Summary
Кишечная палочка вызывает сепсис у новорожденных, которые глотают бактерии во время рождения. Процесс, связанный со способностью кишечной палочки перемещаться из кишечнорастворимого тракта в кровоток, плохо изучен. Эта модель in vitro оценивает способность штаммов E. coli путешествовать через эпителиальные клетки кишечника.
Abstract
Новорожденные глотают материнские штаммы E. coli , которые колонизируют их кишечный тракт во время родов. Штаммы E. coli со способностью перемещаться по кишечнику вторгаются в кровоток новорожденного, вызывая опасную для жизни бактериемию. Методология, представленная здесь, использует поляризованные эпителиальные клетки кишечника, выращенные на полупроницаемых вставках, для оценки трансцитоза изолятов бактериемии E. coli новорожденных in vitro. Этот метод использует установленную линию клеток кишечника T84, которая обладает способностью расти до слияния и образовывать плотные соединения и десмосомы. После достижения слияния зрелые монослои T84 развивают трансэпителиальное сопротивление (TEER), которое можно количественно оценить с помощью вольтметра. Значения TEER обратно коррелируют с параклеточной проницаемостью внеклеточных компонентов, включая бактерии, через монослой кишечника. Трансклеточный проход бактерий (трансцитоз), с другой стороны, не обязательно изменяет измерения TEER. В этой модели прохождение бактерий через кишечный монослой количественно оценивается на срок до 6 ч после заражения, и повторные измерения TEER производятся для мониторинга параклеточной проницаемости. Кроме того, этот метод облегчает использование таких методов, как иммуноокрашивание, для изучения структурных изменений в плотных соединениях и других белках клеточной адгезии во время бактериального трансцитоза через поляризованный эпителий. Использование этой модели способствует характеристике механизмов, с помощью которых неонатальная трансцитоза E. coli через эпителий кишечника вызывает бактериемию.
Introduction
Кишечная палочка является наиболее распространенной причиной раннего сепсиса у новорожденных 1,2,3. Смертность от неонатальной бактериемии E. coli может достигать 40%, а менингит является возможным осложнением, которое связано с тяжелыми нарушениями развития нервнойсистемы2. Прием внутрь материнских штаммов кишечной палочки новорожденным может привести к неонатальной бактериемии; этот процесс был воспроизведен на животных моделях 2,4. После попадания в организм патогенные бактерии перемещаются из просвета кишечника новорожденных через кишечный барьер и попадают в кровоток, вызывая септицемию. Неонатальные инвазивные штаммы E. coli, которые продуцируют бактериемию, различаются по своей способности вторгаться в эпителиальные клетки кишечника 1,5. Однако их способность трансцитозировать эпителий кишечника после инвазии не была полностью охарактеризована.
Эта модель кишечного трансцитоза является полезным методом in vitro для эмуляции прохождения бактерий через эпителий кишечника. Общей целью методов, представленных в этой рукописи, является сравнение способности неонатальных изолятов E. coli трансцитозировать эпителий кишечника. Модель, описанная здесь, использует клетки T84, которые являются увековеченными клетками аденокарциномы кишечника человека 6,7. Клетки Т84 выращивают до слияния на полупроницаемой мембране с двумя отдельными отсеками. Обоснование использования этой техники заключается в том, что, как это происходит in vivo, эти клетки кишечника поляризуются и развивают зрелые плотные соединения 6,8. Сторона, соприкасающаяся с мембраной, становится базальной. Противоположная сторона клеток становится апикальной стороной, напоминающей просвет кишечника, куда прилипают и вторгаются проглоченные патогены. Трансвелловая мембрана проницаема для бактерий, но поляризованные клетки кишечника образуют плотные соединения, которые ухудшают движение бактерий параклеток9. Таким образом, этот метод обеспечивает преимущество контролируемой среды in vitro с использованием клеточной линии человека для изучения процесса бактериального трансцитоза, включая трансклеточный путь. В то время как существуют другие методы исследования трансцитоза бактерий через эпителий кишечника, метод трансвелла, представленный здесь, обеспечивает большую легкость и доступность. Доступны альтернативные методы, такие как использование образцов ex vivo, установленных в системах камер Ussing. Тем не менее, они используют образцы тканей, которые могут быть недоступны, особенно если исследование направлено на изучение физиологии человека10. Кишечные органоиды представляют собой еще один пример альтернативы in vitro для изучения взаимодействия хозяина и бактерии11. В то время как органоидные монослои также могут быть использованы в системе трансвелл для изучения бактериального трансцитоза, они требуют выделения и роста стволовых клеток и использования специфических факторов роста для индуцирования дифференцировки12. Таким образом, их использование является более трудоемким и сопряжено с большими затратами по сравнению с методом трансвелла, описанным в данной рукописи.
Оценка прохождения бактерий через эпителий кишечника с использованием этой системы трансвелл in vitro была успешно выполнена для различных патогенов. Эти исследования показали полезность трансвелл-системы с использованием клеток Т84 для характеристики трансцитоза бактерий через поляризованный эпителий кишечника 13,14,15. Однако применение этого трансвелл-метода для сравнения трансцитозной способности неонатальных штаммов E. coli, продуцирующих бактериемию, подробно не описано. Эта рукопись предоставляет другим исследователям стандартный протокол трансвелла, который является надежным и простым в использовании и не требует слишком дорогих ресурсов.
Чтобы сравнить способность неонатальных инвазивных штаммов E. coli трансцитозировать эпителий кишечника, апикальная сторона монослоя эпителия кишечника может быть инфицирована известным количеством бактериальных клеток. После инкубации среда на базальной стороне эпителия может быть собрана, а бактерии количественно определены для определения количества бактериального трансцитоза с течением времени. В этой рукописи представленные методы используются для изучения трансцитозной способности неонатальных клинических штаммов E. coli, полученных от новорожденных, госпитализированных с бактериемией. Критерии включения для отбора этих неонатальных клинических изолятов для исследований трансцитоза были опубликованы ранее 1,2,16. Когда этот метод выполняется с использованием различных штаммов кишечной палочки, можно сравнить их трансцитозные способности. Благодаря этому процессу модель кишечного трансцитоза предоставляет ценные данные для характеристики факторов вирулентности E. coli, которые способствуют многоступенчатому процессу, который завершается развитием неонатальной бактериемии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все манипуляции с клетками, бактериями, пластинами и реагентами T84 в шкафу безопасности уровня биобезопасности 2 (BSL-2), чтобы избежать загрязнения. Используйте отдельные области и инкубаторы для всей работы с участием стерильных клеток T84, инфицированных клеток T84 и E. coli. Клинические изоляты E. coli, протестированные с помощью методов, описанных здесь, были получены в соответствии с руководящими принципами Институционального наблюдательного совета в нашем учреждении 1,16.
1. Подготовка трансцитозных вставок с Т84-клетками (примерно за 1-2 недели до эксперимента)
- Выращивайте клетки T84 в тканевой культуральной среде (TCM + антибиотики), состоящей из модифицированной орлиной среды Dulbecco: питательной смеси F-12 Ham (1: 1, конечная концентрация: 50% каждая), 5% фетальной бычьей сыворотки и 1% (100 Ед / мл) смеси двойного антибиотика пенициллина / стрептомицина. Инкубируют клетки при 37 °C с 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вариация этой среды без пенициллина/стрептомицина (ТКМ без антибиотиков) используется для более поздних этапов (раздел 2 и далее) в процедуре. Убедитесь, что для каждого шага используется правильная формулировка. - Работая внутри шкафа биобезопасности (BSC), засейте клетки T84 в полиэтилентерефталатные мембранные клеточные трансвелл-вставки с порами 3 мкм, сделанными для 24-луночных пластин. Включите трансвеллентные реплики для каждого желаемого экспериментального состояния плюс неинфицированные контрольные элементы для мониторинга возможного загрязнения.
- В 24-луночной пластине, предназначенной для хранения трансвеллеров, заполните нужное количество собирающих лунок 1 мл ТКМ+ антибиотиков.
- В каждый колодец поместите по одной трансвеллерной вставке.
- Засейте эти вставки 1 х 105 Т84 клетками, взвешенными в 500 мкл ТКМ + антибиотики. Количественное определение количества клеток с помощью гемоцитометра с синим пятном трипана или автоматизированного счетчика клеток17.
- Инкубируйте трансвеллинговые пластины, содержащие семенные вставки, в тех же условиях, в которых были выращены клетки.
- Проверьте с помощью световой микроскопии, что монослои начали сливаться после посева вставки, примерно через 48 ч после посева.
- Каждые 2 дня после посева измеряйте и регистрируйте трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) с помощью эпителиального вольт/омметра (EVOM) для оценки зрелости монослоя. Как только вставки достигают TEER не менее 1000 Ω·см2, они считаются готовыми к анализу18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вставкам обычно требуется 7-10 дней, чтобы достичь этого TEER после посева. Клетки T84 покажут 100% слияние при световой микроскопии, как только это сопротивление будет достигнуто.- Храните датчик EVOM с электродами, погруженными в 0,15 М ККл, когда они не используются.
- Перед измерением TEER обеззаражьте электродный зонд, погрузив его в 5 мл 70% этанола в коническую трубку объемом 50 мл на 10-15 мин. Снимите зонд, стряхните избыток этанола и дайте ему высохнуть на воздухе внутри BSC в течение 10 минут. Удерживать в пробирке этанол.
- Проверьте EVOM и зонд, поместив сухой обеззараженный зонд в стерильный колодец, содержащий 1 мл ТКМ + антибиотиков со стерильной вставкой внутри, содержащей 500 мкл ТКМ + антибиотики. Убедитесь, что показания EVOM составляют <200 Ω. Запишите это пустое значение, чтобы использовать его в более поздних расчетах сопротивления, описанных в шаге 1.3.6.
- Извлеките зонд из пробирки ТКМ + антибиотики. Сохраняйте эту трубку для хранения зонда на протяжении всего эксперимента.
- Осторожно опустите зонд в первую вставку с длинным электродом в коллекторном колодце и коротким электродом внутри вставки. Позвольте длинному электроду коснуться нижней части собирающего колодца, но не нажимайте вниз, так как это может нарушить эпителиальный монослой.
- Повторите этот процесс, чтобы измерить и записать сопротивление в Омах (Ω) для каждой вставки. Когда закончите, обеззаражьте зонд в этаноле, погрузив его еще на 10-15 минут. Затем переместите обеззараженный зонд обратно в раствор KCl для хранения. Вычтите сопротивление заготовки, полученное на этапе 1.3.3, из каждого значения, полученного от каждой вставки, содержащей ячейки Т84. Умножьте результирующее сопротивление (Ω) для каждой вставки на площадь нижней части каждой вставки (см2), чтобы получить окончательное измерение TEER (Ω·см2).
- Как только TEER достигает не менее 1000 Ω·см2, эпителиальный монослой созревает и готов к анализу инфекции.
- По мере созревания TEER обеспечивайте клетки свежей средой каждые 1-2 дня.
- В новой 24-луночной пластине добавьте 1 мл ТКМ + антибиотиков в одну лунку для каждой готовящейся семенной вставки.
- Используя стерильные щипцы, аккуратно перенесите вставки в вновь пополненные колодцы.
- Замените носитель во вставках.
- Извлеките старый носитель из вкладышей, наклонив пластину и используя собственный вакуумный аспиратор, чтобы аккуратно удалить носитель с помощью наконечника пипетки вдоль боковой стороны вставки. Аспиратор позволяет регулировать низкоуровневое всасывание, чтобы предотвратить разрушение клеток. Не допускайте, чтобы кончик пипетки касался нижней части вставки, так как это нарушит развитие эпителиального монослоя.
- Добавьте 500 мкл ТКМ + антибиотиков в вкладыши. Визуализируйте монослой с помощью световой микроскопии, чтобы убедиться, что он остается нетронутым.
- Каждые 1-2 дня измеряйте TEER на каждой вставке, как описано выше на этапах 1.3.2-1.3.6.
2. Подготовка Т84-клеток за 1 день до эксперимента с использованием ТКМ без антибиотиков
- Измерьте и запишите TEER за день до эксперимента.
- Замените ТКМ таким же образом, как и во время предварительной подготовки и обслуживания клеток. Однако ТКМ без антибиотиков используется вместо этого при подготовке к инфекции (1 мл в пластинке хорошо и 500 мкл во вставке).
3. Культуры кишечной палочки (начаты за 1 день до эксперимента)
ВНИМАНИЕ: Используйте меры предосторожности уровня биобезопасности 2 (BSL-2) при работе с патогенными клиническими штаммами кишечной палочки .
- Возьмите меченую коническую трубку объемом 15 мл с 5 мл стерильного лизогенного бульона (LB) и используйте стерильную петлю для прививки отвара одной колонией из одного бактериального штамма (E. coli). Повторите этот процесс, создав одну пробирку для ночной культуры для каждого тестируемого штамма.
- Инкубировать культуру на ночь, ослабив колпачки трубок, в шейкере инкубатора (250 об/мин, 37 °C).
4. Подготовка инокулята E. coli , эпителиальных клеток и материалов (утром в день эксперимента)
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ТКМ без антибиотиков, нагретых до 37 °C с этого момента.
- Добавьте 250 мкл с каждой ночной культуры LB к 25 мл ТКМ без антибиотиков в конической пробирке объемом 50 мл (по одной на отдельный штамм). Держите колпачки трубок ослабленными. Поместите эти новые культуральные трубки в шейкер при тех же настройках (250 об/мин, 37 °C) ровно на 2 часа. Выполните оставшиеся подшаги во время ожидания.
- Измерьте TEER на каждой вставке, как описано на этапах 1.3.2-1.3.6. Запишите их как ТЕЭР в момент времени (t) = 0 ч.
- Переместите вставки в скважины в новой пластине и измените среду с помощью методики, описанной на этапе 1.4.3. Однако на этот раз заполните новые коллекторные колодцы 500 мкл ТКМ без антибиотиков и заполните вкладыши 400 мкл ТКМ без антибиотиков. Храните вставки внутри инкубатора культуры тканей до момента заражения.
- Установите достаточное количество квадратных агаровых пластин LB для нагрева до комнатной температуры (RT) для последующего покрытия и количественной оценки бактерий.
5. Инокуляция клеток (начало эксперимента)
- Ровно через 2 ч удалите утренние бактериальные культуры из шейкера и центрифугируйте их в течение 10 мин (1 900 х г, 4 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех следующих шагов держите все бактериальные суспензии на льду, чтобы свести к минимуму рост. - Повторное суспендирование гранул бактерий в ТКМ без антибиотиков. Используйте спектрофотометр для регулировки оптической плотности (OD) до 0,7-0,9 и дополнительно разбавляйте ТКМ без антибиотиков до концентрации 1 х 106 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл (примерно 1:100 разведения). Используйте эту бактериальную суспензию, чтобы заразить каждую вставку 1 х 105 КОЕ на объем 100 мкл.
- Пометьте трансвеллерную пластину и заразите каждую вставку 100 мкл инокулята с поправкой на OD (в общей сложности 1 x 105 КОЕ на вставку). Теперь анализ начался. Запишите время и запишите его как t = 0 ч.
- Нанесите бактериальную суспензию inoculum для количественной оценки КОЕ/мл с использованием метода разбавления трека, покрывая 10 мкл аликвот на квадратных пластинах агара LB19.
6. Количественная оценка трансцитоза
- Каждые 30 мин после прививки заполняйте новые лунки 500 мкл ТКМ без антибиотиков. Перенесите вставки в эти новые колодцы, используя различный набор стерильных щипцов для каждого отдельного бактериального штамма.
- Соберите среду из использованного колодца для каждой вставки в отдельные маркированные тубы. Поместите эти трубки на лед. Верните трансвеллинговые пластины в инкубатор между временными точками.
- Для каждой вставки объедините собранные среды от t = 0,5 ч, t = 1 ч, t = 1,5 ч и t = 2 ч и кратковременно вихрь. Нанесите собранные среды на пластины агара LB с помощью метода разбавления трека для количественной оценки количества бактерий, трансцитозированных в первые 2 ч эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Извлечение бактерий каждые 30 минут и хранение их на льду обеспечивает минимальный рост бактерий в собирающих лунках и проведение измерений преимущественно трансцитозированных бактерий. - Поместите помеченные пластины агара LB в бактериальный инкубатор при 37 °C без дополнительного CO2 и верните трансвеллентную пластину T84 в инкубатор культуры тканей.
- При t = 4 ч повторите шаг 6,3, объединив собранные среды из t = 2,5 ч, t = 3 ч, t = 3,5 ч и t = 4 ч.
- При t = 6 ч повторите шаг 6,3, объединив собранные среды из t= 4,5 ч, t = 5 ч, t = 5,5 ч и t = 6 ч. Кроме того, при t = 6 ч накладывают среду из контрольных скважин.
7. Окончание эксперимента
- Измерьте и запишите TEER в конце эксперимента, t = 6 ч. Используйте процедуру, описанную в шагах 1.3.2-1.3.6.
- Обеззараживайте зонд, погружая его в 70% этанол на 10-15 мин. Отбросьте вставки или сохраните/обработайте их для дополнительных применений, если это необходимо. Позвольте агаровым пластинам LB инкубироваться в течение ночи и дезинфицировать и / или безопасно утилизировать все другие используемые материалы.
- После ночной инкубации подсчитайте бактериальные колонии вручную на дорожке разбавления пластин LB, чтобы определить количество инокулята и количество трансцитоза E. coli . Убедитесь, что контрольные пластины не показывают роста бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1: T84 TEER с течением времени. По мере созревания клеточного слоя Т84 на вставке электрическое сопротивление монослоя увеличивается. При TEER не менее 1000 Ω·см2 клеточный слой достаточно развит, чтобы уменьшить параклеточный бактериальный транспорт и позволить измерять в основном трансклеточный бактериальный транзит. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Во время пролиферации стерильных клеток Т84, описанных в разделе 1, ТЕЭР через монослои Т84 непрерывно увеличиваются с течением времени, превышая 1000 Ω·см2 примерно через 7 дней после посева (см. Рисунок 1). Хотя поляризация эпителиальных клеток и созревание TEER более устойчивы с клетками T84, чем с другими клетками кишечника, такими как Caco-2, некоторые проблемы все еще могут потребоваться6. TEER вставки не должен резко уменьшаться между измерениями. Такое снижение TEER может указывать на механическое нарушение эпителиального монослоя. Следует следить за тем, чтобы во время изменения среды кончик аспиратора никогда не касался нижней части вкладыша клеточной культуры. Если подозревается этот тип повреждения, его можно визуализировать с помощью световой микроскопии как отсутствие эпителиальных клеток вблизи места аспирации. В дополнение к ущербу от обработки, снижение TEER может указывать на загрязнение.
Рисунок 2: Трансцитоз неонатальных изолятов кишечной палочки с течением времени. После заражения вставок T84 неонатальные клинические изоляты E. coli , которые успешно достигают колодца сбора, количественно оцениваются с использованием метода разбавления трека. Различные штаммы E. coli можно сравнить с точки зрения их способности трансцитозировать эпителий кишечника. Непатогенная E. coli DH5 альфа была включена в качестве компаратора. Графики показывают средние КОЕ и стандартные ошибки в каждой точке времени. Сравнение средних значений трансцитоза проводилось с помощью однохвостых т-тестов, которые продемонстрировали значительные различия между неонатальными изолятами E. coli No1 и No2 через 2 ч (*p < 0,05), 4 ч (**p < 0,04) и 6 ч (***p < 0,04) после заражения. Напротив, непатогенный штамм E. coli DH5 alpha подвергся минимальному трансцитозу, как показано на третьем графике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Количественный трансцитоз может быть представлен так, как показано на рисунке 2. В этом примере эксперименты проводились с использованием трех вставок, каждая из которых была инфицирована двумя различными неонатальными инвазивными изолятами E. coli . Непатогенный штамм, DH5 альфа, также был протестирован для сравнения. Также были включены две стерильные контрольные вставки (график не показан, поскольку бактерии не были выделены). Данные этой процедуры полезны для описания способности одного штамма E. coli трансцитозировать эпителий кишечника. Данные могут также позволить сравнить способности трансцитоза различных штаммов (см. раздел обсуждения для дальнейших применений).
Рисунок 3: TEER непосредственно перед инфекцией и через 6 ч после заражения. TEER вставок обычно увеличивается после заражения неонатальными штаммами, продуцирующими бактериемию E. coli 2. Зараженные вставки показывают большее увеличение TEER, чем неинфицированные контрольные вставки. TEER был значительно выше в монослоях T84 после 6 ч инфицирования неонатальным штаммом E. coli #1 (*p < 0,01) и штаммом E. coli #2 (**p < 0,03), как рассчитано t-тестами. TEER в неинфицированных контрольных монослоях T84 также увеличился, но разница между значениями до и после заражения не была статистически значимой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На рисунке 3 показаны типичные результаты TEER до и после заражения двумя неонатальными клиническими изолятами E. coli с различными способностями к трансцитозе эпителиальных клеток кишечника. Скорость и количество трансцитоза варьируются между штаммами, как показано на рисунке 2, но TEER значительно увеличивается после заражения обоими патогенными штаммами.
Результаты могут быть изменены в присутствии загрязнения в этом эксперименте. Используемые неонатальные штаммы E. coli не вызывали достаточного повреждения эпителиального монослоя, чтобы вызвать снижение TEER, но бактерии были способны трансцитозировать. Вполне вероятно, что загрязняющий организм, если он присутствует, может вызвать повреждение клеток кишечника и последующее снижение TEER. Стерильные контрольные вставки помогают выявить такое возможное загрязнение. Тканевая культуральная среда, используемая в этой процедуре, содержит фенольный красный показатель рН. В целом, среда выглядит ярко-розовой, когда она стерильна или заражена небольшим инокулятом. При значительном росте или загрязнении среда может стать мутной, желтой или зловостой. До заражения среда во всех вставках T84 обычно выглядит ярко-розовой.
После ночной инкубации последнее место для проверки на загрязнение находится на пластинах агара LB. Контрольные пластины не должны показывать никакого роста. Пластины, изготовленные из колодцев для сбора Вставок, инфицированных кишечной палочкой, должны содержать однородные, круглые, желтые колонии кишечной палочки . Чтобы минимизировать риск заражения, все работы должны выполняться в шкафах биобезопасности. Отдельные шкафы и инкубаторы следует использовать для стерильного культивирования тканей, культивирования тканей, инфицированных кишечной палочкой, и бактериальных манипуляций. Рабочие места должны содержаться в чистоте, и во всем должна использоваться стерильная техника.
Рисунок 4: Схематическое представление трансвелл-системы и соответствующих структур клеток кишечника. (А) Вид участка трансвеллерной вставки (синий); вертикальные линии в нижней части вставки указывают на проницаемые поры. Поляризованные эпителиальные клетки кишечника образуют монослой в нижней части вставки. Тканевая культуральная среда показана розовым цветом, с погруженным в нее двухсторонним зондом EVOM. Провода зонда с противоположной стороны подключены к аппарату EVOM (не показаны). (B) Упрощенная схема плотного соединения компонентов эпителиальных клеток кишечника. Вертикальные стрелки представляют возможные пути прохождения бактерий от апикальной к базолатеральной стороне поляризованного монослоя эпителия кишечника. Сокращения: ZO = zona occludens белки; JAM = соединительные молекулы адгезии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Апикальный рост неонатальных изолятов кишечной палочки с течением времени. Измерения кишечной палочки в супернатантах, перекрывающих ячейки Т84 в трансвелл-вставках, могут быть выполнены в качестве дополнительной конечной точки. Рисунок показывает, что апикальный рост обоих патогенных штаммов E. coli , которые были протестированы на трансцитоз, не сильно отличался с течением времени. Полосы ошибок указывают на стандартные отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод получен из методов, используемых в гастроэнтерологии и инфекционных заболеваниях20. Модели in vitro кишечного эпителиального барьера были использованы для выяснения механизмов, с помощью которых просветное содержимое взаимодействует с этим соответствующим компонентом врожденного иммунитета 6,8. Взаимодействия хозяин-патоген инвазивной неонатальной кишечной палочки также были отдельно охарактеризованы с помощью генетического анализа, исследований устойчивости к противомикробным препаратам и иммунологических методов 1,5,16,21. Тем не менее, мало что известно о молекулярных механизмах, лежащих в основе способности неонатальных изолятов E. coli проникать в кровоток через кишечник3.
Метод трансцитоза, продемонстрированный в настоящем описании, позволяет более подробно охарактеризовать неонатальные инвазивные штаммы E. coli , которые вызывают септицемию после энтерального приобретения. Неонатальная бактериемия является многоступенчатым процессом, и трансцитоз является одним из соответствующих этапов. По сравнению с моделями инвазии, этот метод трансцитоза предлагает дополнительную информацию о механизмах, участвующих в патогенезе бактериемии. В некоторых случаях патогенная кишечная палочка проникает в тонкую кишку, не достигая кровотока, ограничивая инфекцию до причины локализованного заболевания22. Таким образом, способность бактерий просто вторгаться в эпителий кишечника может не отражать их способность полностью проходить через эпителиальный барьер. Эта модель может быть использована для изучения процесса прохождения бактерий через эпителий кишечника по трансклеточным или параклеточным путям, особенно если включены дополнительные методы, такие как электронная микроскопия20. По сравнению с моделями животных in vivo , эта модель in vitro более эффективна и позволяет лучше контролировать несколько потенциальных переменных. Кроме того, он способствует благополучию животных, предоставляя альтернативу экспериментам in vivo .
Несмотря на эти преимущества, этот эксперимент все же имеет свои ограничения. Во-первых, этот анализ не учитывает различия в росте бактерий на апикальной стороне эпителия во время инкубации. Такие различия в росте могут влиять на количество трансцитоза для каждого штамма. Пользователи могут выбрать измерение апикального роста для более полной характеристики результатов, полученных с помощью этой модели. Пример апикального роста двух изолятов E. coli, используемых для экспериментов по трансцитозу в методах, представленных в этой рукописи, показан на дополнительном рисунке 1. Кроме того, хотя эта модель разумно воссоздает монослой кишечного эпителия, она не полностью представляет все компоненты кишечного барьера, который защищает кровоток от проглоченных патогенов. Тем не менее, некоторые свойства кишечного эпителия могут быть изучены с помощью этой модели. Например, клетки Т84 секретируют хлорид и продуцируют муцин23. Инвазия диарейно-продуцирующей кишечной палочкой связана с увеличением секреции хлоридов в Т84-клетках и значительным снижением TEER после 6 ч после заражения24. Возможно, что инвазия штаммов E. coli, продуцирующих бактериемию, также увеличивает секрецию хлоридов в этой модели и что снижение TEER может произойти после 6 ч инфекции. Эта модель может быть адаптирована для исследований взаимосвязи между транспортом ионов и бактериальной инвазией, если этого пожелают другие исследователи. Муцин является физическим барьером, который защищает эпителий от патогенов. Заражение другими штаммами E. coli снижает экспрессию муцина Т84 клетками25. Роль муцина в патогенезе неонатального трансцитоза E. coli через эпителий кишечника также может быть изучена с помощью этой модели. Другим применением этой модели может быть изучение цитотоксических эффектов бактериальных цикломодулинов и их возможной роли в процессе трансцитоза неонатальных штаммов E. coli. Например, цитотоксический некротизирующий фактор-1 (CNF-1), который продуцируется некоторыми патогенными штаммами E. coli, нацелен на Rho GTPases, которые имеют решающее значение для регулирования функции плотного соединения и апоптоза инфицированных эукариотических клеток26. Эта трансвелл-модель может быть адаптирована для лучшего понимания механизмов, с помощью которых эти цитотоксины влияют на эпителий кишечника27. При использовании этой модели для изучения взаимодействия неонатальных штаммов E. coli с эпителием кишечника важно учитывать, что клетки T84, используемые для моделирования кишечного эпителия, получены из метастазирования в легкие аденокарциномы толстой кишки у взрослого6. В то время как исследования в клетках Т84 воспроизвели специфические эффекты на проницаемость кишечника, которые привели к аналогичным эффектам в клетках кишечника новорожденных и новорожденных животных28,29, эпителий кишечника плода и новорожденных может вести себя по-разному в присутствии инвазивной кишечной палочки.
Для оптимизации этой модели и качества предоставляемых ею данных может потребоваться некоторое устранение неполадок. Использование стерильных контрольных вставок подробно обсуждается в разделе репрезентативных результатов. Другие неинвазивные штаммы E. coli также могут быть включены в качестве отрицательных / минимальных средств контроля трансциклоза. Кроме того, другая клеточная линия, такая как Caco-2, может быть использована для оценки способности неонатальных штаммов E. coli трансцитозно поляризовать кишечный эпителий. Было обнаружено, что инвазия и трансцитоз E. coli больше для клеток T84 по сравнению с клетками Caco-230. Поэтому эти различия необходимо учитывать, когда эта модель используется для оценки бактериального трансцитоза с этими и другими эпителиальными клетками, которые поляризуются и образуют плотные соединения. Проведение измерений TEER каждой отдельной трансвеллентной вставки занимает несколько секунд, а при испытании нескольких деформаций необходимо учитывать дополнительное время оператора. Продолжают разрабатываться более эффективные методы мониторинга ТЭЭи в трансвеллерных системах. Эти новые устройства позволяют контролировать TEER одновременно в нескольких трансвеллерных вставках и в режиме реального времени31. Исследователи, рассматривающие эти варианты, должны будут решить, может ли сэкономленное время потенциально компенсировать повышенную цену этих новых устройств по сравнению с одноэлектродными измерениями, описанными здесь.
Несмотря на некоторые возможные проблемы, этот анализ позволяет исследователям изучать конкретные механизмы, участвующие в патогенезе бактериемии E. coli , помимо количества трансцитоза. В сочетании с методами молекулярной микробиологии этот процесс может быть использован для точного определения влияния отдельных генов на способность E. coli трансцитозировать эпителий кишечника, как это было предпринято на животных моделях32. Эта модель также может быть модифицирована путем совместного культивирования иммунных клеток или добавления цитокинов, факторов роста и фармацевтических вмешательств для моделирования более сложных иммунных и фармакодинамических реакций33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана студенческим грантом Сары Моррисон, выданным Медицинской школой Университета Миссури-Канзас-Сити для ИИ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
- Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
- Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
- Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
- Schoultz, I., Keita, Å The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
- Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
- Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
- Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
- Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
- Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
- Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
- McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
- Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
- Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
- El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
- Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
- Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
- Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6'-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
- Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
- Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
- McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
- Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).
