Summary
एस्चेरिचिया कोलाई नवजात शिशुओं में सेप्सिस का कारण बनता है जो जन्म के समय बैक्टीरिया को निगलते हैं। ई कोलाई की आंत्र पथ से रक्तप्रवाह तक यात्रा करने की क्षमता में शामिल प्रक्रिया को खराब तरीके से समझा जाता है। यह इन विट्रो मॉडल आंतों के उपकला कोशिकाओं के माध्यम से यात्रा करने के लिए ई कोलाई उपभेदों की क्षमता का आकलन करता है।
Abstract
नवजात शिशु मातृ ई कोलाई उपभेदों को निगलते हैं जो प्रसव के समय के आसपास अपने आंत्र पथ को उपनिवेशित करते हैं। आंत में स्थानांतरित करने की क्षमता वाले ई कोलाई उपभेद नवजात शिशु के रक्तप्रवाह पर आक्रमण करते हैं, जिससे जीवन के लिए खतरा पैदा होता है। यहां प्रस्तुत पद्धति इन विट्रो में नवजात ई कोलाई बैक्टेरेमिया आइसोलेट्स के ट्रांसकाइटोसिस का आकलन करने के लिए अर्धपारगम्य आवेषण पर विकसित ध्रुवीकृत आंतों के उपकला कोशिकाओं का उपयोग करती है। यह विधि स्थापित टी 84 आंतों की सेल लाइन का उपयोग करती है जिसमें संगम करने और तंग जंक्शनों और डेस्मोसोम बनाने की क्षमता होती है। संगम तक पहुंचने के बाद, परिपक्व टी 84 मोनोलेयर ट्रांसएपिथेलियल प्रतिरोध (टीईईआर) विकसित करते हैं, जिसे वोल्टमीटर का उपयोग करके परिमाणित किया जा सकता है। टीईईआर मान आंतों के मोनोलेयर में बैक्टीरिया सहित बाह्य घटकों की पैरासेलुलर पारगम्यता के साथ विपरीत रूप से सहसंबद्ध हैं। दूसरी ओर, बैक्टीरिया (ट्रांससाइटोसिस) का ट्रांससेलुलर मार्ग, आवश्यक रूप से टीईआर माप को नहीं बदलता है। इस मॉडल में, आंतों के मोनोलेयर में जीवाणु मार्ग को संक्रमण के बाद 6 घंटे तक निर्धारित किया जाता है, और पैरासेलुलर पारगम्यता की निगरानी के लिए टीईईआर के बार-बार माप किए जाते हैं। इसके अलावा, यह विधि ध्रुवीकृत उपकला में बैक्टीरियल ट्रांसकाइटोसिस के दौरान तंग जंक्शनों और अन्य सेल-टू-सेल आसंजन प्रोटीन में संरचनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग जैसी तकनीकों के उपयोग की सुविधा प्रदान करती है। इस मॉडल का उपयोग उन तंत्रों के लक्षण वर्णन में योगदान देता है जिनके द्वारा आंतों के उपकला में नवजात ई कोलाई ट्रांससाइटोज बैक्टीरिया का उत्पादन करता है।
Introduction
एस्चेरिचिया कोलाई नवजात शिशुओं में प्रारंभिक सेप्सिस का सबसे आम कारणहै 1,2,3. नवजात ई कोलाई बैक्टेरेमिया की मृत्यु दर 40% तक पहुंच सकती है, और मेनिन्जाइटिस एक संभावित जटिलता है जो गंभीर न्यूरोडेवलपमेंटल विकलांगतासे जुड़ी है। नवजात शिशु द्वारा मातृ ई कोलाई उपभेदों का अंतर्ग्रहण नवजात बैक्टेरेमिया का उत्पादन कर सकता है; इस प्रक्रिया को पशु मॉडल 2,4 में दोहराया गया है। एक बार निगलने के बाद, रोगजनक बैक्टीरिया आंतों की बाधा के पार नवजात आंत लुमेन से यात्रा करते हैं और रक्तप्रवाह में प्रवेश करते हैं, जिससे सेप्टिसीमिया होता है। नवजात आक्रामक ई कोलाई उपभेद जो बैक्टेरेमिया का उत्पादन करते हैं, आंतों के उपकला कोशिकाओं पर आक्रमण करने की उनकी क्षमता में भिन्न होते हैं। हालांकि, आक्रमण के बाद आंतों के उपकला को ट्रांससाइटोस करने की उनकी क्षमता पूरी तरह से विशेषता नहीं है।
यह आंतों के ट्रांसकाइटोसिस मॉडल आंतों के उपकला में जीवाणु मार्ग का अनुकरण करने के लिए एक उपयोगी इन विट्रो विधि है। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधियों का समग्र लक्ष्य आंतों के उपकला को ट्रांससाइटोज करने के लिए नवजात ई कोलाई आइसोलेट्स की क्षमता की तुलना करना है। यहां वर्णित मॉडल टी 84 कोशिकाओं का उपयोग करता है, जो अमर मानव आंतों के एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाएं 6,7 हैं। टी 84 कोशिकाओं को दो अलग-अलग डिब्बों के साथ एक अर्धपारगम्य झिल्ली पर संगम के लिए उगाया जाता है। इस तकनीक का उपयोग करने का तर्क यह है कि, जैसा कि विवो में होता है, ये आंतों की कोशिकाएं ध्रुवीकृत होती हैं और परिपक्व तंग जंक्शन 6,8 विकसित करती हैं। झिल्ली के संपर्क में आने वाला पक्ष बेसल पक्ष बन जाता है। कोशिकाओं का विपरीत पक्ष एपिकल पक्ष बन जाता है, आंतों के लुमेन जैसा दिखता है जहां रोगजनकों का पालन होता है और आक्रमण होता है। ट्रांसवेल झिल्ली बैक्टीरिया के लिए पारगम्य है, लेकिन ध्रुवीकृत आंतों की कोशिकाएं तंग जंक्शन बनाती हैं, जो बैक्टीरिया पैरासेलुलर आंदोलनको खराब करती हैं। इस प्रकार, यह विधि ट्रांससेलुलर मार्ग सहित बैक्टीरियल ट्रांसकाइटोसिस की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए मानव सेल लाइन का उपयोग करके एक नियंत्रित इन विट्रो वातावरण का लाभ प्रदान करती है। जबकि आंतों के उपकला में बैक्टीरिया के ट्रांसकाइटोसिस की जांच करने के लिए अन्य तरीके मौजूद हैं, यहां प्रस्तुत ट्रांसवेल विधि अधिक आसानी और पहुंच प्रदान करती है। वैकल्पिक तकनीकें, जैसे कि उसिंग चैंबर सिस्टम में स्थापित पूर्व विवो नमूनों का उपयोग करना, उपलब्ध हैं। हालांकि, वे ऊतक नमूनों का उपयोग करते हैं जो आसानी से सुलभ नहीं हो सकते हैं, खासकर अगर शोध मानव शरीर विज्ञान10 का अध्ययन करने का इरादा रखता है। आंतों के ऑर्गेनोइड मेजबान-बैक्टीरियाइंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो विकल्प का एक और उदाहरण प्रस्तुत करते हैं। जबकि बैक्टीरियल ट्रांसकाइटोसिस का अध्ययन करने के लिए ट्रांसवेल सिस्टम में ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर का भी उपयोग किया जा सकता है, उन्हें स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और विकास और भेदभाव को प्रेरित करने के लिए विशिष्ट विकास कारकों के उपयोग की आवश्यकता होतीहै। इस प्रकार, उनका उपयोग अधिक समय लेने वाला है और इस पांडुलिपि में वर्णित ट्रांसवेल विधि की तुलना में अधिक लागत से जुड़ा हुआ है।
इस इन विट्रो ट्रांसवेल सिस्टम का उपयोग करके आंतों के उपकला में जीवाणु मार्ग का मूल्यांकन विभिन्न रोगजनकों के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इन अध्ययनों ने ध्रुवीकृत आंतों के उपकला13,14,15 में बैक्टीरिया के ट्रांसकाइटोसिस को चिह्नित करने के लिए टी 84 कोशिकाओं का उपयोग करके ट्रांसवेल सिस्टम की उपयोगिता को दिखाया है। हालांकि, बैक्टेरेमिया-उत्पादक नवजात ई कोलाई उपभेदों की ट्रांससाइटोसिस क्षमता की तुलना करने के लिए इस ट्रांसवेल विधि के आवेदन को विस्तार से वर्णित नहीं किया गया है। यह पांडुलिपि अन्य शोधकर्ताओं को एक मानक ट्रांसवेल प्रोटोकॉल प्रदान करती है जो विश्वसनीय और उपयोग करने में आसान है और इसके लिए संसाधनों की आवश्यकता नहीं होती है जो बहुत महंगे हैं।
आंतों के उपकला को ट्रांससाइटोस करने के लिए नवजात आक्रामक ई कोलाई उपभेदों की क्षमता की तुलना करने के लिए, आंतों के उपकला मोनोलेयर के एपिकल पक्ष को बैक्टीरिया कोशिकाओं की एक ज्ञात संख्या से संक्रमित किया जा सकता है। इनक्यूबेशन के बाद, उपकला के बेसल पक्ष पर माध्यम एकत्र किया जा सकता है और समय के साथ बैक्टीरियल ट्रांसकाइटोसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। इस पांडुलिपि में, प्रस्तुत विधियों का उपयोग बैक्टेरेमिया के साथ अस्पताल में भर्ती नवजात शिशुओं से बरामद नवजात ई कोलाई नैदानिक उपभेदों की ट्रांसकाइटोसिस क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। ट्रांसकाइटोसिस अध्ययनों के लिए इन नवजात नैदानिक आइसोलेट्स के चयन के लिए समावेश मानदंड पहले 1,2,16 प्रकाशित किए गए हैं। जब इस विधि को विभिन्न ई कोलाई उपभेदों का उपयोग करके किया जाता है, तो उनकी ट्रांससाइटोसिस क्षमताओं की तुलना की जा सकती है। इस प्रक्रिया के माध्यम से, आंतों के ट्रांसकाइटोसिस मॉडल ई कोलाई के विषाणु कारकों को चिह्नित करने के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान करता है जो मल्टीस्टेप प्रक्रिया में योगदान करते हैं जो नवजात बैक्टेरेमिया के विकास में समाप्त होता है।
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Protocol
नोट: संदूषण से बचने के लिए बायोसेफ्टी लेवल 2 (बीएसएल -2) सुरक्षा कैबिनेट में टी 84 कोशिकाओं, बैक्टीरिया, प्लेटों और अभिकर्मकों के सभी जोड़तोड़ करें। बाँझ टी 84 कोशिकाओं, संक्रमित टी 84 कोशिकाओं और ई कोलाई से जुड़े सभी कार्यों के लिए अलग-अलग क्षेत्रों और इनक्यूबेटरों का उपयोग करें। यहां वर्णित विधियों के साथ परीक्षण किए गए नैदानिक ई कोलाई आइसोलेट्स हमारे संस्थान1,16 में संस्थागत समीक्षा बोर्ड के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए प्राप्त किए गए थे।
1. टी 84 कोशिकाओं के साथ ट्रांसकाइटोसिस इंसर्ट तैयार करना (प्रयोग से लगभग 1-2 सप्ताह पहले)
- ऊतक संवर्धन माध्यम (टीसीएम + एंटीबायोटिक्स) में अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (एटीसीसी) टी 84 कोशिकाओं को उगाएं, जिसमें डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम: हैम का एफ -12 पोषक मिश्रण (1: 1, अंतिम एकाग्रता: 50% प्रत्येक), 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, और 1% (100 यू / एमएल) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन दोहरी एंटीबायोटिक मिश्रण शामिल है। कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
स्ट्रेप्टोमाइसिन (टीसीएम डब्ल्यू / ओ एंटीबायोटिक्स) के बिना इस मध्यम फॉर्मूलेशन की भिन्नता का उपयोग प्रक्रिया में बाद के चरणों (खंड 2 और आगे) के लिए किया जाता है। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक चरण के लिए सही सूत्रीकरण का उपयोग किया जाता है। - बायोसेफ्टी कैबिनेट (बीएससी) के अंदर काम करते हुए, टी 84 कोशिकाओं को पॉलीथीन टेरेफ्थेलेट झिल्ली कोशिका संस्कृति ट्रांसवेल में बीज दिया जाता है, जिसमें 24-वेल प्लेटों के लिए बनाए गए 3 μm छिद्र होते हैं। संभावित संदूषण की निगरानी के लिए प्रत्येक वांछित प्रयोगात्मक स्थिति और असंक्रमित नियंत्रणों के लिए ट्रांसवेल सम्मिलित प्रतिकृति शामिल करें।
- ट्रांसवेल इंसर्ट रखने के लिए डिज़ाइन की गई 24-वेल प्लेट में, टीसीएम + एंटीबायोटिक दवाओं के 1 एमएल के साथ एकत्र करने वाले कुओं की वांछित संख्या भरें।
- प्रत्येक कुएं में, एक ट्रांसवेल डालें।
- इन प्रविष्टियों को 1 x 105 T84 कोशिकाओं के साथ बीज दें जो TCM + एंटीबायोटिक दवाओं के 500 μL में निलंबित हैं। ट्रिपैन ब्लू स्टेन या स्वचालित सेल काउंटर17 के साथ हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें।
- बीज युक्त ट्रांसवेल प्लेटों को उन्हीं परिस्थितियों में इनक्यूबेट करें जिनमें कोशिकाएं उगाई गई थीं।
- प्रकाश माइक्रोस्कोपी से सत्यापित करें कि बीज बोने के लगभग 48 घंटे बाद, डालने के बाद मोनोलेयर कंफ्लुएंट बनना शुरू हो गए हैं।
- मोनोलेयर की परिपक्वता का आकलन करने के लिए उपकला वोल्ट / ओम मीटर (ईवीओएम) का उपयोग करके हर 2 दिन में, ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) को मापें और रिकॉर्ड करें। एक बार जब इंसर्ट कम से कम 1,000 Ω सेमी 2 के टीईआर तक पहुंचजाते हैं, तो उन्हें परख18 के लिए तैयार माना जाता है।
नोट: आमतौर पर बीज बोने के बाद इस टीईईआर तक पहुंचने में 7-10 दिन लगते हैं। इस प्रतिरोध तक पहुंचने के बाद टी 84 कोशिकाएं प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत 100% संगम दिखाएंगी।- उपयोग में नहीं होने पर 0.15 एमकेसीएल में डूबे इलेक्ट्रोड के साथ ईवीओएम जांच को स्टोर करें।
- टीईईआर को मापने से पहले, इलेक्ट्रोड जांच को 10-15 मिनट के लिए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 70% इथेनॉल के 5 एमएल में डुबोकर विघटित करें। जांच को हटा दें, अतिरिक्त इथेनॉल को हटा दें, और इसे 10 मिनट के लिए बीएससी के अंदर हवा में सूखने दें। इथेनॉल की ट्यूब को बनाए रखें।
- ईवीओएम का परीक्षण करें और सूखी परिशोधन जांच को एक बाँझ कुएं में रखकर जांच करें जिसमें टीसीएम + एंटीबायोटिक्स के 1 एमएल टीसीएम + एंटीबायोटिक्स होते हैं, जिसमें 500 μL TCM + एंटीबायोटिक्स होते हैं। सुनिश्चित करें कि EVOM रीडिंग <200 Ω है। चरण 1.3.6 में वर्णित बाद की प्रतिरोध गणना में इसका उपयोग करने के लिए इस रिक्त मान को रिकॉर्ड करें।
- टीसीएम + एंटीबायोटिक दवाओं की ट्यूब से जांच को हटा दें। पूरे प्रयोग में जांच के भंडारण के लिए इस ट्यूब को बनाए रखें।
- धीरे से जांच को इकट्ठा करने वाले कुएं में लंबे इलेक्ट्रोड और इंसर्ट के अंदर छोटे इलेक्ट्रोड के साथ पहले इंसर्ट में कम करें। लंबे इलेक्ट्रोड को इकट्ठा करने के तल को अच्छी तरह से छूने की अनुमति दें, लेकिन नीचे धक्का न दें क्योंकि यह उपकला मोनोलेयर को बाधित कर सकता है।
- प्रत्येक सम्मिलित के लिए ओम्स (Ω) में प्रतिरोध को मापने और रिकॉर्ड करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। समाप्त होने पर, इथेनॉल में जांच को 10-15 मिनट के लिए डुबोकर विघटित करें। फिर, परिशोधन जांच को भंडारण के लिए केसीएल समाधान में वापस ले जाएं। चरण 1.3.3 में प्राप्त रिक्त प्रतिरोध को T84 कोशिकाओं वाले प्रत्येक सम्मिलित से प्राप्त प्रत्येक मान से घटाएं। अंतिम टीईआर माप (Ω सेमी 2) प्राप्त करने के लिए प्रत्येक सम्मिलित के तल (सेमी2) के क्षेत्र से प्रत्येक सम्मिलित के लिए परिणामी प्रतिरोध (Ω) को गुणा करें।
- एक बार जब टीईआर कम से कम 1,000 Ω सेमी2 तक पहुंच जाता है, तो उपकला मोनोलेयर परिपक्व होता है और संक्रमण के लिए तैयार होता है।
- जैसे ही टीईआर परिपक्व होता है, कोशिकाओं को हर 1-2 दिनों में ताजा माध्यम प्रदान करें।
- एक नई 24-वेल प्लेट में, तैयार किए जा रहे प्रत्येक बीज वाले सम्मिलित के लिए एक कुएं में 1 एमएल टीसीएम + एंटीबायोटिक्स जोड़ें।
- बाँझ बल का उपयोग करके, नए भरे गए कुओं में इंसर्ट को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
- सम्मिलित में मीडिया को प्रतिस्थापित करें।
- प्लेट को झुकाकर और इन-हाउस वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके पुराने मीडिया को इंसर्ट से हटा दें ताकि इंसर्ट के किनारे पिपेट टिप के साथ मीडिया को धीरे से हटाया जा सके। एस्पिरेटर कोशिकाओं के विघटन को रोकने के लिए निम्न-स्तरीय सक्शन के विनियमन की अनुमति देता है। पिपेट टिप को इंसर्ट के निचले हिस्से को छूने की अनुमति न दें, क्योंकि यह विकासशील उपकला मोनोलेयर को बाधित करेगा।
- इंसर्ट में टीसीएम + एंटीबायोटिक्स के 500 μL जोड़ें। यह सत्यापित करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ मोनोलेयर की कल्पना करें कि यह बरकरार है।
- हर 1-2 दिनों में, चरण 1.3.2-1.3.6 में ऊपर वर्णित प्रत्येक सम्मिलित में टीईआर को मापें।
2. टीसीएम डब्ल्यू / ओ एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करके प्रयोग से 1 दिन पहले टी 84 कोशिकाओं को तैयार करना
- प्रयोग से एक दिन पहले टीईईआर को मापें और रिकॉर्ड करें।
- टीसीएम को उसी तरह से बदलें जैसे पूर्व सेल तैयारी और रखरखाव के दौरान। हालांकि, संक्रमण की तैयारी में टीसीएम डब्ल्यू / ओ एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग किया जाता है (प्लेट में अच्छी तरह से 1 एमएल और इंसर्ट में 500 μL)।
3. ई कोलाई संस्कृतियां (प्रयोग से 1 दिन पहले शुरू हुईं)
सावधानी: रोगजनक नैदानिक ई कोलाई उपभेदों के साथ काम करते समय जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) सावधानियों का उपयोग करें।
- बाँझ लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) के 5 एमएल के साथ एक लेबल 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब लें, और एक जीवाणु तनाव (ई कोलाई) से एक कॉलोनी के साथ शोरबा को टीका लगाने के लिए एक बाँझ लूप का उपयोग करें। इस प्रक्रिया को दोहराएं, प्रत्येक तनाव का परीक्षण करने के लिए एक रात भर की संस्कृति ट्यूब बनाएं।
- एक इनक्यूबेटर शेकर (250 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस) में ट्यूबों की टोपियों को ढीला करके रात भर की संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
4. ई कोलाई इनोकुलम, उपकला कोशिकाओं और सामग्रियों को तैयार करना (प्रयोग की सुबह)
नोट: इस बिंदु से 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म एंटीबायोटिक दवाओं के साथ टीसीएम का उपयोग करें।
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब (प्रति व्यक्तिगत तनाव एक) में 25 एमएल टीसीएम डब्ल्यू / ओ एंटीबायोटिक दवाओं के 25 एमएल में प्रत्येक रात एलबी संस्कृति से 250 μL जोड़ें। ट्यूबों की टोपियों को ढीला रखें। इन नई संस्कृति ट्यूबों को शेकर में एक ही सेटिंग्स (250 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस) पर ठीक 2 घंटे के लिए रखें। प्रतीक्षा करते समय शेष उप-चरणों का प्रदर्शन करें।
- चरण 1.3.2-1.3.6 में वर्णित प्रत्येक सम्मिलित में TEER को मापें। इन्हें समय (t) = 0 h पर TEERs के रूप में रिकॉर्ड करें।
- सम्मिलित को एक नई प्लेट में कुओं में ले जाएं, और चरण 1.4.3 में वर्णित तकनीक का उपयोग करके मीडिया को बदलें। हालांकि, इस बार, नए एकत्र कुओं को एंटीबायोटिक दवाओं के 500 μL TCM के साथ भरें, और एंटीबायोटिक दवाओं के 400 μL TCM के साथ इंसर्ट भरें। संक्रमण के समय तक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर के अंदर इंसर्ट रखें।
- बाद में चढ़ाना और जीवाणु परिमाणीकरण के लिए कमरे के तापमान (आरटी) को गर्म करने के लिए पर्याप्त संख्या में वर्ग एलबी एगर प्लेटों को सेट करें।
5. कोशिकाओं का टीकाकरण (प्रयोग की शुरुआत)
- ठीक 2 घंटे के बाद, शेकर से सुबह के जीवाणु संस्कृतियों को हटा दें, और उन्हें 10 मिनट (1,900 x g, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
नोट: निम्नलिखित सभी चरणों के लिए, विकास को कम करने के लिए बर्फ पर सभी जीवाणु निलंबन रखें। - एंटीबायोटिक दवाओं के साथ टीसीएम में बैक्टीरिया पेलेट को फिर से निलंबित करें। ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को 0.7-0.9 में समायोजित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें, और टीसीएम डब्ल्यू / ओ एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 1 x 106 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) / एमएल (लगभग 1: 100 कमजोर पड़ने) की एकाग्रता में पतला करें। प्रत्येक सम्मिलित को 1 x 105 सीएफयू प्रति 100 μL मात्रा के साथ संक्रमित करने के लिए इस जीवाणु निलंबन का उपयोग करें।
- ट्रांसवेल प्लेट को लेबल करें, और प्रत्येक सम्मिलित को ओडी-समायोजित इनोकुलम के 100 μL (प्रति सम्मिलित कुल 1 x 105 CFU) के साथ संक्रमित करें। परख अब शुरू हो गई है। समय नोट करें, और इसे t = 0 h के रूप में रिकॉर्ड करें।
- ट्रैक तनुकरण विधि का उपयोग करके सीएफयू / एमएल की मात्रा निर्धारित करने के लिए इनोकुलम बैक्टीरियल सस्पेंशन को प्लेट करें, स्क्वायर एलबी एगर प्लेटों19 पर 10 μL एलिकोट चढ़ाएं।
6. ट्रांसकाइटोसिस की मात्रा
- टीकाकरण के बाद हर 30 मिनट में, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 500 μL TCM के साथ नए कुओं को भरें। प्रत्येक अलग-अलग जीवाणु तनाव के लिए बाँझ बल के एक अलग सेट का उपयोग करके इन नए कुओं में इंसर्ट को स्थानांतरित करें।
- अलग-अलग लेबल ट्यूबों में प्रत्येक सम्मिलित करने के लिए उपयोग किए गए संग्रह से मीडिया को अच्छी तरह से इकट्ठा करें। इन ट्यूबों को बर्फ पर रखें। ट्रांसवेल प्लेटों को समय बिंदुओं के बीच इनक्यूबेटर में वापस करें।
- प्रत्येक सम्मिलित के लिए, एकत्रित मीडिया को t = 0.5 h, t = 1 h, t = 1.5 h, और t = 2 h, और भंवर से संक्षेप में संयोजित करें। प्रयोग के पहले 2 घंटे में ट्रांससाइटोसेड बैक्टीरिया की मात्रा को निर्धारित करने के लिए ट्रैक कमजोर पड़ने की विधि का उपयोग करके एलबी एगर प्लेटों पर एकत्रित मीडिया को प्लेट करें।
नोट: हर 30 मिनट में बैक्टीरिया को पुनः प्राप्त करना और उन्हें बर्फ पर रखना यह सुनिश्चित करता है कि एकत्र कुओं में बैक्टीरिया की वृद्धि कम से कम हो और माप मुख्य रूप से ट्रांससाइटोस्ड बैक्टीरिया पर किया जाता है। - बैक्टीरियल इनक्यूबेटर में लेबल किए गए ट्रैक डाइल्यूशन एलबी एगर प्लेटों को पूरक सीओ2 के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और टी 84 ट्रांसवेल प्लेट को टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें।
- t = 4 h पर, t = 2.5 h, t = 3 h, t = 3 h, और t = 4 h से एकत्रित मीडिया को जोड़कर चरण 6.3 दोहराएँ।
- t = 6 h पर, t = 4.5 h, t = 5 h, t = 5 h, और t = 6 h से एकत्रित मीडिया को जोड़कर चरण 6.3 दोहराएँ। इसके अतिरिक्त, टी = 6 एच पर, नियंत्रण कुओं से मीडिया को प्लेट करें।
7. प्रयोग का अंत
- प्रयोग के अंत में टीईआर को मापें और रिकॉर्ड करें, टी = 6 एच। चरण 1.3.2-1.3.6 में वर्णित कार्यविधि का उपयोग करें।
- 10-15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में डुबोकर जांच को दूषित करें। सम्मिलित ों को त्याग दें, या यदि वांछित हो, तो उन्हें अतिरिक्त अनुप्रयोगों के लिए सहेजें / संसाधित करें। एलबी आगर प्लेटों को रात भर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें, और अन्य सभी उपयोग की जाने वाली सामग्रियों को कीटाणुरहित और / या सुरक्षित रूप से निपटान करें।
- रात भर इनक्यूबेशन के बाद, इनोकुलम राशि और ई कोलाई ट्रांसकाइटोसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए ट्रैक कमजोर पड़ने एलबी प्लेटों पर मैन्युअल रूप से बैक्टीरिया कालोनियों की गणना करें। सुनिश्चित करें कि नियंत्रण प्लेटें कोई जीवाणु वृद्धि नहीं दिखाती हैं।
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Representative Results
चित्रा 1: समय के साथ टी 84 टीईआर। जैसे-जैसे टी 84 सेल परत सम्मिलित होने पर परिपक्व होती है, मोनोलेयर का विद्युत प्रतिरोध बढ़ जाता है। कम से कम 1,000 Ω सेमी 2 के टीईआर पर, सेल परत पैरासेल्युलरबैक्टीरियल ट्रांसपोर्ट को कम करने और मुख्य रूप से ट्रांससेलुलर बैक्टीरियल ट्रांजिट के माप की अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से विकसित होती है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
खंड 1 में वर्णित बाँझ टी 84 कोशिकाओं के प्रसार के दौरान, टी 84 मोनोलेयर में टीईईआर समय के साथ लगातार बढ़ते हैं, जो बीज बोने से लगभग 7 दिनों के बाद 1,000 Ω सेमी2 को पार कर जाते हैं ( चित्रा 1 देखें)। यद्यपि उपकला कोशिका ध्रुवीकरण और टीईईआर की परिपक्वता अन्य आंतों की कोशिकाओं, जैसे कि कैको -2 की तुलना में टी 84 कोशिकाओं के साथ अधिक मजबूत हैं, फिर भी कुछ समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकतीहै। एक सम्मिलित के टीईआर को माप के बीच नाटकीय रूप से कम नहीं होना चाहिए। टीईईआर में इस तरह की गिरावट उपकला मोनोलेयर के यांत्रिक व्यवधान का संकेत दे सकती है। किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि मध्यम परिवर्तन के दौरान, एस्पिरेटर की नोक कभी भी सेल कल्चर के निचले हिस्से को नहीं छूती है। यदि इस प्रकार के नुकसान का संदेह है, तो इसे प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा आकांक्षा के स्थान के पास उपकला कोशिकाओं की अनुपस्थिति के रूप में देखा जा सकता है। हैंडलिंग से नुकसान के अलावा, टीईआर में कमी संदूषण का संकेत दे सकती है।
चित्रा 2: नवजात ई कोलाई का ट्रांससाइटोसिस समय के साथ अलग हो जाता है। टी 84 इंसर्ट को संक्रमित करने के बाद, नवजात ई कोलाई नैदानिक आइसोलेट्स जो सफलतापूर्वक एकत्र करने वाले कुएं तक पहुंचते हैं, उन्हें ट्रैक कमजोर पड़ने की विधि का उपयोग करके परिमाणित किया जाता है। विभिन्न ई कोलाई उपभेदों की तुलना आंतों के उपकला को ट्रांससाइटोज करने की उनकी क्षमता के संदर्भ में की जा सकती है। नॉनपैथोजेनिक ई कोलाई डीएच 5 अल्फा को एक तुलनित्र के रूप में शामिल किया गया था। प्लॉट प्रत्येक समय बिंदु पर औसत सीएफयू और मानक त्रुटियों को दिखाते हैं। औसत ट्रांसकाइटोसिस मूल्यों की तुलना एक पूंछ वाले टी-परीक्षणों के साथ की गई थी, जिसने नवजात ई कोलाई आइसोलेट्स # 1 बनाम # 2 के बीच 2 घंटे (* पी < 0.05), 4 घंटे (** पी < 0.04), और 6 घंटे (**पी < 0.04) संक्रमण के बाद महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित किया। इसके विपरीत, नॉनपैथोजेनिक ई कोलाई स्ट्रेन डीएच 5 अल्फा में न्यूनतम ट्रांसकाइटोसिस हुआ, जैसा कि तीसरे प्लॉट में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
परिमाणित ट्रांसकाइटोसिस को चित्र 2 में दिखाए गए अनुसार दर्शाया जा सकता है। इस उदाहरण में, प्रयोगों को तीन आवेषणों का उपयोग करके किया गया था, जिनमें से प्रत्येक दो अलग-अलग नवजात इनवेसिव ई कोलाई आइसोलेट्स से संक्रमित था। तुलना के लिए एक नॉनपैथोजेनिक स्ट्रेन, डीएच 5 अल्फा का भी परीक्षण किया गया था। दो बाँझ नियंत्रण सम्मिलित भी शामिल थे (कोई प्लॉट नहीं दिखाया गया है क्योंकि कोई बैक्टीरिया अलग नहीं किया गया था)। इस प्रक्रिया के डेटा आंतों के उपकला को ट्रांससाइटो करने के लिए एकल ई कोलाई तनाव की क्षमता का वर्णन करने के लिए उपयोगी हैं। डेटा विभिन्न उपभेदों की ट्रांसकाइटोसिस क्षमताओं की तुलना के लिए भी अनुमति दे सकता है (आगे के अनुप्रयोगों के लिए चर्चा अनुभाग देखें)।
चित्रा 3: संक्रमण से तुरंत पहले और संक्रमण के 6 घंटे बाद टीईईआर। आवेषण का टीईआर आमतौर पर नवजात ई कोलाई बैक्टेरेमिया-उत्पादक उपभेदोंके संक्रमण के बाद बढ़ जाता है। संक्रमित आवेषण असंक्रमित नियंत्रण सम्मिलित की तुलना में टीईईआर में अधिक वृद्धि दिखाते हैं। टी-परीक्षणों द्वारा गणना के अनुसार, नवजात ई कोलाई स्ट्रेन # 1 (* पी < 0.01) और ई कोलाई स्ट्रेन # 2 (* पी < 0.03) के साथ संक्रमण के 6 घंटे बाद टीईआर टी 84 मोनोलेयर में काफी अधिक था। गैर-संक्रमित नियंत्रण टी 84 मोनोलेयर में टीईआर में भी वृद्धि हुई, लेकिन संक्रमण से पहले और संक्रमण के बाद के मूल्यों के बीच का अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3 दो नवजात ई कोलाई नैदानिक आइसोलेट्स के साथ संक्रमण से पहले और बाद में विशिष्ट टीईईआर परिणामों को दर्शाता है , जिसमें आंतों के उपकला कोशिकाओं को ट्रांससाइटोज करने की विभिन्न क्षमताएं होती हैं। ट्रांसकाइटोसिस की दर और मात्रा उपभेदों के बीच भिन्न होती है, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, लेकिन दोनों रोगजनक उपभेदों के संक्रमण के बाद टीईईआर काफी बढ़ जाता है।
इस प्रयोग में संदूषण की उपस्थिति में परिणामों को बदला जा सकता है। उपयोग किए गए नवजात ई कोलाई उपभेदों ने टीईईआर में कमी पैदा करने के लिए उपकला मोनोलेयर को पर्याप्त नुकसान नहीं पहुंचाया, फिर भी बैक्टीरिया ट्रांससाइटोज करने में सक्षम थे। यह प्रशंसनीय है कि एक दूषित जीव, यदि मौजूद है, तो आंतों की कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है और बाद में टीईआर में कमी हो सकती है। बाँझ नियंत्रण सम्मिलित ऐसे संभावित संदूषण की पहचान करने में मदद करने के लिए काम करते हैं। इस प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले ऊतक संवर्धन माध्यम में फिनोल लाल पीएच संकेतक होता है। सामान्य तौर पर, माध्यम एक स्पष्ट गुलाबी दिखाई देता है जब यह बाँझ होता है या एक छोटे इनोकुलम से संक्रमित होता है। महत्वपूर्ण वृद्धि या संदूषण के साथ, माध्यम मैलापन, पीला या मैलोडोरस हो सकता है। संक्रमण से पहले, सभी टी 84 इंसर्ट में मीडिया आमतौर पर स्पष्ट-गुलाबी दिखाई देता है।
रात भर इनक्यूबेशन के बाद, संदूषण की जांच करने के लिए अंतिम स्थान एलबी आगर प्लेटों पर है। नियंत्रण प्लेटों को कोई वृद्धि नहीं दिखानी चाहिए। ई कोलाई-संक्रमित आवेषण के एकत्र कुओं से बनी प्लेटों में समरूप, गोल, पीले ई कोलाई उपनिवेश होने चाहिए। संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, सभी काम जैव सुरक्षा अलमारियों में किए जाने चाहिए। बाँझ ऊतक संवर्धन, ई कोलाई-संक्रमित ऊतक संवर्धन और जीवाणु हेरफेर के लिए अलग-अलग अलमारियाँ और इनक्यूबेटर का उपयोग किया जाना चाहिए। कार्यक्षेत्र को साफ रखा जाना चाहिए, और एक बाँझ तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए।
चित्र 4: ट्रांसवेल प्रणाली और प्रासंगिक आंतों की कोशिका संरचनाओं का आरेखीय प्रतिनिधित्व। (ए) ट्रांसवेल इंसर्ट (नीला) का अनुभाग दृश्य; सम्मिलित के निचले भाग में ऊर्ध्वाधर रेखाएं पारगम्य छिद्रों को इंगित करती हैं। ध्रुवीकृत आंतों के उपकला कोशिकाएं सम्मिलित के तल पर एक मोनोलेयर बनाती हैं। टिशू कल्चर माध्यम को गुलाबी रंग में दिखाया गया है, जिसमें दो-प्रोंग ईवीओएम जांच डूबी हुई है। विपरीत तरफ जांच तार ईवीओएम उपकरण से जुड़े होते हैं (नहीं दिखाए गए)। (बी) आंतों के उपकला कोशिकाओं के तंग जंक्शन घटकों का सरलीकृत आरेख। ऊर्ध्वाधर तीर ध्रुवीकृत आंतों के उपकला मोनोलेयर के एपिकल से बेसोलेटरल पक्ष तक जीवाणु मार्ग के संभावित मार्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षेप: ZO = zona occludens प्रोटीन; जैम = जंक्शन आसंजन अणु। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्र 1: समय के साथ नवजात ई कोलाई आइसोलेट्स का एपिकल विकास। ट्रांसवेल इंसर्ट के भीतर टी 84 कोशिकाओं के ऊपर तैरने वाले सुपरनैटेंट में ई कोलाई के माप को वैकल्पिक, अतिरिक्त समापन बिंदु के रूप में किया जा सकता है। आंकड़ा दर्शाता है कि ट्रांसकाइटोसिस के लिए परीक्षण किए गए दोनों रोगजनक ई कोलाई उपभेदों की एपिकल वृद्धि समय के साथ काफी भिन्न नहीं थी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यह विधि गैस्ट्रोएंटरोलॉजी और संक्रामक रोग 20 में उपयोग की जाने वालीतकनीकों से ली गई है। आंतों के उपकला अवरोध के इन विट्रो मॉडल का उपयोग उन तंत्रों को स्पष्ट करने के लिए किया गया है जिनके द्वारा ल्यूमिनल सामग्री जन्मजात प्रतिरक्षा 6,8 के इस प्रासंगिक घटक के साथ बातचीत करती है। कोलाई के मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन को आनुवंशिक विश्लेषण, रोगाणुरोधी प्रतिरोध के अध्ययन और प्रतिरक्षाविज्ञानी तकनीक 1,5,16,21 के माध्यम से अलग से चित्रित किया गया है। हालांकि, आंत3 के माध्यम से रक्तप्रवाह में प्रवेश करने के लिए ई कोलाई नवजात आइसोलेट्स की क्षमता को कम करने वाले आणविक तंत्र के बारे में बहुत कम जानकारी है।
यहां प्रदर्शित ट्रांसकाइटोसिस तकनीक नवजात ई कोलाई इनवेसिव उपभेदों के अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन की अनुमति देती है जो एंटरल अधिग्रहण के बाद सेप्टिसीमिया का उत्पादन करते हैं। नवजात बैक्टेरेमिया एक मल्टीस्टेप प्रक्रिया है, और ट्रांसकाइटोसिस प्रासंगिक चरणों में से एक है। आक्रमण मॉडल की तुलना में, यह ट्रांसकाइटोसिस विधि बैक्टेरेमिया के रोगजनन में शामिल तंत्र के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करती है। कुछ मामलों में, रोगजनक ई कोलाई रक्तप्रवाह तक पहुंचने के बिना छोटी आंत पर आक्रमण करता है, संक्रमण को स्थानीयकृत बीमारी22 के कारण सीमित करता है। इस प्रकार, आंतों के उपकला पर आक्रमण करने की बैक्टीरिया की क्षमता उपकला बाधा से पूरी तरह से गुजरने की उनकी क्षमता को प्रतिबिंबित नहीं कर सकती है। इस मॉडल का उपयोग ट्रांससेलुलर या पैरासेलुलर मार्गों के माध्यम से आंतों के उपकला में जीवाणु मार्ग की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, खासकर यदि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जैसी अतिरिक्त तकनीकों को शामिल किया जाताहै। विवो पशु मॉडल की तुलना में , यह इन विट्रो मॉडल अधिक कुशल है और कई संभावित चर के बेहतर नियंत्रण की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह विवो प्रयोग में एक विकल्प प्रदान करके पशु कल्याण में योगदान देता है।
इन फायदों के बावजूद, इस प्रयोग की अभी भी अपनी सीमाएं हैं। एक के लिए, यह परख इनक्यूबेशन के दौरान उपकला के एपिकल पक्ष पर जीवाणु विकास में अंतर के लिए जिम्मेदार नहीं है। इस तरह के विकास अंतर प्रत्येक तनाव के लिए ट्रांसकाइटोसिस की मात्रा को प्रभावित कर सकते हैं। उपयोगकर्ता इस मॉडल के साथ प्राप्त परिणामों के अधिक व्यापक लक्षण वर्णन के लिए एपिकल विकास को मापने का विकल्प चुन सकते हैं। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधियों में ट्रांसकाइटोसिस प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले दो ई कोलाई आइसोलेट्स के एपिकल विकास का एक उदाहरण पूरक चित्र 1 में दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, हालांकि यह मॉडल उचित रूप से आंतों के उपकला मोनोलेयर को फिर से बनाता है, यह आंतों की बाधा के सभी घटकों का पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं करता है जो रक्तप्रवाह को रोगजनकों से बचाता है। फिर भी, आंतों के उपकला के कुछ गुणों का अध्ययन इस मॉडल के साथ किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, टी 84 कोशिकाएं क्लोराइड का स्राव करती हैं और म्यूसिन23 का उत्पादन करती हैं। डायरिया पैदा करने वाले ई कोलाई द्वारा आक्रमण टी 84 कोशिकाओं में क्लोराइड स्राव में वृद्धिऔर संक्रमण के बाद 6 घंटे से अधिक टीईआर में उल्लेखनीय कमी के साथ जुड़ा हुआ है। यह संभव है कि बैक्टेरेमिया-उत्पादक ई कोलाई उपभेदों द्वारा आक्रमण भी इस मॉडल में क्लोराइड स्राव को बढ़ाता है और संक्रमण के 6 घंटे के बाद टीईआर में कमी हो सकती है। इस मॉडल को आयन परिवहन और जीवाणु आक्रमण के बीच संबंधों पर अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है यदि अन्य शोधकर्ताओं द्वारा वांछित है। म्यूसिन एक भौतिक बाधा है जो रोगजनकों के खिलाफ उपकला की रक्षा करता है। अन्य ई कोलाई उपभेदों के साथ संक्रमण टी 84 कोशिकाओं द्वारा श्लेष्म अभिव्यक्ति को कम करताहै। आंतों के उपकला में नवजात ई कोलाई ट्रांसकाइटोसिस के रोगजनन में म्यूसिन की भूमिका का भी इस मॉडल के साथ अध्ययन किया जा सकता है। इस मॉडल का एक अन्य उपयोग बैक्टीरियल साइक्लोमोडुलिन के साइटोटोक्सिक प्रभावों और नवजात ई कोलाई उपभेदों के ट्रांसकाइटोसिस की प्रक्रिया में उनकी संभावित भूमिका का अध्ययन करना हो सकता है। उदाहरण के लिए, साइटोटोक्सिक नेक्रोटाइज़िंग फैक्टर -1 (सीएनएफ -1), जो कुछ रोगजनक ई कोलाई उपभेदों द्वारा निर्मित होता है, आरएचओ जीटीपेस को लक्षित करता है, जो तंग जंक्शन फ़ंक्शन और संक्रमित यूकेरियोटिककोशिकाओं के एपोप्टोसिस को विनियमित करने में महत्वपूर्ण हैं। इस ट्रांसवेल मॉडल को उन तंत्रों को बेहतर ढंग से समझने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जिनके द्वारा ये साइटोटॉक्सिन आंतों के उपकला27 को प्रभावित करते हैं। आंतों के उपकला के साथ नवजात ई कोलाई उपभेदों की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस मॉडल का उपयोग करते समय, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि आंतों के उपकला को मॉडल करने के लिए उपयोग की जाने वाली टी 84 कोशिकाएं एक वयस्क6 में बृहदान्त्र एडेनोकार्सिनोमा के फेफड़ों के मेटास्टेसिस से प्राप्त होती हैं। जबकि टी 84 कोशिकाओं में अध्ययन ने आंतों की पारगम्यता पर विशिष्ट प्रभावों को पुन: उत्पन्न किया है जो मानव नवजात शिशु और नवजात पशु आंतों की कोशिकाओं28,29 में समान प्रभावों का अनुवाद करते हैं, भ्रूण और नवजात आंतों के उपकला आक्रामक ई कोलाई की उपस्थिति में अलग-अलग व्यवहार कर सकते हैं।
इस मॉडल और इसके द्वारा प्रदान किए जाने वाले डेटा की गुणवत्ता को अनुकूलित करने के लिए कुछ समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है। बाँझ नियंत्रण सम्मिलित के उपयोग पर प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में विस्तार से चर्चा की गई है। अन्य नॉनविनसिव ई कोलाई उपभेदों को नकारात्मक / न्यूनतम ट्रांसकाइटोसिस नियंत्रण के रूप में भी शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, एक अलग सेल लाइन, जैसे कि कैको -2, का उपयोग नवजात ई कोलाई उपभेदों की क्षमता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। ई कोलाई के आक्रमण और ट्रांसकाइटोसिस को कैको -2 कोशिकाओं30 की तुलना में टी 84 कोशिकाओं के लिए अधिक पाया गया है। इसलिए, इन अंतरों पर विचार करने की आवश्यकता है जब इस मॉडल का उपयोग इन और अन्य उपकला कोशिकाओं के साथ बैक्टीरियल ट्रांसकाइटोसिस का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है जो ध्रुवीकरण करते हैं और तंग जंक्शन बनाते हैं। प्रत्येक व्यक्तिगत ट्रांसवेल इंसर्ट के टीईआर माप लेने के लिए कई सेकंड की आवश्यकता होती है, और जब कई उपभेदों का परीक्षण किया जाता है, तो अतिरिक्त ऑपरेटर समय को ध्यान में रखा जाना चाहिए। ट्रांसवेल सिस्टम में टीईआर की निगरानी के अधिक कुशल तरीके विकसित किए जा रहे हैं। ये नए उपकरण कई ट्रांसवेल इंसर्ट में और वास्तविक समयमें एक साथ टीईआर की निगरानी करने की अनुमति देते हैं। इन विकल्पों पर विचार करने वाले शोधकर्ताओं को यह तय करने की आवश्यकता होगी कि क्या बचाया गया समय संभावित रूप से यहां वर्णित एकल-इलेक्ट्रोड माप की तुलना में इन नए उपकरणों की बढ़ी हुई कीमत की भरपाई कर सकता है।
कुछ संभावित चुनौतियों के बावजूद, यह परख शोधकर्ताओं को ट्रांसकाइटोसिस की मात्रा से परे ई कोलाई बैक्टेरेमिया के रोगजनन में शामिल विशिष्ट तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देती है। आणविक सूक्ष्म जीव विज्ञान तकनीकों के साथ संयुक्त होने पर, इस प्रक्रिया का उपयोग आंतों के उपकला को ट्रांससाइटोसिस करने के लिए ई कोलाई की क्षमता पर व्यक्तिगत जीन के प्रभावों को इंगित करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि पशु मॉडल32 में प्रयास किया गया है। इस मॉडल को प्रतिरक्षा कोशिका सह-संवर्धन या साइटोकिन्स, विकास कारकों और दवा हस्तक्षेपों के अतिरिक्त अधिक जटिल प्रतिरक्षा और फार्माकोडायनामिक प्रतिक्रियाओं को अनुकरण करने के लिए भी संशोधित किया जा सकताहै।
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Disclosures
कोई नहीं।
Acknowledgments
इस काम को मिसौरी-कैनसस सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन विश्वविद्यालय द्वारा जारी सारा मॉरिसन छात्र अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
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