Summary
ATAC-seq هي طريقة تسلسل الحمض النووي التي تستخدم ترانسبوزاز الطافر مفرط النشاط ، Tn5 ، لتعيين التغييرات في إمكانية الوصول إلى الكروماتين بوساطة عوامل النسخ. يتيح ATAC-seq اكتشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء التغيرات المظهرية في الخلايا السرطانية. يحدد هذا البروتوكول إجراءات التحسين ل ATAC-seq في أنواع الخلايا الظهارية ، بما في ذلك الخلايا السرطانية.
Abstract
فحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع التسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) يسبر إمكانية الوصول إلى الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) باستخدام ترانسبوزاز Tn5 مفرط النشاط. يقوم Tn5 بقطع وربط المحولات للتسلسل عالي الإنتاجية داخل مناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها. في الخلايا حقيقية النواة، يحزم الحمض النووي الجينومي في الكروماتين، وهو مركب من الحمض النووي (DNA) والهستونات والبروتينات الأخرى، التي تعمل كحاجز مادي أمام آلية النسخ. استجابة للإشارات الخارجية ، تقوم عوامل النسخ بتجنيد مجمعات إعادة تشكيل الكروماتين لتمكين الوصول إلى آلية النسخ لتنشيط الجينات. لذلك ، فإن تحديد مناطق الكروماتين المفتوحة مفيد عند مراقبة أنشطة المحسن والمروج الجيني أثناء الأحداث البيولوجية مثل تطور السرطان. نظرا لأن هذا البروتوكول سهل الاستخدام وله متطلبات إدخال خلية منخفضة ، فقد تم اعتماد ATAC-seq على نطاق واسع لتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة في أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك الخلايا السرطانية. للحصول على البيانات بنجاح ، يجب مراعاة العديد من المعلمات عند إعداد مكتبات ATAC-seq. من بينها ، يعد اختيار المخزن المؤقت لتحلل الخلية ، ومعايرة إنزيم Tn5 ، وحجم بدء الخلايا أمرا بالغ الأهمية لإعداد مكتبة ATAC-seq في الخلايا السرطانية. التحسين ضروري لإنشاء بيانات عالية الجودة. هنا ، نقدم وصفا تفصيليا لطرق تحسين ATAC-seq لأنواع الخلايا الظهارية.
Introduction
تعد إمكانية الوصول إلى الكروماتين مطلبا رئيسيا لتنظيم التعبير الجيني على نطاق الجينوم1. غالبا ما ترتبط التغييرات في إمكانية الوصول إلى الكروماتين بالعديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان2،3،4. على مر السنين ، تم تطوير العديد من التقنيات لتمكين الباحثين من استكشاف مشهد الكروماتين عن طريق رسم خرائط لمناطق إمكانية الوصول إلى الكروماتين. بعضها يشمل DNase-seq (تسلسل المواقع شديدة الحساسية DNase I)5 ، FAIRE-seq (عزل العناصر التنظيمية بمساعدة الفورمالديهايد)6 ، MAPit (بروتوكول إمكانية الوصول إلى ميثيل ترانسفيراز للقوالب الفردية)7 ، ومحور هذه الورقة ، ATAC-seq (مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase)8. يرسم DNase-seq خرائط للمناطق التي يمكن الوصول إليها من خلال استخدام ميزة رئيسية ل DNase ، وهي الهضم التفضيلي للحمض النووي العاري الخالي من الهستونات والبروتينات الأخرى مثل عوامل النسخ5. يستخدم FAIRE-seq ، على غرار ChIP-seq ، تشابك الفورمالديهايد وصوتنة ، باستثناء عدم وجود ترسيب مناعي ، ويتم عزل المناطق الخالية من النيوكليوسوم عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم6. تستخدم طريقة MAPit GC methyltransferase لفحص بنية الكروماتين بدقة جزيء واحد7. يعتمد ATAC-seq على ناقل الحركة مفرط النشاط ، Tn58. يرتبط ترانسبوزاز Tn5 بشكل تفضيلي بمناطق الكروماتين المفتوحة ويدخل محولات التسلسل في المناطق التي يمكن الوصول إليها. يعمل Tn5 من خلال آلية "قص ولصق" بوساطة الحمض النووي ، حيث يرتبط الترانسبوزاز المحمل مسبقا بالمحولات بمواقع الكروماتين المفتوحة ، ويقطع الحمض النووي ، ويربط المحولات8. يتم استرداد المناطق المرتبطة ب Tn5 عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات التي تلتصق بهذه المحولات. يتطلب FAIRE-seq و DNase-seq كمية كبيرة من المواد الأولية (~ 100000 خلية إلى 225000 خلية) وخطوة إعداد مكتبة منفصلة قبل التسلسل9. من ناحية أخرى ، فإن بروتوكول ATAC-seq بسيط نسبيا ويتطلب عددا صغيرا من الخلايا (<50000 خلية)10. على عكس تقنيات FAIRE-seq و DNase-seq ، فإن إعداد مكتبة التسلسل ل ATAC-seq سهل نسبيا ، حيث يتم بالفعل تمييز عينة الحمض النووي المعزولة بمحولات التسلسل بواسطة Tn5. لذلك ، لا يلزم سوى خطوة تضخيم PCR مع البادئات المناسبة لإكمال إعداد المكتبة ، ولا يلزم تنفيذ خطوات المعالجة السابقة مثل الإصلاح النهائي وربط المحول ، وبالتالي توفير الوقت11. ثانيا ، يتجنب ATAC-seq الحاجة إلى تحويل ثنائي الكبريتيت واستنساخه وتضخيمه باستخدام مواد أولية خاصة بالمنطقة مطلوبة ل MAPit7. بسبب هذه المزايا ، أصبح ATAC-seq طريقة شائعة للغاية لتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة. على الرغم من أن طريقة ATAC-seq بسيطة ، إلا أن الخطوات المتعددة تتطلب التحسين للحصول على بيانات عالية الجودة وقابلة للتكرار. تناقش هذه المخطوطة إجراءات التحسين لإعداد مكتبة ATAC-seq القياسية ، ولا سيما تسليط الضوء على ثلاثة معلمات: (1) تكوين المخزن المؤقت للتحلل ، (2) تركيز ترانسبوزاز Tn5 ، و (3) رقم الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه الورقة أمثلة على البيانات من ظروف التحسين باستخدام كل من الخلايا الظهارية الملتصقة السرطانية وغير السرطانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الاستعدادات قبل بدء التجربة
- تحضير مخزون العازلة للتحلل.
ملاحظة: يمكن أن يكون المخزن المؤقت الأمثل للعزل النووي مختلفا لكل نوع من الخلايا. نوصي باختبار كل من المخزن المؤقت منخفض التوتر المستخدم في الورقة الأصلية8 والمخزن المؤقت CSK12,13 لكل نوع خلية باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.- لتحضير محلول منخفض التوتر (محلول غرينليف)، امزج 10 ملي مول من Tris-HCl pH 7.4، و10 mM NaCl، و3 mM MgCl2، و0.1٪ NP-40.
- لتحضير محلول CSK ، امزج 10 mM PIPES pH 6.8 و 100 mM NaCl و 300 mM سكروز و 3 mM MgCl2 و 0.1٪ Triton X-100.
- تأكد من أن ظروف زراعة الخلايا هي الأمثل ؛ فحص الخلايا تحت المجهر الضوئي للتأكد من عدم وجود مستويات مرتفعة من موت الخلايا المبرمج.
- قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي للسماح له بالوصول إلى 4 درجات مئوية.
2. حصاد الخلايا
- استنشاق الوسائط من ثقافة الخلايا عند التقاء <80٪. تزرع الخلايا عادة في طبق 35 مم أو 60 مم ، بناء على عدد الخلايا المطلوبة والعلاجات وما إلى ذلك.
- اغسل الخلايا ب 1 مل أو 3 مل من برنامج تلفزيوني.
- أضف 0.5 مل أو 1 مل من التربسين واحتضانه لمدة 2-3 دقائق (حسب أنواع الخلايا). استخدم بعناية ماصة 1 مل لخلطها جيدا.
- أضف 1 مل أو 2 مل من الوسائط إلى اللوحة واخلطها جيدا. نقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي للخلايا في أنبوب سعة 15 مل لمدة 3 دقائق عند 300 × جم.
ملاحظة: يوصى باستخدام دوار الجرافة المتأرجح لتقليل فقد الخلايا. - استنشاق الوسائط وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل أو 2 مل من المتوسط.
ملاحظة: من الأهمية بمكان تحضير محلول متجانس أحادي الخلية. بالنسبة للأنسجة، يمكن استخدام الخالط Dounce لتجانس الأنسجة وتقليل كتل الخلايا الكبيرة أو المجاميع. تتطلب بعض الأنسجة الترشيح (على سبيل المثال ، مصافي الخلايا) و / أو فرز خلايا FACS لعزل الخلايا القابلة للحياة والحصول على محلول خلية واحدة. - عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام عداد خلية آلي (جدول المواد). - جهاز طرد مركزي لحجم الخلية المطلوب (على سبيل المثال ، حجم يحتوي على 1 × 106 خلايا بناء على عدد الخلايا) عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- أعد تعليق حبيبات الخلية التي تحتوي على 1 × 106 خلايا في 1 مل من PBS البارد.
ملاحظة: إذا كانت أرقام الخلايا أقل من 1 × 106 خلايا ، فقم بتقليل حجم PBS البارد لتحضير محلول الخلية بنفس التركيز (1 × 106 خلايا / مل).
3. تحلل الخلية
- نقل 25 ميكرولتر (= 2.5 × 104 خلايا) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.7 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية وتخلص بعناية من المادة الطافية
ملاحظة: يوصى باستخدام دوار الجرافة المتأرجح لتقليل فقد الخلايا. اترك حوالي 3 ميكرولتر من المادة الطافية لضمان عدم التخلص من الخلايا. - أضف 25 ميكرولتر من محلول التحلل وأعد تعليق الخلايا عن طريق السحب اللطيف لأعلى ولأسفل. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق
- جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية وتخلص بعناية من المادة الطافية.
ملاحظة: يوصى باستخدام دوار الجرافة المتأرجح لتقليل فقد الخلايا. اترك حوالي 3 ميكرولتر من المادة الطافية لضمان عدم التخلص من الخلايا.
4. علامة Tn5
- أعد تعليق الحبيبات على الفور في 25 ميكرولتر من خليط تفاعل Tn5. خليط تفاعل Tn5 هو كما يلي: 12.5 ميكرولتر من 2x Tagmentation DNA buffer (TD buffer) ، 1.25-5 ميكرولتر من Tn5 transposase ، و 11.25-7.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
ملاحظة: التركيز القياسي ل Tn5 هو 2.5 ميكرولتر لخلايا 2.5 × 104 . - احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: اخلطي المحلول كل 10 دقائق.
5. تنقية الحمض النووي
ملاحظة: التنقية مطلوبة قبل التضخيم. تتم تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية MinElute PCR (جدول المواد).
- أضف 5 ميكرولتر من 3 م أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.2).
- أضف على الفور 125 ميكرولتر من Buffer PB واخلطه جيدا.
- اتبع بروتوكول مجموعة تنقية PCR بدءا من الخطوة 2.
- ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع سعة 2 مل.
- ضع العينة على عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 17900 × جم عند RT.
- تخلص من التدفق من خلال وضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع.
- أضف 750 ميكرولتر من Buffer PE إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 17,900 x g عند RT.
- تخلص من التدفق من خلال وضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع.
- قم بالطرد المركزي لعمود الدوران لمدة 5 دقائق لتجفيف الغشاء تماما.
- تخلص من التدفق من خلال وضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.7 مل.
- تخلص من شظايا الحمض النووي باستخدام 10 ميكرولتر من Buffer EB.
- دع العمود يقف لمدة 1 دقيقة في RT.
- جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة عند 17,900 × جم في RT لتقليب الحمض النووي.
6. تضخيم PCR
ملاحظة: يعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي المنقول (الموسوم) ضروريا للتسلسل. تم استخدام محولات مجموعة Nextera (جدول المواد) في هذا المثال. يتم سرد البادئات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1.
- قم بإعداد تفاعل PCR التالي في أنابيب PCR سعة 200 ميكرولتر (50 ميكرولتر لكل عينة). خليط تفاعل PCR هو كما يلي: 10 ميكرولتر من الحمض النووي الممسوغ (الخطوة 5.) ، 2.5 ميكرولتر من محول 25 مللي متر 1 ، 2.5 ميكرولتر من محول 25 مللي متر 2 ، 25 ميكرولتر من مزيج PCR الرئيسي 2x ، و 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز
- تنفيذ برنامج تضخيم PCR الجزء 1 (الجدول 2).
ملاحظة: للتضخيم الأولي ، يتم استخدام نفس الظروف لجميع العينات باستخدام دورة حرارية قياسية. - qPCR في الوقت الحقيقي (إجمالي 14.5 ميكرولتر لكل عينة)
- باستخدام 5 ميكرولتر من المنتج من الجزء 1 من تضخيم PCR (الخطوة 6.2.) ، قم بإعداد التفاعل التالي ، هذه المرة بما في ذلك ذهب SYBR والكشف في جهاز PCR في الوقت الفعلي.
- تحضير خليط تفاعل PCR على النحو التالي: 5 ميكرولتر من منتج PCR من الخطوة 6.2 ، 0.75 ميكرولتر من ذهب SYBR (1000x مخفف) ، 5 ميكرولتر من مزيج PCR الرئيسي 2x ، و 3.75 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
ملاحظة: يتم تحديد أرقام الدورات الدقيقة لتضخيم المكتبة قبل الوصول إلى التشبع لكل عينة بواسطة qPCR (الجدول 3) لتقليل GC وتحيز الحجم في PCR10. تم تخفيف SYBR Gold بالماء الخالي من النيوكلياز. لصنع المحلول المخفف ، تمت إضافة 1 ميكرولتر من SYBR Gold (تركيز المخزون 10000x) إلى 999 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. وقت تشغيل RT-qPCR المذكور في الجدول 3 حوالي 60 دقيقة.
- حدد العدد المطلوب من دورات PCR الإضافية باستخدام معلمات التشغيل من الخطوة 6.3.
- عدد الدورات = 1/4 الحد الأقصى لشدة التألق (المشبعة) (عادة 3 أو 4 دورات PCR)
- برنامج تضخيم PCR الجزء 2 (الحجم = 45 ميكرولتر ؛ الجدول 4): بمجرد تحديد رقم الدورة ، قم بإعداد PCRs مع دورات إضافية محسوبة في الخطوة 6.4.1. على سبيل المثال ، إذا كان رقم الدورة المحسوب هو 3 ، فقم بإعداد 3 دورات في البرنامج أدناه. سيكون إجمالي الدورات 8 (5 في الخطوة 6.2 ، بالإضافة إلى 3 دورات إضافية في الخطوة 6.5.)
7. تنقية الخرز
ملاحظة: هنا ، تم استخدام حبات AMPure XP (جدول المواد).
- إلى منتجات PCR التي تم تضخيمها في الخطوة السابقة ، أضف 150 ميكرولتر من الخرز في RT.
ملاحظة: يمكن استخدام حبات AMPure14 محلية الصنع في هذه العملية. - احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
- ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية.
- اغسل الخرز ب 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪.
ملاحظة: يجب تحضير 80٪ من الإيثانول طازجا. - كرر الخطوة 7.4.
- قم بإزالة الإيثانول تماما.
- جفف العينات في الهواء لمدة 10 دقائق في RT.
- أعد التعليق باستخدام 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف (10 مللي مول Tris-HCL pH 8.0).
- كرر تنقية الخرز (الخطوات 7.1.-7.9.) لتقليل التلوث التمهيدي بشكل أكبر.
8. تركيز الحمض النووي وفحص الجودة
- قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات قياس كمية الحمض النووي (جدول المواد).
- تحقق من شظايا الحمض النووي المضخمة عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي باستخدام SYBR Gold (0.5x TBE ، 1.5٪ هلام الأغاروز) أو نظام الرحلان الكهربائي الآلي (على سبيل المثال ، TapeStation ، المحلل الحيوي).
9. التسلسل
- قم بإجراء تسلسل عالي الإنتاجية باستخدام عينات الحمض النووي المضخمة12,13.
ملاحظة: عينات الحمض النووي المضخمة جاهزة للتسلسل عالي الإنتاجية. للاحتفاظ بمعلومات شظايا الحمض النووي النووي ، يوصى بالتسلسل المزدوج على التسلسل أحادي النهاية. يشير كلا طرفي شظايا الحمض النووي إلى مكان ارتباط الترانسبوزاز. لرسم خرائط لمناطق الكروماتين المفتوحة ، عادة ما تكون 30 مليون قراءة / عينة كافية.
10. تحليل البيانات
- فلترة البيانات استنادا إلى جودة المكالمة الأساسية: اضبط الحد الأدنى لمتوسط نقاط الجودة الأساسية على 20 (دقة 99٪).
- تشذيب المحول: قم بإزالة تسلسلات المحول باستخدام أداة مناسبة.
ملاحظة: تم استخدام أداة التغليف Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) لإزالة تسلسلات المحول. بالنسبة لمكتبات ATAC-seq التي أعدتها Illumina Tn5 ، يتم استخدام التسلسل التالي كتسلسل محول: CTGTCTCTTATACACATCT. يتم تعيين الحد الأدنى لطول التسلسل للتعرف على تلوث المحول على 5. - رسم خرائط الجينوم: قم بتعيين القراءات إلى الجينوم المناسب باستخدام Bowtie باستخدام المعلمات التالية "-I 0 -X 2000 -m 1"15. فيما يلي مثال على جودة الخرائط من خلايا سرطان الثدي القاعدية MDA-MB-231:
يقرأ مع محاذاة واحدة على الأقل تم الإبلاغ عنها: 52.79٪
القراءات التي فشلت في المحاذاة: 13.10٪
يقرأ مع المحاذاة التي تم قمعها بسبب -m: 34.11٪ - إلغاء البيانات المكررة: ضع علامة على تكرارات PCR بواسطة أدوات Picard16.
- إنشاء ملف تغطية الجينوم لتصور البيانات: تحويل القراءات المزدوجة غير المكررة إلى أجزاء قراءة أحادية النهاية. يتم الحصول على مسارات تغطية الجينوم باستخدام GenomeCoverageBed من أدوات السرير17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للحصول على بيانات ATAC-seq ناجحة وعالية الجودة ، من المهم تحسين الظروف التجريبية. يمكن فصل إعداد مكتبة ATAC-seq إلى خمس خطوات رئيسية (الشكل 1) ، وهي تحلل الخلايا ، ووضع العلامات (التجزئة وإدخال المحول بواسطة Tn5) ، وتنقية الحمض النووي الجينومي ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتحليل البيانات. كعملية أولية ، يجب أولا تحسين المخزن المؤقت لتحلل الخلية (العزل النووي) لكل نوع من الخلايا. تم استخدام المخزن المؤقت منخفض التوتر الموصوف في ورقة ATAC-seqالأصلية 8 أو المخزن المؤقت CSK12,13 لتحليل خلايا سرطان الثدي. يمكن استخدام تلطيخ التريبان الأزرق لتأكيد عزل النوى18. لإعداد مكتبة ATAC-seq في خطوط الخلايا السرطانية البشرية مثل خلايا MDA-MB-231 و T47D و MCF7 و A375 ، تم استخدام المخزن المؤقت CSK من قبل مجموعات متعددة12،13،19،20. تم استخدام المخزن المؤقت CSK أيضا لإعداد مكتبة ATAC-seq في أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الجذعية الجنينية21،22 وخلايا ذبابة الفاكهة S2 23. لتحسين المخزن المؤقت للتحلل ، يعد تلطيخ Trypan الأزرق مفيدا لتقييم كفاءة تحلل الخلية. عندما تم علاج NMuMG ، الخلايا الظهارية للغدة الثديية للفأر غير السرطانية ، باستخدام المخزن المؤقت منخفض التوتر8 (انظر الخطوة 1) ومخزن CSK المؤقت ، لوحظت كفاءة تحلل الخلايا الأعلى في الخلايا المعالجة ب CSK (الشكل 2). بالنسبة للأنسجة المجمدة ، ثبت أن Omni-ATAC يحسن إشارات ATAC-seq24. في Omni-ATAC ، يتم استخدام مخزن مؤقت يحتوي على 0.1٪ NP40 و 0.1٪ Tween-20 و 0.01٪ Digitonin لتحلل الخلايا. على الرغم من أنه من المعروف أن المخزن المؤقت القائم على Digitonin يقلل من جزء الحمض النووي للميتوكوندريا ، فقد ثبت أن نسب الإشارة إلى الضوضاء وعدد قراءة TSS من ATAC-seq مع المخزن المؤقت CSK أفضل من تلك الموجودة في Omni-ATAC في خلايا سرطان الثدي12. لذلك ، تركز بقية هذه المخطوطة بشكل أساسي على النتائج من بيانات ATAC-seq مع المخزن المؤقت CSK.
بعد تحديد أفضل ظروف المخزن المؤقت لتحلل الخلايا (العزل النووي) ، من المهم تحسين النسب بين رقم خلية الإدخال وتركيز Tn5 transposase12,25. عادة ، يمكن معايرة تركيز Tn5 عن طريق تغيير حجم Tn5 من 1.25 ميكرولتر ، 2.5 ميكرولتر ، إلى 5 ميكرولتر في حجم إجمالي يبلغ 25 ميكرولتر خليط تفاعل. بدلا من ذلك ، يمكن تغيير أرقام خلايا الإدخال (على سبيل المثال ، من 10000 إلى 100000) ، مع الحفاظ على إنزيم Tn5 دون تغيير عند 2.5 ميكرولتر لتحسين تفاعل علامة Tn5. لتقييم جودة مكتبات ATAC-seq وكفاءة هضم الكروماتين الناجم عن Tn5 ، يمكن تحليل منتجات PCR بالمكتبة عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز. يوضح الشكل 3 أمثلة على مكتبات ATAC-seq الناجحة. عادة ، يؤدي تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ل 8 أو 9 دورات (إجمالي دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل الأولي) إلى تركيز مكتبة ATAC-seq بمقدار 3-6 نانوغرام / ميكرولتر. نظرا لأن Tn5 "يهاجم" بشكل تفضيلي المناطق الخالية من النيوكليوسومات في الكروماتين المفتوح (الشكل 1) ، يجب أن تكون سلالم النيوكليوسوم واضحة على صورة الهلام (الشكل 3). يمكن استخدام بروميد الإيثيديوم أو SYBR Gold للكشف عن الحمض النووي المضخم على هلام الأغاروز.
بعد ذلك ، يمكن استخدام تحليل qPCR باستخدام مكتبات ATAC-seq للتحقق بإيجاز من جودة المكتبات وإثراء الشظايا في مناطق الكروماتين المفتوحة مثل مروجي الجينات النشطة (الشكل 4). يمكن تصميم البادئات لتوليد مضخمات <80 bp باستخدام مروجي الجينات النشطة المعروفة كعناصر تحكم إيجابية ومناطق الكروماتين المعروفة "المغلقة" (غير النشطة) كعناصر تحكم سلبية (الشكل 4 أ). من بين الظروف التي تم اختبارها ، لوحظ إثراء أعلى في مكتبات T47D ATAC-seq مع مخزن CSK المؤقت (الشكل 4B). كما هو متوقع ، وجدنا المزيد من التخصيب باستخدام البادئات K و L في منطقة محفز الجينات لمستقبلات هرمون الاستروجين ألفا (ESR1) بالنسبة إلى منطقة مغلقة في المنبع من ESR1 مع التمهيدي C (الشكل 4B)26. يوضح الشكل 5 أمثلة على بيانات ATAC-seq بتركيزات مختلفة من Tn5 (تم استخدام 25000 خلية). في هذه الحالة ، تم اكتشاف ضوضاء خلفية أعلى في أدنى حالة (1.25 ميكرولتر من Tn5) Tn5 (الشكل 5 ، الأشرطة الرأسية). أظهرت بيانات ATAC-seq من 2.5 ميكرولتر أو 5 ميكرولتر من Tn5 مستويات مماثلة من إشارات ATAC-seq في مناطق الكروماتين المفتوحة ذات إشارات الخلفية المنخفضة. بالنظر إلى الإفراط في الهضم المحتمل بواسطة Tn5 بتركيز أعلى ، يمكن الاستنتاج أن 2.5 ميكرولتر من Tn5 مناسب لهذا النوع من الخلايا.
أجرينا أيضا ATAC-seq باستخدام أرقام خلايا مختلفة في خلايا NMuMG ، والتي تستخدم بشكل متكرر لدراسة الانتقال الظهاري - اللحمة المتوسطة (الشكل 6). لتحسين حجم البداية ، تم استخدام أربعة أرقام خلايا مختلفة (25000 و 50000 و 75000 و 100000) لتحسين مكتبة ATAC-seq. تم تحليل الخلايا باستخدام محلول CSK ، وتم تحضين النوى ب 2.5 ميكرولتر من ترانسبوزاز Tn5 في 25 ميكرولتر من خليط التفاعل. لاستكشاف فعالية الهضم Tn5 والسلالم النووية ، تم تحليل توزيع حجم الحمض النووي المدرج بشكل معلوماتي حيوي (الشكل 6 أ). عندما تم استخدام أرقام خلايا أقل ، كانت شظايا الحمض النووي الخالية من النيوكليوسومات (<100 bp) أكثر إثراء في بيانات التسلسل. من ناحية أخرى ، كان جزء شظايا الحمض النووي أحادي النواة (175-225 bp) أقل في عينات مدخلات الخلايا المنخفضة (25000 خلية و 50000 خلية) مقارنة بظروف إدخال الخلية الأعلى (75000 خلية و 100000 خلية). على الرغم من ملاحظة أنماط شظايا الحمض النووي التفاضلية بين العينات ، يبدو أن رقم خلية الإدخال له تأثير ضئيل على إثراء إشارات ATAC-seq في المروجين ومناطق الكروماتين المفتوحة الأخرى (الشكل 6 ب). لمزيد من التحقيق في تأثير أرقام خلايا الإدخال على تحليل المصب ، تم تحديد قمم ATAC-seq. تم تحديد قمم ATAC-seq بواسطة برنامج استدعاء ذروة PeaKDEck27 باستخدام المعلمات التالية: -sig 0.0001 -bin 300 -back 3,000 -npBack 2,500,000. من ~ 4.9 مليون قراءة مرسومة بشكل فريد ، لوحظت 38,878 و 43,832 و 41,509 و 45,530 قمة في بيانات ATAC-seq من 25,000 و 50,000 و 75,000 و 100,000 مدخل خلية ، على التوالي. أظهرت حالة إدخال 100000 خلية أكبر عدد من القمم. نظرا لاستخدام درجة إثراء موقع بدء النسخ (TSS) لتقييم جودة بيانات ATAC-seq ، تم حساب درجة TSS لكل حالة ATAC-seq باستخدام برنامج GitHub: Jiananlin / TSS_enrichment_score_calculation28. كانت درجات TSS لشروط إدخال الخلايا 25,000 و 50,000 و 75,000 و 100,000 خلية 9.03 و 9,02 و 8.82 و 8.28 على التوالي (تعتبر درجة إثراء TSS مثالية إذا كانت أكبر من 728). يشير هذا إلى انخفاض تدريجي في درجة إثراء TSS مع زيادة أعداد الخلايا. بينما لوحظ أكبر عدد ذروة في حالة إدخال 100000 خلية ، أعطت حالة إدخال 25000 خلية درجة TSS أفضل. أشار تحليل التعليقات التوضيحية للذروة بواسطة Homer29 إلى أن غالبية القمم المتزايدة مصنفة على أنها قمم بعيدة عن المروج (الشكل 6C). بناء على هذه النتائج ، يمكن استنتاج أن مدخلات رقم الخلية الأعلى يمكن أن تنتج عددا أكبر من القمم وتكتشف بشكل متكرر القمم غير المروجة مقارنة بمدخلات رقم الخلية الأدنى في هذه الحالة.
الشكل 1: الخطوط العريضة لطريقة ATAC-seq. (أ) يقيس ATAC-seq إمكانية الوصول إلى الكروماتين باستخدام ترانسبوزاز Tn5 مفرط النشاط محمل مسبقا بمحولات أمامية وخلفية. تشمل الخطوات المختلفة في العملية (ب) تحلل الخلية (بما في ذلك تحسين تكوين المخزن المؤقت للتحلل ، ومعايرة Tn5 ، وعدد الخلايا المستخدمة) ؛ (ج) التحويل (ربط Tn5 بالكروماتين المفتوح / الذي يمكن الوصول إليه) ؛ (د) وضع علامات على الكروماتين؛ (ه) تنقية شظايا الحمض النووي وتضخيم المكتبات ، و (و) تسلسل المكتبات وتحليل البيانات. يظهر تحليل توزيع طول الشظايا لمكتبات ATAC-seq عادة ذروة أولية حوالي ~ 50 نقطة أساس (مناطق خالية من النيوكليوسوم) وذروة أخرى عند ~ 200 نقطة أساس (أحادي النوكليوسوم). لذلك ، بدون ترشيح الحجم الحسابي أو التجريبي ، تحتوي إشارات ATAC-seq على مناطق خالية من النيوكليوسومات ومناطق نووية في الكروماتين المفتوح. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مقارنة كفاءة تحلل الخلايا باستخدام التريبان الأزرق. (أ) عولجت خلايا NMuMG بالمخزن المؤقت منخفض التوتر8 وصبغت باللون الأزرق المثقب. (ب) عولجت خلايا NMuMG بمحلول CSK وصبغت باللون الأزرق المثقب. تشير أشرطة المقياس إلى 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحليل شظايا الحمض النووي المضخم لمكتبات ATAC-seq. تم تحضير مكتبات ATAC-seq من خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231. (أ) بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تم تحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على 0.5x TBE ، 1.5٪ هلام الأغاروز قبل وبعد تنقية الخرز. تتم إزالة الاشعال في الغالب عن طريق تنقية الخرز الأولي. يشار أيضا إلى أنماط نطاق الحمض النووي من (B) 1x TAE ، و 1٪ من هلام الأغاروز الكهربائي و (C) رحلان كهربائي آلي. تم استخدام SYBR Gold لتصور شظايا الحمض النووي الموضحة في A و B. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تحليل إثراء مكتبات ATAC-seq . (أ) مسار متصفح الجينوم يوضح موضع ESR1. تظهر تغطية الجينوم لبيانات ATAC-seq في خلايا T47D20 . تم استخدام مواد أولية من منشور سابق26 ، وتم تمييز المناطق المستهدفة باللون الأصفر. (ب) رسم بياني شريطي يصور إثراء أمبليكون التمهيدي في مكتبات ATAC-seq. تم إعداد مكتبات ATAC-seq بواسطة المخزن المؤقت منخفض التوتر أو المخزن المؤقت CSK. كما تم استخدام تركيزات مختلفة من Tn5 لإنشاء مكتبات ATAC-seq. تم استخدام 1 نانوغرام من كل مكتبة لأداء qPCR. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تصور متصفح الجينوم لتحسين ATAC-seq. تمت إضافة كميات مختلفة من ترانسبوزاز Tn5 أثناء إعداد المكتبة. يظهر 1.25 ميكرولتر من حالة Tn5 إشارات خلفية أعلى (مظللة باللون الأصفر) ، بينما تبدو الحالتان الأخريان متشابهتين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: توزيع حجم شظية الحمض النووي لمكتبات ATAC-seq. (أ) تم إعداد مكتبات ATAC-seq باستخدام أرقام الخلايا المشار إليها. أظهرت بيانات ATAC-seq من حالة إدخال 25000 خلية أعلى إثراء للشظايا الخالية من النيوكليوسوم ، في حين قدمت حالة إدخال 100000 خلية أعلى الحمض النووي أحادي النواة. (ب) مسارات متصفح الجينوم التي تعرض بيانات ATAC-seq من أرقام خلايا مختلفة. (ج) تحليل ذروة شرح هوميروس. تم تصنيف كل قمة على أنها قمة قريبة أو بعيدة بواسطة هوميروس29. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| اسم | تسلسل |
| ESR1 C إلى الأمام | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C عكس | CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC |
| ESR1 K إلى الأمام | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K عكس | TGTCTCTCTCTCTGTTTGATTCCC |
| ESR1 L إلى الأمام | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L عكس | كاتاكاااغتغكغكغغاك |
الجدول 1: قائمة البادئات المستخدمة في هذه الدراسة.
| الخطوات | درجة الحرارة | الوقت | دور |
| سد الفجوة | 72 درجة مئوية | 5 دقائق | 1 |
| تمسخ أولي | 98 درجة مئوية | 30 ثانية | 1 |
| تمسخ | 98 درجة مئوية | 10 ثانية | 5 |
| الصلب | 63 درجة مئوية | 30 ثانية | |
| امتداد | 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| مسك | 4 درجة مئوية | إلى الأبد |
الجدول 2: برنامج تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الجزء 1.
| الخطوات | درجة الحرارة | دور |
| تمسخ أولي | 98 درجة مئوية 30 ثانية | 1 |
| تمسخ | 98 درجة مئوية 10 ثوان | 20 |
| الصلب | 63 درجة مئوية 30 ثانية | |
| امتداد | 72 درجة مئوية 1 دقيقة | |
| قراءة اللوحة |
الجدول 3: إعدادات qPCR.
| الخطوات | درجة الحرارة | الوقت | دور |
| تمسخ أولي | 98 درجة مئوية | 30 ثانية | 1 |
| تمسخ | 98 درجة مئوية | 10 ثانية | إجمالي الدورات المحسوبة في الخطوة 6.4 |
| الصلب | 63 درجة مئوية | 30 ثانية | |
| امتداد | 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| مسك | 4 درجة مئوية | إلى الأبد |
الجدول 4: برنامج تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الجزء 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم استخدام ATAC-seq على نطاق واسع لرسم خرائط مناطق الكروماتين المفتوحة والنشطة. غالبا ما يكون تقدم الخلايا السرطانية مدفوعا بالتغيرات الجينية وإعادة البرمجة اللاجينية ، مما يؤدي إلى تغيير إمكانية الوصول إلى الكروماتين والتعبير الجيني. يظهر مثال على إعادة البرمجة هذه أثناء الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة (EMT) وعمليتها العكسية ، الانتقال من اللحمة المتوسطة إلى الظهارة (MET) ، والتي تعرف بأنها عمليات إعادة برمجة خلوية رئيسية أثناء ورم خبيثالورم 30. مثال آخر هو اكتساب مقاومة للأدوية ضد العلاجات الهرمونية غالبا ما يلاحظ في أورام الثدي اللمعية31. ATAC-seq مفيد لمراقبة مثل هذه التغيرات المظهرية للخلية على مستوى الكروماتين ويمكن استخدامه للتنبؤ بخلية المنشأ والأنواع الفرعيةللسرطان 4.
لقياس إعادة تشكيل الكروماتين بدقة بواسطة ATAC-seq ، من الضروري إنشاء بروتوكول قابل للتكرار ومتسق. في هذه المخطوطة ، تم وصف استراتيجية قياسية لتحسين مكتبة ATAC-seq. يتم استخدام بيانات ATAC-seq من خطوط خلايا MDA-MB-231 و NMuMG كأمثلة على عمليات التحسين. تم استخدام خلايا NMuMG لدراسة EMT ، وتم استخدام خلايا MDA-MB-231 لدراسة عمليتها العكسية ، MET. تم استخدام هذه النماذج الخلوية سابقا لدراسة التغيرات اللاجينية خلال EMT و MET13,32. يعد استخدام مخزن مؤقت مناسب لتحلل الخلايا وتركيز Tn5 هو المكون الرئيسي لإعداد مكتبة ATAC-seq بنجاح. بالإضافة إلى هذه المكونات ، فإن نسبة عالية (>90٪) من صلاحية الخلية ، وتركيزات مناسبة من المنظفات في المخزن المؤقت للتحلل ، وإعداد تعليق الخلية الواحدة مهمة جدا أيضا. عندما تختلف كفاءة هضم Tn5 اختلافا كبيرا عبر العينات ، يكون من الصعب تصحيح اختلافات البيانات. ويرجع ذلك إلى عدم وجود ضوابط داخلية وخارجية لتقييم كفاءة الهضم كميا. قد تختلف الخصائص أو الخصائص الخلوية أيضا بين الخلايا من المجموعة الضابطة مقابل الخلايا من مجموعة الاختبار. لذلك ، من الضروري النظر بعناية في الظروف التجريبية ، بما في ذلك اختيار المخزن المؤقت للتحلل ، للحصول على بيانات ATAC-seq عالية الجودة من كلتا المجموعتين التجريبيتين (الشكل 5 والشكل 6).
إلى جانب التنميط الكروماتين المفتوح ، تم استخدام ATAC-seq لتحديد آثار أقدام عامل النسخ وتحديد موضع النيوكليوسوم 8,33. من المهم ملاحظة أن هذه المعلومات مشتقة في الغالب من مناطق الكروماتين المفتوحة (الشكل 1F). ومن ثم، فإن النتائج ستكون منحازة نحو مناطق الكروماتين المفتوحة. ومع ذلك ، فإن ATAC-seq هي أداة قوية لدراسة بنية الكروماتين. تم اعتماد هذه الأداة الثورية مؤخرا لعلم الجينوم أحادي الخلية وتستمر في المساهمة في تحسين فهمنا لتنظيم الجينات وبيولوجيا الكروماتين.
توفر البيانات:
البيانات المقدمة في هذا البروتوكول متاحة في Gene Expression Omnibus تحت رقم الانضمام GSE202791. كما تم استخدام بيانات ATAC-seq من GSE72141 و GSE99479 في التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح مالية ذات صلة أو مادية تتعلق بالبحث الموصوف في هذه الورقة.
Acknowledgments
ونعرب عن امتناننا لمرفق UND Genomics Core للمساعدة التقنية المتميزة.
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [P20GM104360 إلى M.T. ، P20 GM104360 إلى AD] وأموال البدء المقدمة من كلية الطب والعلوم الصحية بجامعة نورث داكوتا ، قسم العلوم الطبية الحيوية [إلى M.T.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
