Summary
Escherichia coli causa sepse em neonatos que ingerem a bactéria na época do nascimento. O processo envolvido na capacidade da E. coli de viajar do trato entérico para a corrente sanguínea é pouco compreendido. Este modelo in vitro avalia a capacidade das cepas de E. coli de viajar através das células epiteliais intestinais.
Abstract
Os recém-nascidos ingerem cepas maternas de E. coli que colonizam seu trato intestinal na época do parto. Cepas de E. coli com a capacidade de se deslocar através do intestino invadem a corrente sanguínea do recém-nascido, causando bacteremia com risco de vida. A metodologia aqui apresentada utiliza células epiteliais intestinais polarizadas cultivadas em pastilhas semipermeáveis para avaliar a transcitose de isolados de bacteremia neonatal de E. coli in vitro. Este método usa a linhagem celular intestinal T84 estabelecida que tem a capacidade de crescer até a confluência e formar junções apertadas e desmossomos. Após atingir a confluência, as monocamadas maduras de T84 desenvolvem resistência transepitelial (TEER), que pode ser quantificada usando um voltímetro. Os valores de TEER estão inversamente correlacionados com a permeabilidade paracelular de componentes extracelulares, incluindo bactérias, através da monocamada intestinal. A passagem transcelular de bactérias (transcitose), por outro lado, não altera necessariamente as medidas do TEER. Neste modelo, a passagem bacteriana através da monocamada intestinal é quantificada por até 6 h pós-infecção, e medições repetidas de TEER são feitas para monitorar a permeabilidade paracelular. Além disso, esse método facilita o uso de técnicas como a imunocoloração para estudar as mudanças estruturais em junções apertadas e outras proteínas de adesão célula a célula durante a transcitose bacteriana através do epitélio polarizado. O uso deste modelo contribui para a caracterização dos mecanismos pelos quais a E. coli neonatal transcita através do epitélio intestinal para produzir bacteremia.
Introduction
Escherichia coli é a causa mais comum de sepse de início precoce em recém-nascidos 1,2,3. A taxa de mortalidade da bacteremia neonatal por E. coli pode chegar a 40%, sendo a meningite uma possível complicação associada a graves incapacidades de neurodesenvolvimento2. A ingestão de cepas maternas de E. coli pelo recém-nascido pode produzir bacteremia neonatal; esse processo tem sido replicado em modelos animais 2,4. Uma vez ingeridas, as bactérias patogênicas viajam do lúmen intestinal neonatal através da barreira intestinal e entram na corrente sanguínea, causando septicemia. Cepas neonatais invasivas de E. coli que produzem bacteremia variam em sua capacidade de invadir células epiteliais intestinais 1,5. No entanto, sua capacidade de transcitar o epitélio intestinal após a invasão não foi completamente caracterizada.
Este modelo de transcitose intestinal é um método in vitro útil para emular a passagem bacteriana através do epitélio intestinal. O objetivo geral dos métodos apresentados neste manuscrito é comparar a capacidade de isolados neonatais de E. coli de transcitose o epitélio intestinal. O modelo aqui descrito utiliza células T84, que são células imortalizadas de adenocarcinoma intestinal humano 6,7. As células T84 são cultivadas até a confluência em uma membrana semipermeável com dois compartimentos separados. A justificativa para o uso dessa técnica é que, como acontece in vivo, essas células intestinais polarizam e desenvolvem junções apertadas maduras 6,8. O lado em contato com a membrana torna-se o lado basal. O lado oposto das células torna-se o lado apical, assemelhando-se ao lúmen intestinal, onde os patógenos ingeridos aderem e invadem. A membrana transwell é permeável a bactérias, mas as células intestinais polarizadas formam junções apertadas, o que prejudica o movimento paracelular bacteriano9. Assim, este método proporciona a vantagem de um ambiente controlado in vitro utilizando uma linhagem celular humana para estudar o processo de transcitose bacteriana, incluindo a via transcelular. Enquanto outros métodos existem para investigar a transcitose de bactérias através do epitélio intestinal, o método transwell apresentado aqui fornece maior facilidade e acessibilidade. Técnicas alternativas, como as que utilizam amostras ex vivo configuradas em sistemas de câmara Ussing, estão disponíveis. No entanto, utilizam espécimes de tecido que podem não ser facilmente acessíveis, principalmente se a pesquisa pretende estudar a fisiologia humana10. Os organoides intestinais representam outro exemplo de alternativa in vitro para o estudo das interações hospedeiro-bactéria11. Embora as monocamadas organoides também possam ser usadas no sistema transwell para estudar a transcitose bacteriana, elas requerem o isolamento e o crescimento de células-tronco e o uso de fatores de crescimento específicos para induzir a diferenciação12. Assim, seu uso é mais demorado e associado a maiores custos em comparação com o método transwell descrito neste manuscrito.
A avaliação da passagem bacteriana através do epitélio intestinal usando este sistema de transwell in vitro tem sido realizada com sucesso para vários patógenos. Esses estudos têm demonstrado a utilidade do sistema transwell utilizando células T84 para caracterizar a transcitose de bactérias através do epitélio intestinal polarizado13,14,15. No entanto, a aplicação deste método transwell para comparar a capacidade de transcitose de cepas neonatais de E. coli produtoras de bacteremia não foi descrita em detalhes. Este manuscrito fornece a outros pesquisadores um protocolo de transwell padrão que é confiável e fácil de usar e não requer recursos que são muito caros.
Para comparar a capacidade de cepas neonatais invasivas de E. coli de transcitar o epitélio intestinal, o lado apical da monocamada epitelial intestinal pode ser infectado com um número conhecido de células bacterianas. Após a incubação, o meio no lado basal do epitélio pode ser coletado e as bactérias quantificadas para determinar a quantidade de transcitose bacteriana ao longo do tempo. Neste manuscrito, os métodos apresentados são utilizados para estudar a capacidade de transcitose de cepas clínicas neonatais de E. coli recuperadas de recém-nascidos hospitalizados com bacteremia. Os critérios de inclusão para a seleção desses isolados clínicos neonatais para estudos de transcitose já foram publicados anteriormente 1,2,16. Quando este método é realizado usando diferentes cepas de E. coli, suas habilidades de transcitose podem ser comparadas. Através deste processo, o modelo de transcitose intestinal fornece dados valiosos para caracterizar os fatores de virulência de E. coli que contribuem para o processo multipasso que culmina no desenvolvimento da bacteremia neonatal.
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Protocol
NOTA: Execute todas as manipulações das células, bactérias, placas e reagentes T84 em um gabinete de segurança de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2) para evitar a contaminação. Use áreas separadas e incubadoras para todo o trabalho envolvendo células T84 estéreis, células T84 infectadas e E. coli. Os isolados clínicos de E. coli testados com os métodos aqui descritos foram obtidos seguindo as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa de nossa instituição 1,16.
1. Preparação de inserções de transcitose com células T84 (aproximadamente 1-2 semanas antes do experimento)
- Grow American Type Culture Collection (ATCC) células T84 em meio de cultura de tecidos (TCM + antibióticos) consistindo de Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mistura de nutrientes F-12 de Ham: mistura de nutrientes F-12 de Ham: 50% cada), 5% de soro fetal bovino e 1% (100 U/mL) de penicilina/estreptomicina dupla mistura de antibióticos. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2.
NOTA: Uma variação desta formulação de meio sem penicilina/estreptomicina (MTC sem antibióticos) é utilizada para as etapas posteriores (secção 2 e seguintes) do procedimento. Certifique-se de que a formulação correta seja usada para cada etapa. - Trabalhando dentro de um gabinete de biossegurança (BSC), semeie as células T84 em inserções transwell de cultura de células de membrana de polietileno tereftalato com poros de 3 μm feitos para placas de 24 poços. Inclua replicações de inserção transwell para cada condição experimental desejada, além de controles não infectados para monitorar possíveis contaminações.
- Em uma placa de 24 poços projetada para conter inserções transwell, preencha o número desejado de poços coletores com 1 mL de TCM + antibióticos.
- Em cada poço, coloque uma inserção transwell.
- Semeia estas inserções com 1 x 105 células T84 suspensas em 500 μL de MTC + antibióticos. Quantifique o número de células utilizando um hemocitômetro com coloração azul de tripano ou um contador celular automatizado17.
- Incubar as placas transwell contendo inserções semeadas nas mesmas condições em que as células foram cultivadas.
- Verificar com microscopia de luz se as monocamadas começaram a se tornar confluentes após a semeadura da pastilha, aproximadamente 48 h após a semeadura.
- A cada 2 dias após a semeadura, medir e registrar a resistência elétrica transepitelial (TEER) usando um medidor epitelial de volt/ohm (EVOM) para avaliar a maturidade da monocamada. Uma vez que as inserções atinjam um TEER de pelo menos 1.000 Ω·cm2, elas são consideradas prontas para o ensaio18.
NOTA: As inserções normalmente levam de 7 a 10 dias para atingir este TEER após a semeadura. As células T84 apresentarão 100% de confluência sob microscopia de luz, uma vez atingida essa resistência.- Armazene a sonda EVOM com os eletrodos submersos em 0,15 M KCl quando não estiver em uso.
- Antes de medir o TEER, descontamine a sonda do eletrodo submergindo-a em 5 mL de etanol a 70% em um tubo cônico de 50 mL por 10-15 min. Remova a sonda, agite o excesso de etanol e deixe-o secar ao ar dentro do BSC por 10 min. Reter o tubo de etanol.
- Teste o EVOM e a sonda colocando a sonda seca descontaminada em um poço estéril contendo 1 mL de TCM + antibióticos com uma inserção estéril no interior contendo 500 μL de TCM + antibióticos. Certifique-se de que a leitura do EVOM esteja <200 Ω. Registre esse valor em branco para usá-lo nos cálculos de resistência posteriores descritos na etapa 1.3.6.
- Remova a sonda do tubo de MTC + antibióticos. Reter este tubo para o armazenamento da sonda durante todo o experimento.
- Abaixe suavemente a sonda na primeira inserção com o eletrodo longo no poço coletor e o eletrodo curto dentro da inserção. Permita que o eletrodo longo toque o fundo do poço coletor, mas não empurre para baixo, pois isso pode perturbar a monocamada epitelial.
- Repita este processo para medir e registrar a resistência em Ohms (Ω) para cada inserção. Quando terminar, descontamine a sonda no etanol submergindo-a por mais 10-15 min. Em seguida, mova a sonda descontaminada de volta para a solução KCl para armazenamento. Subtraia a resistência em branco obtida na etapa 1.3.3 de cada valor obtido de cada pastilha que contenha células T84. Multiplique a resistência resultante (Ω) para cada pastilha pela área do fundo de cada pastilha (cm 2) para obter a medida final do TEER (Ω·cm2).
- Uma vez que o TEER atinja pelo menos 1.000 Ω·cm2, a monocamada epitelial está madura e pronta para ensaios de infecção.
- À medida que o TEER amadurece, forneça às células um meio fresco a cada 1-2 dias.
- Em uma nova placa de 24 poços, adicione 1 mL de MTC + antibióticos a um poço para cada inserção semeada que está sendo preparada.
- Usando pinças estéreis, transfira cuidadosamente as inserções para os poços recém-reabastecidos.
- Substitua a mídia nas inserções.
- Remova a mídia antiga das inserções inclinando a placa e usando um aspirador de vácuo interno para remover suavemente a mídia com uma ponta de pipeta ao longo do lado da inserção. O aspirador permite a regulação da sucção de baixo nível para evitar a ruptura das células. Não permita que a ponta da pipeta toque a parte inferior da pastilha, pois isso interromperá a monocamada epitelial em desenvolvimento.
- Adicione 500 μL de MTC + antibióticos às pastilhas. Visualize a monocamada com microscopia de luz para verificar se ela permanece intacta.
- A cada 1-2 dias, meça o TEER em cada pastilha, conforme descrito acima nas etapas 1.3.2-1.3.6.
2. Preparação das células T84 1 dia antes da experiência com MTC sem antibióticos
- Meça e registre o TEER no dia anterior ao experimento.
- Substitua o TCM da mesma maneira que durante a preparação e manutenção anteriores da célula. No entanto, a MTC sem antibióticos é usada em preparação para a infecção (1 mL no poço da placa e 500 μL na inserção).
3. Culturas de E. coli (iniciadas 1 dia antes do experimento)
CUIDADO: Use precauções de nível de biossegurança 2 (BSL-2) ao trabalhar com cepas clínicas patogênicas de E. coli.
- Pegue um tubo cônico marcado de 15 mL com 5 mL de caldo de lisogenia estéril (LB) e use uma alça estéril para inocular o caldo com uma colônia de uma cepa bacteriana (E. coli). Repita este processo, criando um tubo de cultura durante a noite para cada cepa a ser testada.
- Incubar a cultura noturna, com as tampas dos tubos soltas, em agitador de incubadora (250 rpm, 37 °C).
4. Preparação do inóculo de E. coli , células epiteliais e materiais (na manhã do experimento)
NOTA: Utilize MTC sem antibióticos aquecidos até 37 °C a partir deste ponto.
- Adicione 250 μL de cada cultura LB durante a noite a 25 mL de MTC sem antibióticos em um tubo cônico de 50 mL (um por cepa individual). Mantenha as tampas dos tubos soltas. Coloque estes novos tubos de cultura no agitador nas mesmas configurações (250 rpm, 37 °C) por exatamente 2 h. Execute as subetapas restantes enquanto aguarda.
- Meça o TEER em cada inserção, conforme descrito nas etapas 1.3.2-1.3.6. Registre-os como os TEERs no tempo (t) = 0 h.
- Mova as inserções para poços em uma nova placa e altere a mídia usando a técnica descrita na etapa 1.4.3. No entanto, desta vez, preencha os novos poços coletores com 500 μL de MTC sem antibióticos e preencha as inserções com 400 μL de MTC sem antibióticos. Mantenha as inserções dentro da incubadora de cultura de tecidos até o momento da infecção.
- Estabelecer um número suficiente de placas quadradas de ágar LB para aquecer à temperatura ambiente (RT) para posterior chapeamento e quantificação bacteriana.
5. Inoculação das células (início do experimento)
- Após exatamente 2 h, remova as culturas bacterianas matinais do agitador e centrifuga-as por 10 min (1.900 x g, 4 °C).
NOTA: Para todas as etapas a seguir, mantenha todas as suspensões bacterianas no gelo para minimizar o crescimento. - Ressuspeite a pastilha bacteriana na MTC sem antibióticos. Use um espectrofotômetro para ajustar a densidade óptica (OD) para 0,7-0,9 e diluir ainda mais com MTC sem antibióticos para uma concentração de 1 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL (aproximadamente diluição 1:100). Use esta suspensão bacteriana para infectar cada inserção com 1 x 105 UFC por volume de 100 μL.
- Rotule a placa transwell e infecte cada inserção com 100 μL do inóculo ajustado por OD (total de 1 x 105 UFC por inserção). O ensaio já começou. Anote a hora e registre-a como t = 0 h.
- Chapear a suspensão bacteriana de inóculo para quantificar a UFC/mL utilizando o método de diluição da via, chapeando alíquotas de 10 μL em placas quadradas de ágar LB19.
6. Quantificação da transcitose
- A cada 30 minutos após a inoculação, encha novos poços com 500 μL de MTC sem antibióticos. Transfira as inserções para esses novos poços usando um conjunto diferente de pinças estéreis para cada cepa bacteriana diferente.
- Colete a mídia do poço coletor usado para cada inserção em tubos rotulados separados. Coloque esses tubos no gelo. Devolva as placas transwell para a incubadora entre os pontos de tempo.
- Para cada inserção, combine os meios coletados de t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h e t = 2 h e vórtice brevemente. Chapear o meio coletado em placas de ágar LB utilizando o método de diluição da via para quantificar a quantidade de bactérias transcitadas nas primeiras 2 h do experimento.
NOTA: Recuperar as bactérias a cada 30 minutos e mantê-las no gelo garante que o crescimento bacteriano nos poços coletores seja minimizado e as medições sejam feitas em bactérias predominantemente transcitadas. - Coloque as placas de ágar LB de diluição de via marcadas na incubadora bacteriana a 37 °C sem CO2 suplementar e devolva a placa de transwell T84 à incubadora de cultura de tecidos.
- Em t = 4 h, repita o passo 6,3 combinando os meios coletados de t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h e t = 4 h.
- Em t = 6 h, repita o passo 6,3 combinando os meios coletados de t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h e t = 6 h. Além disso, em t = 6 h, chapear o meio dos poços de controle.
7. Fim do experimento
- Meça e registre o TEER ao final do experimento, t = 6 h. Use o procedimento descrito nas etapas 1.3.2-1.3.6.
- Descontamine a sonda submergindo-a em etanol a 70% por 10-15 min. Descarte as inserções ou salve/processe-as para aplicações adicionais, se desejar. Permitir que as placas de ágar LB incubem durante a noite e desinfetar e/ou eliminar com segurança todos os outros materiais utilizados.
- Após a incubação durante a noite, conte as colônias bacterianas manualmente nas placas LB de diluição da trilha para determinar a quantidade de inóculo e a quantidade de transcitose de E. coli. Certifique-se de que as placas de controle não mostram nenhum crescimento bacteriano.
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Representative Results
Figura 1: T84 TEER ao longo do tempo. À medida que a camada de células T84 amadurece na pastilha, a resistência elétrica da monocamada aumenta. Em um TEER de pelo menos 1.000 Ω·cm2, a camada celular está suficientemente desenvolvida para diminuir o transporte bacteriano paracelular e permitir a medição do trânsito bacteriano principalmente transcelular. As barras de erro indicam o desvio padrão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Durante a proliferação das células T84 estéreis descritas na secção 1, os TEERs através das monocamadas T84 aumentam continuamente ao longo do tempo, ultrapassando 1.000 Ω·cm2 aproximadamente após 7 dias da semeadura (ver Figura 1). Embora a polarização das células epiteliais e a maturação do TEER sejam mais robustas com células T84 do que com outras células intestinais, como a Caco-2, algumas soluções de problemas ainda podem ser necessárias6. O TEER de uma pastilha não deve diminuir drasticamente entre as medições. Tal declínio no TEER poderia indicar uma ruptura mecânica da monocamada epitelial. Deve-se garantir que, durante a mudança do meio, a ponta do aspirador nunca toque no fundo da inserção de cultura celular. Se houver suspeita desse tipo de dano, ele pode ser visualizado por microscopia de luz como uma ausência de células epiteliais próximas ao local de aspiração. Além dos danos causados pelo manuseio, uma diminuição no TEER pode indicar contaminação.
Figura 2: Transcitose de isolados neonatais de E. coli ao longo do tempo. Após infectar as pastilhas T84, os isolados clínicos neonatais de E. coli que atingem com sucesso o poço coletor são quantificados usando o método de diluição da pista. Diferentes cepas de E. coli podem ser comparadas em termos de sua capacidade de transcitar o epitélio intestinal. A E. coli DH5 alfa não patogênica foi incluída como comparador. Os gráficos mostram as UFCs médias e os erros-padrão em cada ponto de tempo. As comparações dos valores médios de transcitose foram feitas com testes t unicaudais, que demonstraram diferenças significativas entre os isolados neonatais de E. coli #1 versus #2 em 2 h (*p < 0,05), 4 h (**p < 0,04) e 6 h (***p < 0,04) pós-infecção. Em contraste, a cepa não patogênica de E. coli DH5 alfa foi submetida a transcitose mínima, como mostrado no terceiro gráfico. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A transcitose quantificada pode ser representada como mostra a Figura 2. Neste exemplo, os experimentos foram realizados usando três inserções, cada uma infectada com dois diferentes isolados neonatais invasivos de E. coli. Uma cepa não patogênica, DH5 alfa, também foi testada para comparação. Duas pastilhas de controle estéreis também foram incluídas (nenhuma parcela é mostrada, uma vez que nenhuma bactéria foi isolada). Os dados deste procedimento são úteis para descrever a capacidade de uma única cepa de E. coli de transcitar o epitélio intestinal. Os dados também podem permitir uma comparação das habilidades de transcitose de diferentes cepas (consulte a seção de discussão para outras aplicações).
Figura 3: TEER imediatamente antes da infecção e 6 h após a infecção. O TEER das inserções geralmente aumenta após a infecção por cepas neonatais produtoras de bacteremiade E. coli 2. As inserções infectadas mostram um aumento maior no TEER do que as inserções de controle não infectadas. O TEER foi significativamente maior nas monocamadas de T84 após 6 h de infecção pela cepa neonatal de E. coli #1 (*p < 0,01) e E. coli cepa #2 (**p < 0,03), calculada pelos testes t. O TEER nas monocamadas T84 controle não infectado também aumentou, mas a diferença entre os valores pré-infecção e pós-infecção não foi estatisticamente significativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 3 demonstra resultados típicos de TEER antes e após a infecção por dois isolados clínicos neonatais de E. coli com diferentes habilidades para transcitose células epiteliais intestinais. A taxa e a quantidade de transcitose variam entre as cepas, como mostra a Figura 2, mas o TEER aumenta significativamente após a infecção com ambas as cepas patogênicas.
Os resultados podem ser alterados na presença de contaminação neste experimento. As cepas neonatais de E. coli utilizadas não causaram danos suficientes à monocamada epitelial para produzir uma diminuição no TEER, mas as bactérias foram capazes de transcitose. É plausível que um organismo contaminante, se presente, possa causar danos às células intestinais e uma subsequente diminuição do TEER. As pastilhas de controle estéreis servem para ajudar a identificar essa possível contaminação. O meio de cultura de tecidos utilizado neste procedimento contém o indicador de pH vermelho fenol. Em geral, o meio parece um rosa claro quando é estéril ou infectado com um pequeno inóculo. Com crescimento significativo ou contaminação, o meio pode ficar turvo, amarelo ou malcheiroso. Antes da infecção, a mídia em todas as inserções T84 normalmente aparece rosa claro.
Após a incubação durante a noite, o local final para verificar a contaminação é nas placas de ágar LB. As placas de controle não devem apresentar qualquer crescimento. As placas feitas a partir dos poços coletores de inserções infectadas por E. coli devem conter colônias de E. coli homogêneas, redondas e amarelas . Para minimizar o risco de contaminação, todo o trabalho deve ser realizado em armários de biossegurança. Armários e incubadoras separados devem ser usados para a cultura de tecidos estéreis, cultura de tecidos infectados por E. coli e manipulação bacteriana. Os espaços de trabalho devem ser mantidos limpos e uma técnica estéril deve ser usada por toda parte.
Figura 4: Representação diagramática do sistema transwell e estruturas celulares intestinais relevantes. (A) Vista de secção da inserção transwell (azul); as linhas verticais na parte inferior da inserção indicam os poros permeáveis. As células epiteliais intestinais polarizadas formam uma monocamada na parte inferior da inserção. O meio de cultura de tecidos é mostrado em rosa, com uma sonda EVOM de duas pontas imersa nele. Os fios da sonda no lado oposto são ligados ao aparelho EVOM (não mostrado). (B) Diagrama simplificado dos componentes da junção apertada das células epiteliais intestinais. As setas verticais representam possíveis rotas de passagem bacteriana do lado apical para o lado basolateral da monocamada epitelial intestinal polarizada. Abreviaturas: ZO = proteínas da zona ocludens; JAM = moléculas de adesão juncional. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 Suplementar: Crescimento apical de isolados neonatais de E. coli ao longo do tempo. Medições de E. coli em sobrenadantes sobrejacentes a células T84 dentro de inserções transwell podem ser realizadas como um desfecho adicional opcional. A figura demonstra que o crescimento apical de ambas as cepas patogênicas de E. coli que foram testadas para transcitose não foi significativamente diferente ao longo do tempo. As barras de erro indicam desvios padrão. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Esse método é derivado de técnicas utilizadas em gastroenterologia e doenças infecciosas20. Modelos in vitro da barreira epitelial intestinal têm sido utilizados para elucidar os mecanismos pelos quais o conteúdo luminal interage com esse componente relevante da imunidade inata 6,8. As interações hospedeiro-patógeno de E. coli neonatal invasiva também têm sido caracterizadas separadamente por meio de análises genéticas, estudos de resistência antimicrobiana e técnicas imunológicas 1,5,16,21. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares que sustentam a capacidade dos isolados neonatais de E. coli de entrar na corrente sanguínea através do intestino3.
A técnica de transcitose aqui demonstrada permite uma caracterização mais detalhada das cepas invasivas neonatais de E. coli que produzem septicemia após aquisição enteral. A bacteremia neonatal é um processo de várias etapas, e a transcitose é uma das etapas relevantes. Em comparação com os modelos de invasão, este método de transcitose oferece informações adicionais sobre os mecanismos envolvidos na patogênese da bacteremia. Em alguns casos, a E. coli patogênica invade o intestino delgado sem atingir a corrente sanguínea, limitando a infecção a causar doença localizada22. Assim, a capacidade das bactérias de simplesmente invadir o epitélio intestinal pode não refletir sua capacidade de passar completamente pela barreira epitelial. Este modelo pode ser utilizado para estudar o processo de passagem bacteriana através do epitélio intestinal através das vias transcelulares ou paracelulares, particularmente se técnicas adicionais, como a microscopia eletrônica, forem incorporadas20. Em comparação com os modelos animais in vivo, este modelo in vitro é mais eficiente e permite um melhor controle de várias variáveis potenciais. Além disso, contribui para o bem-estar animal, fornecendo uma alternativa à experimentação in vivo.
Apesar dessas vantagens, esse experimento ainda tem suas limitações. Por um lado, este ensaio não leva em conta as diferenças no crescimento bacteriano no lado apical do epitélio durante a incubação. Tais diferenças de crescimento podem afetar a quantidade de transcitose para cada cepa. Os usuários podem optar por medir o crescimento apical para uma caracterização mais abrangente dos resultados obtidos com este modelo. Um exemplo do crescimento apical dos dois isolados de E. coli utilizados para os experimentos de transcitose nos métodos apresentados neste manuscrito é mostrado na Figura Suplementar 1. Além disso, embora este modelo recrie razoavelmente a monocamada epitelial intestinal, ele não representa completamente todos os componentes da barreira intestinal que protege a corrente sanguínea dos patógenos ingeridos. No entanto, algumas propriedades do epitélio intestinal podem ser estudadas com este modelo. Por exemplo, as células T84 secretam cloreto e produzem mucina23. A invasão por E. coli produtora de diarreia está associada ao aumento da secreção de cloreto nas células T84 e a uma diminuição significativa do TEER após 6 h pós-infecção24. É possível que a invasão por cepas de E. coli produtoras de bacteremia também aumente a secreção de cloreto neste modelo e que uma diminuição no TEER possa ocorrer após 6 h de infecção. Este modelo pode ser adaptado para estudos sobre a relação entre transporte iônico e invasão bacteriana, se assim o desejar por outros pesquisadores. A mucina é uma barreira física que protege o epitélio contra patógenos. A infecção por outras cepas de E. coli diminui a expressão de mucina pelas células T8425. O papel da mucina na patogênese da transcitose neonatal de E. coli através do epitélio intestinal também pode ser estudado com este modelo. Outro uso deste modelo poderia ser estudar os efeitos citotóxicos das ciclomodulinas bacterianas e seu possível papel no processo de transcitose de cepas neonatais de E. coli. Por exemplo, o fator necrosante citotóxico-1 (CNF-1), que é produzido por algumas cepas patogênicas de E. coli, tem como alvo as Rho GTPases, que são cruciais na regulação da função de junção apertada e da apoptose de células eucarióticas infectadas26. Esse modelo transwell pode ser adaptado para melhor compreender os mecanismos pelos quais essas citotoxinas afetam o epitélio intestinal27. Ao utilizar este modelo para estudar a interação de cepas neonatais de E. coli com o epitélio intestinal, é importante considerar que as células T84 utilizadas para modelar o epitélio intestinal são provenientes de uma metástase pulmonar de adenocarcinoma de cólon em um adulto6. Embora estudos em células T84 tenham reproduzido efeitos específicos sobre a permeabilidade intestinal que se traduziram em efeitos semelhantes em células intestinais de animais recém-nascidos humanos e neonatais28,29, o epitélio intestinal fetal e neonatal pode se comportar de forma diferente na presença de E. coli invasiva.
Alguma solução de problemas pode ser necessária para otimizar esse modelo e a qualidade dos dados que ele fornece. O uso de inserções de controle estéreis é discutido em detalhes na seção de resultados representativos. Outras cepas não invasivas de E. coli também podem ser incluídas como controles de transcitose negativos/mínimos. Além disso, uma linhagem celular diferente, como o Caco-2, pode ser usada para avaliar a capacidade das cepas neonatais de E. coli de transcitar o epitélio intestinal polarizado. A invasão e a transcitose de E. coli foram maiores para as células T84 em comparação com as células Caco-230. Portanto, essas diferenças precisam ser consideradas quando esse modelo é utilizado para avaliar a transcitose bacteriana com essas e outras células epiteliais que polarizam e formam junções apertadas. Fazer medições TEER de cada inserção transwell individual requer vários segundos e, quando várias deformações são testadas, o tempo adicional do operador precisa ser levado em consideração. Continuam a ser desenvolvidos métodos mais eficientes de monitorização do TEER em sistemas transwell. Esses dispositivos mais recentes permitem monitorar o TEER simultaneamente em várias inserções de transwell e em tempo real31. Os pesquisadores que consideram essas opções precisariam decidir se o tempo economizado poderia potencialmente compensar o aumento do preço desses dispositivos mais novos em comparação com as medições de eletrodo único descritas aqui.
Apesar de alguns possíveis desafios, este ensaio permite que os pesquisadores estudem mecanismos específicos envolvidos na patogênese da bacteremia de E. coli além da quantidade de transcitose. Quando combinado com técnicas de microbiologia molecular, esse processo pode ser usado para identificar os efeitos de genes individuais sobre a capacidade de E. coli de transcitar o epitélio intestinal, como foi tentado em modelos animais32. Esse modelo também pode ser modificado pela cocultura de células imunes ou pela adição de citocinas, fatores de crescimento e intervenções farmacêuticas para simular respostas imunes e farmacodinâmicas mais complexas33.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de estudante Sarah Morrison emitida pela Escola de Medicina da Universidade de Missouri-Kansas City para IA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
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