Summary
大肠杆菌在新生儿中引起败血症，这些新生儿在出生时摄入细菌。大肠杆菌从肠道到血流的能力所涉及的过程知之甚少。该体外模型评估了大肠杆菌菌株通过肠上皮细胞的能力。
Abstract
新生儿摄入母体大肠杆菌菌株，这些菌株在分娩时定植在肠道中。具有跨肠道易位能力的大肠杆菌菌株侵入新生儿的血液，导致危及生命的菌血症。这里介绍的方法利用在半透性插入物上生长的极化肠上皮细胞来评估体外新生儿大肠杆菌菌血症分离株的转吞作用。该方法使用已建立的T84肠细胞系，该细胞系具有生长到汇合并形成紧密连接和桥粒的能力。达到汇合后，成熟的T84单层产生跨上皮电阻（TEER），可以使用电压表进行量化。TEER值与细胞外成分（包括细菌）在肠道单层中的细胞旁通透性呈负相关。另一方面，细菌的跨细胞传代（转胞作用）不一定会改变TEER测量。在该模型中，感染后长达6小时量化穿过肠道单层的细菌通道，并重复测量TEER以监测细胞旁通透性。此外，该方法有助于使用免疫染色等技术来研究极化上皮上皮细菌转吞过程中紧密连接和其他细胞间粘附蛋白的结构变化。该模型的使用有助于表征新生儿大肠杆菌转胞酶穿过肠上皮产生菌血症的机制。
Introduction
大肠杆菌是新生儿早发性败血症的最常见原因1，2，3。新生儿大肠杆菌菌血症的死亡率可达40%，脑膜炎是一种与严重神经发育障碍相关的可能并发症2。新生儿摄入母体大肠杆菌菌株可引起新生儿菌血症;这个过程已经在动物模型2，4中得到复制。一旦摄入，致病菌就会从新生儿肠腔穿过肠道屏障进入血液，引起败血症。产生菌血症的新生儿侵袭性大肠杆菌菌株侵入肠上皮细胞的能力各不相同1，5。然而，它们在侵袭后转胞上皮的能力尚未完全表征。
这种肠道转吞模型是一种有用的 体外 方法，可以模拟细菌通过肠上皮。本手稿中介绍的方法的总体目标是比较新生儿 大肠杆菌 分离株转胞肠上皮的能力。这里描述的模型利用T84细胞，它们是永生化的人肠腺癌细胞6，7。T84细胞生长到具有两个独立隔室的半透膜上汇合。使用这种技术的基本原理是，就像 在体内发生的那样，这些肠细胞极化并发展出成熟的紧密连接6，8。与膜接触的一侧成为基底侧。细胞的另一侧成为顶端侧，类似于摄入的病原体粘附和侵入的肠腔。跨孔膜对细菌具有渗透性，但极化的肠细胞形成紧密的连接，这会损害细菌的细胞旁运动9。因此，该方法提供了利用人细胞系研究细菌转吞作用过程（包括跨细胞途径）的受控 体外 环境的优点。虽然存在其他方法可以研究细菌在肠上皮的转吞作用，但此处介绍的跨孔方法提供了更大的便利性和可及性。可以使用替代技术，例如利用在Ussing室系统中设置的 离体 样品的技术。然而，他们利用可能不容易获得的组织标本，特别是如果研究打算研究人体生理学10。肠道类器官代表了研究宿主-细菌相互作用的 体外 替代方案的另一个例子11。虽然类器官单层也可用于跨孔系统以研究细菌转吞作用，但它们需要干细胞的分离和生长以及使用特定的生长因子来诱导分化12。因此，与本手稿中描述的Transwell方法相比，它们的使用更耗时，并且成本更高。
使用这种体外跨孔系统对细菌通过肠上皮的评估已成功针对各种病原体进行。这些研究表明，使用T84细胞的Transwell系统在极化肠上皮13，14，15上表征细菌的转吞作用的效用。然而，该转孔法在比较产菌血症新生儿大肠杆菌菌株的转吞能力中的应用尚未详细描述。这份手稿为其他研究人员提供了一个标准的Transwell方案，该方案可靠且易于使用，不需要过于昂贵的资源。
为了比较新生儿侵袭性大肠杆菌菌株转胞肠上皮的能力，肠上皮单层的顶端侧可以被已知数量的细菌细胞感染。孵育后，可以收集上皮基底侧的培养基并定量细菌以确定随时间推移的细菌转吞量。在本手稿中，所介绍的方法用于研究从因菌血症住院的新生儿中恢复的新生儿大肠杆菌临床菌株的转胞作用能力。选择这些新生儿临床分离株进行转胞作用研究的纳入标准已于先前发表1，2，16。当使用不同的大肠杆菌菌株进行该方法时，可以比较它们的转吞能力。通过这一过程，肠道转吞模型为表征大肠杆菌的毒力因子提供了有价值的数据，这些因子有助于导致新生儿菌血症发展的多步骤过程。
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Protocol
注意：在生物安全2级（BSL-2）安全柜中对T84细胞，细菌，平板和试剂进行所有操作，以避免污染。使用单独的区域和培养箱进行涉及无菌 T84 细胞、感染 T84 细胞和 大肠杆菌的所有工作。使用此处描述的方法测试的临床 大肠杆菌 分离株是根据我们机构1，16 的机构审查委员会的指南获得的。
1.用T84细胞制备转吞插入物（实验前约1-2周）
- 在由Dulbecco的改良鹰培养基：Ham的F-12营养混合物（1：1，最终浓度：每个50%），5%胎牛血清和1%（100 U / mL）青霉素/链霉素双重抗生素混合物组成的组织培养基（TCM +抗生素）中培养美国型培养物收藏（ATCC）T84细胞。将细胞在37°C与5%CO2孵育。
注意：不含青霉素/链霉素（不含抗生素的TCM）的这种培养基配方的变体用于该程序的后续步骤（第2节及以后）。确保每个步骤都使用正确的配方。 - 在生物安全柜（BSC）内工作，将T84细胞接种到聚对苯二甲酸乙二醇酯膜细胞培养物中，该插入物具有3μm孔，用于24孔板。包括每个所需实验条件的跨孔插入重复以及未感染的对照，以监测可能的污染。
- 在设计用于容纳Transwell插入物的24孔板中，用1 mL中药+抗生素填充所需数量的收集孔。
- 在每个孔中，放置一个跨孔插入物。
- 用悬浮在 500 μL TCM + 抗生素中的 1 x 105 T84 细胞接种这些插入物。使用台盼蓝染色的血细胞计数器或自动细胞计数器17量化细胞数量。
- 在与细胞生长相同的条件下孵育含有种子插入物的跨孔板。
- 用光学显微镜验证单层在接种插入物后约48小时开始汇合。
- 接种后每 2 天，使用上皮伏特/欧姆表 （EVOM） 测量并记录跨上皮电阻 （TEER） 以评估单层的成熟度。一旦插入物达到至少 1，000 Ω·cm2 的 TEER，它们就被认为已准备好进行测定18。
注意：播种后，插入物通常需要 7-10 天才能到达此 TEER。一旦达到该电阻，T84细胞将在光学显微镜下显示100%汇合。- 不使用时，将电极浸没在0.15 M KCl中的EVOM探头存放。
- 在测量TEER之前，通过将电极探针浸入50mL锥形管中的5mL 70%乙醇中10-15分钟来净化电极探针。取出探针，甩掉多余的乙醇，让它在平衡计分卡内风干10分钟。保留乙醇管。
- 通过将干燥的去污探针放入含有 1 mL 中药 + 抗生素的无菌孔中，并在内部装有 500 μL TCM + 抗生素的无菌插入物中来测试 EVOM 和探针。确保 EVOM 读数为 <200 Ω。记录此空白值，以便在步骤1.3.6中描述的后续电阻计算中使用它。
- 从中医+抗生素的管中取出探针。保留该管以在整个实验过程中储存探针。
- 轻轻地将探头放入第一个插入物中，长电极在收集孔中，短电极在插入物内。让长电极接触收集孔的底部，但不要向下推，因为这可能会破坏上皮单层。
- 重复此过程以测量并记录每个刀片的电阻（以欧姆 （Ω） 为单位）。完成后，通过将探针浸没在乙醇中再浸入10-15分钟来净化。然后，将去污的探头移回KCl溶液进行储存。从每个含有T84细胞的插入片段获得的每个值中减去步骤1.3.3中获得的空白电阻。将每个刀片的电阻 （Ω） 乘以每个刀片底部的面积 （cm 2），得到最终的 TEER 测量值 （Ω·cm2）。
- 一旦TEER达到至少1，000 Ω·cm2，上皮单层成熟并准备好进行感染测定。
- 随着TEER的成熟，每1-2天为细胞提供新鲜培养基。
- 在新的 24 孔板中，为制备的每个种子插入物向一个孔中加入 1 mL 中药 + 抗生素。
- 使用无菌镊子，小心地将插入物转移到新补充的孔中。
- 更换插入件中的介质。
- 通过倾斜板并使用内部真空吸气器沿着插入物侧面用移液器尖端轻轻取出介质，从插入物中取出旧介质。吸气器允许调节低水平吸力以防止细胞破裂。不要让移液器吸头接触插入物的底部，因为这会破坏发育中的上皮单层。
- 在插入物中加入 500 μL 中药 + 抗生素。用光学显微镜观察单层以验证其是否完好无损。
- 每 1-2 天，按照上述步骤 1.3.2-1.3.6 中所述测量每个插入物的 TEER。
2.在实验前1天使用不含抗生素的中药制备T84细胞
- 在实验前一天测量并记录TEER。
- 以与先前细胞制备和维护期间相同的方式更换TCM。然而，不使用抗生素的中药代替用于准备感染（板孔中 1 mL，插入物中 500 μL）。
3. 大肠杆菌 培养（实验前1天开始）
注意：使用致病性临床 大肠杆菌 菌株时，请使用生物安全2级（BSL-2）预防措施。
- 取带有 5 mL 无菌溶原肉汤 （LB） 的标记 15 mL 锥形管，并使用无菌环用一种细菌菌株 （大肠杆菌） 的一个菌落接种肉汤。重复此过程，为每种要测试的菌株创建一个过夜培养管。
- 在培养箱振荡器（250rpm，37°C）中孵育过夜培养物，使管盖松开。
4.准备 大肠杆菌 接种物，上皮细胞和材料（实验当天上午）
注意：使用不含抗生素的中药，从此时起升温至37°C。
- 将每个过夜LB培养物中的250 μL加入50 mL锥形管中的25 mL不含抗生素的中药中（每个菌株一个）。保持管子的盖子松开。将这些新的培养管以相同的设置（250rpm，37°C）放入振荡器中整整2小时。在等待时执行其余子步骤。
- 测量每个插件的TEER，如步骤1.3.2-1.3.6中所述。将这些记录为时间 （t） = 0 小时的 TEER。
- 将插入物移动到新板中的孔中，并使用步骤1.4.3中描述的技术更换培养基。然而，这一次，用 500 μL 不含抗生素的中药填充新的收集孔，并用 400 μL 不含抗生素的中药填充插入物。将插入物保持在组织培养箱内，直到感染。
- 放置足够数量的方形LB琼脂平板，加热至室温（RT），以便以后进行铺板和细菌定量。
5.接种细胞（实验开始）
- 正好2小时后，从摇床中取出早晨的细菌培养物，并离心10分钟（1，900× g，4°C）。
注意：对于以下所有步骤，请将所有细菌悬浮液保持在冰上以尽量减少生长。 - 将细菌沉淀重悬于不含抗生素的中药中。使用分光光度计将光密度（OD）调节至0.7-0.9，并用不含抗生素的TCM进一步稀释至1 x 106 菌落形成单位（CFU）/mL的浓度（约1：100稀释）。使用该细菌悬浮液每 100 μL 体积用 1 x 105 CFU 感染每个插入物。
- 标记Transwell板，并用100μLOD调节接种物感染每个插入物（每个插入物总共1 x 105 CFU）。该测定现已开始。记下时间，并将其记录为 t = 0 h。
- 使用跟踪稀释法接种细菌悬浮液以定量 CFU/mL，将 10 μL 等分试样接种在方形 LB 琼脂平板19 上。
6. 量化转吞作用
- 接种后每 30 分钟，用 500 μL 不含抗生素的中药填充新孔。使用一组不同的无菌镊子将插入物转移到这些新孔中，用于每种不同的细菌菌株。
- 将每个插入物的用过的收集孔中的培养基收集到单独的标记管中。将这些管子放在冰上。在时间点之间将Transwell板返回培养箱。
- 对于每个插入片段，合并收集的培养基从t = 0.5小时，t = 1小时，t = 1.5小时和t = 2小时，并短暂涡旋。使用跟踪稀释方法将收集的培养基接种在LB琼脂平板上，以量化实验前2小时内转核的细菌量。
注意：每30分钟取回细菌并将其保存在冰上可确保收集孔中的细菌生长最小化，并对主要转胞细菌进行测量。 - 将标记的跟踪稀释LB琼脂平板置于37°C的细菌培养箱中，无需补充CO2，并将T84跨孔板返回组织培养箱。
- 在t = 4小时时，通过合并t = 2.5小时，t = 3小时，t = 3.5小时和t = 4小时的收集培养基来重复步骤6.3。
- 在t = 6小时时，通过合并t = 4.5小时，t = 5小时，t = 5.5小时和t = 6小时的收集培养基来重复步骤6.3。此外，在t = 6小时时，从对照孔中铺板培养基。
7. 实验结束
- 在实验结束时测量并记录TEER，t = 6小时。使用步骤 1.3.2-1.3.6 中所述的过程。
- 通过将探针浸入70%乙醇中10-15分钟来净化探针。如果需要，丢弃刀片，或保存/处理它们以用于其他应用。让LB琼脂平板孵育过夜，并对所有其他使用过的材料进行消毒和/或安全处理。
- 孵育过夜后，在跟踪稀释LB平板上手动计数细菌菌落，以确定接种量和 大肠杆菌 转吞量。确保对照板没有显示任何细菌生长。
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Representative Results
图 1：T84 TEER 随时间的变化。 随着插入物上的T84细胞层成熟，单层的电阻增加。在TEER至少为1，000 Ω·cm2时，细胞层充分发育以减少细胞旁细菌运输并允许测量主要跨细胞细菌运输。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。
在第1节所述的无菌T84细胞增殖期间，T84单层的TEER随着时间的推移不断上升，在接种后约7天后超过1，000 Ω·cm2 （见 图1）。尽管T84细胞的上皮细胞极化和TEER成熟比其他肠道细胞（如Caco-2）更稳健，但仍可能需要进行一些故障排除6。刀片的TEER不应在两次测量之间急剧下降。TEER的这种下降可能表明上皮单层的机械破坏。应确保在更换培养基期间，吸液器的尖端永远不会接触细胞培养插入物的底部。如果怀疑这种类型的损伤，可以通过光学显微镜将其可视化为抽吸位置附近没有上皮细胞。除了处理造成的损坏外，TEER 的减少可能表明污染。
图2：新生儿大肠杆菌分离株随时间推移的转吞作用。感染T84插入物后，使用跟踪稀释法定量成功到达收集孔的新生儿大肠杆菌临床分离株。不同的大肠杆菌菌株可以根据其转胞上皮的能力进行比较。非致病性大肠杆菌DH5α作为比较物被纳入。这些图显示了每个时间点的平均 CFU 和标准误差。使用单尾t检验比较平均转吞值，结果表明新生儿大肠杆菌分离株#1与#2在感染后2小时（*p < 0.05）、4小时（**p < 0.04）和6小时（***p < 0.04）有显著差异。相比之下，非致病性大肠杆菌菌株DH5α经历了最小的转吞作用，如第三图所示。请点击此处查看此图的大图。
定量的转吞作用如图 2所示。在本例中，实验使用三个插入物进行，每个插入物感染两种不同的新生儿侵袭 性大肠杆菌 分离株。还测试了一种非致病菌株DH5α进行比较。还包括两个无菌对照插入物（由于没有分离细菌，因此未显示绘图）。该程序的数据可用于描述单个 大肠杆菌 菌株转吞肠上皮的能力。这些数据还可以比较不同菌株的转吞能力（有关进一步的应用，请参阅讨论部分）。
图3：感染前和感染后6小时的TEER。插入物的TEER通常在感染新生儿大肠杆菌产菌株后增加2。与未感染的对照插入片段相比，受感染的插入物显示 TEER 增加得更大。通过t检验计算，在感染新生儿大肠杆菌菌株#1（*p < 0.01）和大肠杆菌菌株#2（**p < 0.03）6小时后，T84单层的TEER显着更高。未感染对照T84单层中的TEER也有所增加，但感染前和感染后值之间的差异无统计学意义。请点击此处查看此图的大图。
图3 显示了两种具有不同转胞作用肠上皮细胞能力的新生儿大 肠杆菌 临床分离株感染前后的典型TEER结果。如图 2所示，转吞的速率和量因菌株而异，但在感染两种致病菌株后，TEER显着增加。
在本实验中，如果存在污染，结果可能会改变。使用的新生儿 大肠杆菌 菌株没有对上皮单层造成足够的损伤以产生TEER的降低，但细菌能够转胞。如果存在污染生物，可能会对肠道细胞造成损害并随后降低TEER。无菌控制插入物有助于识别这种可能的污染。此过程中使用的组织培养基含有酚红pH指示剂。一般来说，当培养基不育或感染小接种物时，培养基会呈现透明的粉红色。随着显著生长或污染，培养基可能会变浑浊、发黄或恶臭。在感染之前，所有T84插入物中的培养基通常呈透明粉红色。
孵育过夜后，检查污染的最后一个地方是在LB琼脂平板上。对照板不应显示任何生长。由大肠杆菌感染插入物的收集孔制成的板应包含均匀的圆形黄色大肠杆菌菌落。为了尽量减少污染的风险，所有工作都应在生物安全柜中进行。应使用单独的柜子和培养箱进行无菌组织培养、大肠杆菌感染的组织培养和细菌操作。工作空间应保持清洁，并应始终使用无菌技术。
图 4：跨孔系统和相关肠细胞结构的示意图。 （A） 透孔插入物的剖面图（蓝色）;嵌件底部的垂直线表示可渗透的孔隙。极化的肠上皮细胞在插入物的底部形成单层。组织培养基以粉红色显示，其中浸入双叉EVOM探针。另一侧的探针线连接到EVOM设备（未显示）。（B）肠上皮细胞紧密连接成分的简化图。垂直箭头表示细菌从极化肠上皮单层的顶端到基底外侧的可能途径。缩写：ZO = 带状闭塞蛋白;JAM = 连接粘附分子。请点击此处查看此图的大图。
补充图1：新生儿 大肠杆菌 分离株的顶端生长随时间变化。 在Transwell插入物中覆盖T84细胞的上清液中的 大肠杆菌 测量可以作为可选的附加终点进行。该图表明，两种进行转吞作用测试的致病性大肠杆菌 菌株的顶端生长随时间推移没有显着差异。误差线表示标准偏差。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
该方法源自胃肠病学和传染病中使用的技术20。肠上皮屏障的体外模型已被用于阐明管腔内容物与先天免疫的这一相关成分相互作用的机制6，8。侵袭性新生儿大肠杆菌的宿主-病原体相互作用也通过遗传分析、抗菌素耐药性和免疫技术进行了单独表征1，5，16，21。然而，关于支持大肠杆菌新生儿分离株通过肠道进入血液的能力的分子机制知之甚少3.
本文演示的转吞技术允许对肠内获得后产生败血症的新生儿 大肠杆菌 侵袭性菌株进行更详细的表征。新生儿菌血症是一个多步骤的过程，转吞作用是相关步骤之一。与侵袭模型相比，这种转吞方法提供了有关菌血症发病机制的额外信息。在某些情况下，致病性 大肠杆菌 侵入小肠而不到达血液，将感染限制为引起局部疾病22。因此，细菌简单地侵入肠上皮的能力可能无法反映它们完全通过上皮屏障的能力。该模型可用于研究细菌通过跨细胞或细胞旁途径穿过肠上皮的过程，特别是如果结合电子显微镜等其他技术20。与 体内 动物模型相比，这种 体外 模型更有效，并且可以更好地控制几个潜在的变量。此外，它通过提供 体内 实验的替代方案来促进动物福利。
尽管有这些优点，但这个实验仍然有其局限性。首先，该测定不考虑孵育期间上皮顶端细菌生长的差异。这种生长差异可能会影响每种菌株的转吞量。用户可以选择测量顶端生长，以便更全面地表征使用此模型获得的结果。本手稿中介绍的方法中用于转吞实验的两种大肠杆菌分离株的顶端生长示例显示在补充图1中。此外，尽管该模型合理地重建了肠上皮单层，但它并不能完全代表保护血液免受摄入病原体侵害的肠道屏障的所有组成部分。然而，肠上皮的一些特性可以用这个模型来研究。例如，T84细胞分泌氯化物并产生粘蛋白23。产生腹泻的大肠杆菌的侵袭与T84细胞中氯化物分泌增加有关，并且在感染后6小时后TEER显着降低24。在该模型中，产生菌血症的大肠杆菌菌株的侵袭也可能增加氯化物的分泌，并且在感染6小时后可能发生TEER的减少。如果其他研究人员需要，该模型可以适用于离子传输与细菌入侵之间关系的研究。粘蛋白是保护上皮细胞免受病原体侵害的物理屏障。感染其他大肠杆菌菌株会降低 T84 细胞的粘蛋白表达25。粘蛋白在新生儿大肠杆菌跨肠上皮转胞的发病机制中的作用也可以用该模型进行研究。该模型的另一个用途可能是研究细菌环调节因子的细胞毒性作用及其在新生儿大肠杆菌菌株转吞过程中的可能作用。例如，由一些致病性大肠杆菌菌株产生的细胞毒性坏死因子-1（CNF-1）靶向Rho GTP酶，Rho GTP酶在调节受感染真核细胞的紧密连接功能和凋亡中至关重要26。该Transwell模型可以适应以更好地了解这些细胞毒素影响肠上皮的机制27。当利用该模型研究新生儿大肠杆菌菌株与肠上皮的相互作用时，重要的是要考虑到用于模拟肠上皮的T84细胞来自成人结肠腺癌的肺转移6。虽然对T84细胞的研究已经重现了对肠道通透性的特定影响，这些影响在人类新生儿和新生动物肠道细胞中转化为类似的效果28，29，但在侵袭性大肠杆菌存在的情况下，胎儿和新生儿肠上皮的行为可能不同。
可能需要进行一些故障排除才能优化此模型及其提供的数据质量。无菌对照插入物的使用在代表性结果部分详细讨论。其他非侵袭性 大肠杆菌 菌株也可作为阴性/最小转细胞病对照。此外，不同的细胞系，如Caco-2，可用于评估新生儿 大肠杆菌 菌株转胞化极化肠上皮的能力。与Caco-2细胞相比，T84细胞对 大肠杆菌 的侵袭和转吞作用更大30。因此，当使用该模型评估细菌与这些细胞和其他极化并形成紧密连接的上皮细胞的转胞作用时，需要考虑这些差异。对每个插入孔进行TEER测量需要几秒钟，并且在测试多个菌株时，需要考虑额外的操作员时间。在Transwell系统中监测TEER的更有效方法正在继续开发。这些较新的设备允许在多个Transwell插入物中同时监测TEER，并实时监测31。考虑这些选项的研究人员需要确定，与本文所述的单电极测量相比，节省的时间是否可以抵消这些新设备价格上涨。
尽管存在一些可能的挑战，但该测定使研究人员能够研究涉及 大肠杆菌 菌血症发病机制的特定机制，而不仅仅是转吞量。当与分子微生物学技术相结合时，该过程可用于确定单个基因对 大肠杆菌 转胞肠上皮的能力的影响，正如在动物模型中尝试的那样32。该模型还可以通过免疫细胞共培养或添加细胞因子、生长因子和药物干预来修改，以模拟更复杂的免疫和药效学反应33.
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
这项工作得到了密苏里大学堪萨斯城医学院向人工智能发放的莎拉·莫里森学生补助金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
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