 프라이머 쌍은 분자 내 결찰 효율도 측정되는 DAP2에서 EcoRI 절단을 측정하는 DLC 분석에 대한 추가 제어를 나타냅니다. 적절한 분자내 결찰 신호를 갖지만 이 세 가지 프라이머 쌍 중 하나에 대해 높은 신호를 갖는 샘플은 혼성화 올리고에 의한 부적절한 제한 효소 부위 복원을 갖는다. 이 문제를 해결하려면 중복 샘플을 수집하고 영향을 받는 혼성화 올리고의 농도를 다양화해야 합니다. 혼성화 올리고가 있거나 없는 이러한 반응에 대해 얻은 일반적인 qPCR 값은 그림 3 및 그림 4 및 Piazza et al.8 및 Piazza et al.9에서 찾을 수 있습니다.
DLC 및 DLE 분석 모두에서, 게놈 DNA 대조군으로 정규화된 0.15-0.35의 분자내 결찰 효율은 정상으로 간주된다. 초기 및 확장 D-루프와 BIR 제품의 검출은 효율적인 결찰에 의존하므로 결찰 신호가 낮은 샘플은 폐기해야 합니다. ATP가 부족한 10x 결찰 완충액은 4 ° C에서 6 개월 이상 보관해야합니다. 너무 많은 세포를 수집하면 분자간 결찰이 발생하여 분자 내 결찰 효율이 낮아지고 DLC/DLE 신호가 저하될 수 있습니다.
DLC 및 DLE 분석에 대한 이러한 대조군은 거의 모든 민감한 단계에 대해 보고하지만, 이러한 대조군이 적절한 범위 내에 있을 때 DLC 또는 DLE 신호에 대한 비생리학적 값을 얻을 수 있습니다. 낮은 DLC 또는 DLE 신호는 매우 민감한 셀 스페로퍼스팅 단계의 오류로 인해 발생할 수 있습니다. 몇 개의 샘플만 병렬로 처리하고 항상 4°C로 유지해야 합니다. 높은/낮은 DLC/DLE 신호는 각 시점에서 너무 많은/적은 셀을 수집하여 발생할 수도 있습니다. 이 문제는 각 샘플에 대해 각 시점에서 여러 OD600s의 세포를 수집하여 해결할 수 있습니다.
현재 형태의 DLC 및 DLE 분석에는 몇 가지 기술적 및 개념적 제한이 있습니다. 첫째, 소랄렌-매개성 가닥간 가교결합 밀도는 ~1 in 500bp8이다. 따라서 DLC 신호가 증가하면 모집단에 D-루프가 더 많거나, 모집단에서 D-루프의 평균 길이가 증가했거나(D-루프가 500bp보다 작을 수 있다고 가정) 둘 다를 나타낼 수 있습니다. 또한 DLC 분석에 의해 D-루프가 캡처될 가능성은 D-루프 길이가 감소함에 따라 감소합니다. 매우 짧은 D-루프가 특정 돌연변이 배경에서 전체 D-루프 집단의 상당 부분을 차지할 수 있다는 점을 감안할 때, 결과를 해석할 때 분석의 이러한 한계를 고려해야 합니다. 둘째, DLC 분석에는 DNA 가교가 필요하지만 DLE 분석에는 필요하지 않습니다. 이전에는 주어진 실험에 대해 DLC 및 DLE 샘플을 별도로 수집하고 분석해야 했습니다. 그림 5에 표시된 방법은 강력한 가교 반전을 달성하여 동일한 배양에서 여러 샘플을 수집할 필요성을 줄여줍니다. HindIII 인식 부위의 하류에 있는 끊어진 가닥에 두 번째 EcoRI 제한 효소 부위를 도입하면 순차적인 DLC 및 DLE 분석이 가능합니다.
이러한 기술적 한계에 더하여, DLC 및 DLE 분석 시스템은 유도성 DSB의 우측이 공여체와의 상동성이 결여되어 있기 때문에 현재 생존 가능한 HR 생성물의 회수를 허용하지 않는다. 두 번째 말단 결합 및 합성의 역학 및 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해, 시스템은 절단의 두 번째 말단과 공여자간에 공유되는 상동성의 근위 또는 원위 영역을 사용하여 복구가 가능하도록 수정 될 수 있습니다 (그림 6). 앞으로 DLC 및 DLE 분석을 ChIP-qPCR, 고처리량 염색체 형태 캡처(Hi-C) 및 생체 내 D-루프 매핑과 같은 다른 기술과 결합하여 절단 형성, 말단 절제술, Rad51 필라멘트 형성, 초기 D-루프 형성, D-루프 확장, D-루프 반전, 두 번째 끝 결합, 두 번째 끝 합성 및 분해능28.
요약하면, DLC 및 DLE 분석은 근접 결찰 원리를 사용하여 초기 및 확장 D-루프, D-루프 확장 및 BIR 생성물 형성의 정량화를 허용합니다. 이 분석은 세포 생존력과 무관하게 D-루프 형성 및 확장의 반정량적 측정을 허용한 최초의 분석이기 때문에 이 분야의 주요 발전을 나타냅니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Heyer 실험실에서의 연구는 W.-D.H.에 GM58015 및 GM137751 보조금으로 지원됩니다. Piazza 실험실의 연구는 유럽 연구위원회 (ERC-StG 3D-loop, 그랜드 컨디먼트 851006)의 지원을받습니다. D.R.은 T32CA108459와 A.P. Giannini Foundation의 지원을 받습니다. DLC/DLE 분석 결과를 공유하고 이 프로토콜에 자세히 설명된 분석의 변경 사항을 추가로 검증해 주신 Shih-Hsun Hung(Heyer Lab)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
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