Summary
ATAC-seq是一种DNA测序方法，它使用过度活跃的突变转座酶Tn5来绘制由转录因子介导的染色质可及性的变化。ATAC-seq能够发现癌细胞表型改变的分子机制。该协议概述了上皮细胞类型（包括癌细胞）中ATAC-seq的优化程序。
Abstract
转座酶可接近染色质的高通量测序 （ATAC-seq） 测定使用高活性 Tn5 转座酶探测脱氧核糖核酸 （DNA） 可及性。Tn5切割和连接接头，用于在可访问的染色质区域内进行高通量测序。在真核细胞中，基因组DNA被包装成染色质，染色质是DNA，组蛋白和其他蛋白质的复合物，其作为转录机制的物理屏障。为了响应外在信号，转录因子招募染色质重塑复合物，以便能够进入转录机制进行基因激活。因此，在监测生物事件（如癌症进展）期间的增强子和基因启动子活性时，识别开放的染色质区域是有用的。由于该协议易于使用且细胞输入要求低，因此ATAC-seq已广泛用于定义各种细胞类型（包括癌细胞）中的开放染色质区域。为了成功进行数据采集，在准备ATAC-seq库时需要考虑几个参数。其中，细胞裂解缓冲液的选择、Tn5酶的滴定和细胞的起始体积对于癌细胞中的ATAC-seq文库制备至关重要。优化对于生成高质量数据至关重要。在这里，我们详细介绍了上皮细胞类型的ATAC-seq优化方法。
Introduction
染色质可及性是在全基因组范围内调节基因表达的关键要求1。染色质可及性的变化通常与几种疾病状态有关，包括癌症2，3，4。多年来，已经开发了许多技术，使研究人员能够通过绘制染色质可及性区域来探测染色质景观。其中一些包括DNase-seq（DNase I超敏位点测序）5，FAIRE-seq（甲醛辅助分离调控元件）6，MAPit（单个模板的甲基转移酶可及性协议）7，以及本文的重点ATAC-seq（转座酶可接近染色质的测定）8。DNase-seq通过采用DNase的一个关键特征来绘制可访问的区域，即优先消化不含组蛋白和其他蛋白质（如转录因子）的裸DNA。FAIRE-seq与ChIP-seq类似，利用甲醛交联和超声处理，但不涉及免疫沉淀，并且通过苯酚-氯仿提取分离无核小体区域6。MAPit方法使用GC甲基转移酶以单分子分辨率7探测染色质结构。ATAC-seq依赖于过度活跃的转座酶Tn58。Tn5转座酶优先结合开放的染色质区域，并将测序接头插入可访问的区域。Tn5通过DNA介导的“剪切和粘贴”机制起作用，其中预加载有适配器的转座酶与打开的染色质位点结合，切割DNA，并连接接头8。Tn5结合区域通过使用退火到这些接头的引物进行PCR扩增来回收。FAIRE-seq 和 DNase-seq 在测序9 之前需要大量的起始材料（~100，000 个细胞至 225，000 个细胞）和单独的文库制备步骤。另一方面，ATAC-seq协议相对简单，需要少量细胞（<50，000个细胞）10。与FAIRE-seq和DNase-seq技术不同，ATAC-seq的测序文库制备相对容易，因为分离的DNA样品已经被Tn5用测序接头标记。因此，只需使用适当引物的PCR扩增步骤即可完成文库制备，无需执行末端修复和接头连接等先前的处理步骤，从而节省时间11。其次，ATAC-seq 避免了使用 MAPit7 所需的区域特异性引物进行亚硫酸氢盐转化、克隆和扩增的需要。由于这些优点，ATAC-seq已成为定义开放染色质区域的一种非常流行的方法。尽管ATAC-seq方法很简单，但需要优化多个步骤才能获得高质量和可重现的数据。本文讨论了标准ATAC-seq文库制备的优化程序，特别强调了三个参数：（1）裂解缓冲液组成，（2）Tn5转座酶浓度和（3）细胞数。此外，本文还提供了使用癌性和非癌性贴壁上皮细胞的优化条件的示例数据。
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Protocol
1. 实验开始前的准备工作
- 准备裂解缓冲液原液。
注意：每种细胞类型的最佳核隔离缓冲液可能不同。我们建议使用台盼蓝染色检测原始论文8 中使用的低渗缓冲液和每种细胞类型的CSK缓冲液12，13 。- 为了制备低渗缓冲液（绿叶缓冲液），混合10 mM Tris-HCl pH 7.4，10 mM NaCl，3 mM MgCl2和0.1%NP-40。
- 要制备CSK缓冲液，请混合10 mM PIPES pH 6.8，100 mM NaCl，300 mM蔗糖，3 mM MgCl2和0.1%Triton X-100。
- 确保细胞培养条件最佳;在光学显微镜下检查细胞，以确保细胞凋亡水平没有升高。
- 打开离心机使其达到4°C。
2. 细胞收获
- 以 <80% 汇合度从细胞培养物中吸出培养基。细胞通常在 35 mm 或 60 mm 培养皿中生长，具体取决于所需的细胞数量、处理等。
- 用 1 mL 或 3 mL PBS 洗涤细胞。
- 加入 0.5 mL 或 1 mL 胰蛋白酶并孵育 2-3 分钟（取决于细胞类型）。小心地使用 1 mL 移液器充分混合。
- 向板中加入 1 mL 或 2 mL 培养基并充分混合。转移到 15 mL 锥形管中。将细胞在 15 mL 管中以 300 x g 离心 3 分钟 。
注意： 建议使用水平吊斗转子，以最大程度地减少电池损失。 - 吸出培养基并将细胞重悬于 1 mL 或 2 mL 培养基中。
注意：制备均质单细胞溶液至关重要。对于组织，Dounce 均质机可用于均质组织并最大限度地减少大细胞团块或聚集体。一些组织需要过滤（例如，细胞过滤器）和/或FACS细胞分选以分离活细胞并获得单细胞溶液。 - 使用细胞计数器计数细胞。
注意：在本研究中，使用了自动细胞计数器（材料表）。 - 在室温（RT）下以300×g离心所需的细胞体积（例如，基于细胞计数的包含1 x 106个细胞的体积）3分钟。
- 将含有 1 x 106 个细胞的细胞沉淀重悬于 1 mL 冷 PBS 中。
注意：如果细胞数量小于1 x 10 6个细胞，请减少冷PBS体积以制备相同浓度（1 x 106个细胞/ mL）的细胞溶液。
3. 细胞裂解
- 将 25 μL（= 2.5 x 104 个细胞）转移到新的 1.7 mL 微量离心管中。在4°C下以500× g 离心5分钟，小心地弃去上清液
注意： 建议使用水平吊斗转子，以最大程度地减少电池损失。留下约3μL上清液以确保细胞不被丢弃。 - 加入 25 μL 裂解缓冲液，通过轻轻上下移液重悬细胞。在冰上孵育5分钟
- 在4°C下以500× g 离心5分钟，小心地弃去上清液。
注意： 建议使用水平吊斗转子，以最大程度地减少电池损失。留下约3μL上清液以确保细胞不被丢弃。
4. Tn5标签
- 立即将沉淀重悬于25μL的Tn5反应混合物中。Tn5 反应混合物如下：12.5 μL 2x 标记 DNA 缓冲液（TD 缓冲液）、1.25-5 μL Tn5转座酶和 11.25-7.5 μL 无核酸酶水。
注意：Tn5 的标准浓度为 2.5 μL，适用于 2.5 x 104 个细胞。 - 在37°C孵育30分钟。
注意：每10分钟混合一次溶液。
5. 脱氧核糖核酸纯化
注意：扩增前需要纯化。DNA纯化使用MinElute PCR纯化试剂盒（材料表）完成。
- 加入 5 μL 3 M 乙酸钠 （pH 5.2）。
- 立即加入 125 μL 缓冲液 PB 并充分混合。
- 遵循从步骤 2 开始的 PCR 纯化试剂盒方案。
- 将离心柱放入 2 mL 收集管中。
- 将样品施加到离心柱上，并在室温下以17，900× g 离心1分钟。
- 丢弃流通物并将离心柱放回同一收集管中。
- 向离心柱中加入 750 μL 缓冲液 PE，并在室温下以 17，900 x g 离心 1 分钟。
- 丢弃流通物并将离心柱放回同一收集管中。
- 将离心柱离心5分钟以使膜完全干燥。
- 丢弃流通物并将离心柱放入新的 1.7 mL 微量离心管中。
- 用 10 μL 缓冲液 EB 洗脱 DNA 片段。
- 让柱子在室温下静置1分钟。
- 在室温下以17，900 x g 离心1分钟以洗脱DNA。
6. PCR扩增
注意：转座（标记）DNA的PCR扩增对于测序是必要的。本例中使用了Nextera套件适配器（材料表）。本研究中使用的引物列于 表1中。
- 在 200 μL PCR 管（每个样品 50 μL）中设置以下 PCR 反应。PCR反应混合物如下：10 μL 洗脱 DNA（步骤 5.）、2.5 μL 25 mM 适配器 1、2.5 μL 25 mM 适配器 2、25 μL 2x PCR 预混液和 10 μL 无核酸酶水
- 执行PCR扩增程序第1部分（表2）。
注意：对于初始扩增，使用标准热循环仪的所有样品使用相同的条件。 - 实时 qPCR（每个样品总计 14.5 μL）
- 使用来自PCR扩增部分1（步骤6.2.）的5μL产物，设置以下反应，这次包括SYBR金并在实时PCR机中进行检测。
- 按如下方式制备PCR反应混合物：步骤6.2.中的5μLPCR产物，0.75μLSYBR金（1000倍稀释），5μL2xPCR预混液和3.75μL无核酸酶水。
注意：每个样品在达到饱和之前文库扩增的精确循环数由qPCR（表3）确定，以减少PCR10中的GC和大小偏差。SYBR黄金用无核酸酶水稀释。为了制备稀释溶液，将 1 μL SYBR 金（储备浓度 10，000x）加入到 999 μL 无核酸酶水中。 表3 中提到的RT-qPCR的运行时间约为60分钟。
- 使用步骤6.3中的运行参数确定所需的额外PCR循环次数。
- 循环次数 = 1/4 最大（饱和）荧光强度（通常为 3 或 4 个 PCR 循环）
- PCR扩增程序第2部分（体积= 45μL; 表4）：确定循环次数后，使用步骤6.4.1计算的其他循环设置PCR。例如，如果计算的周期数为 3，请在下面的程序中设置 3 个周期。总周期为 8（步骤 6.2 中为 5，加上步骤 6.5 中的 3 个额外周期）。
7. 磁珠纯化
注意：这里使用了AMPure XP（材料表）珠子。
- 向上一步中扩增的PCR产物中，在室温下加入150 μL磁珠。
注意：在此过程中可以使用自制的AMPure珠14 。 - 在室温下孵育15分钟。
- 将试管放在磁性支架上5分钟。
- 小心地除去上清液。
- 用 200 μL 80% 乙醇洗涤珠子。
注意：80%乙醇应新鲜制备。 - 重复步骤 7.4。
- 完全除去乙醇。
- 在室温下风干样品10分钟。
- 用 50 μL 洗脱缓冲液 （10 mM Tris-HCL pH 8.0） 重悬。
- 重复磁珠纯化（步骤7.1.-7.9），以进一步减少引物污染。
8. DNA浓度和质量检查
- 使用核酸定量试剂盒测量DNA浓度（材料表）。
- 使用SYBR Gold（0.5x TBE，1.5%琼脂糖凝胶）或自动电泳系统（例如，TapeStation，生物分析仪）通过凝胶电泳检查扩增的DNA片段。
9. 排序
- 使用扩增的DNA样品12，13进行高通量测序。
注意：扩增的DNA样品可用于高通量测序。为了保留核小体DNA片段信息，建议使用配对末端测序而不是单端测序。DNA片段的两端指示转座酶结合的位置。对于绘制开放染色质区域的图谱，3000万次读取/样本通常就足够了。
10. 数据分析
- 基于基本呼叫质量的数据筛选：将最低平均基本质量分数设置为 20（准确率为 99%）。
- 适配器修整：使用适当的工具删除适配器序列。
注：修剪包装工具（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）用于删除适配器序列。对于由Illumina Tn5准备的ATAC-seq库，以下序列用作适配器序列：CTGTCTCTTATACACATCT。识别适配器污染的最小序列长度设置为 5。 - 基因组图谱：使用以下参数“-I 0 -X 2000 -m 1”15，将读数映射到带有Bowtie的适当基因组。MDA-MB-231基底乳腺癌细胞质量图谱示例如下：
至少报告一个对齐的读数：52.79%
无法对齐的读取：13.10%
由于 -m 而抑制对齐的读取：34.11% - 重复数据删除：使用皮卡德工具标记 PCR 重复项16.
- 生成用于数据可视化的基因组覆盖文件：将重复数据删除的配对端读取转换为单端读取片段。基因组覆盖跟踪是使用来自bedtools17的genomeCoverageBed获得的。
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Representative Results
为了获得成功和高质量的ATAC-seq数据，优化实验条件非常重要。ATAC-seq文库制备可分为五个主要步骤（图1），即细胞裂解、标记（通过Tn5片段化和接头插入）、基因组DNA纯化、PCR扩增和数据分析。作为初始过程，必须首先针对每种细胞类型优化细胞裂解（核分离）缓冲液。原始ATAC-seq论文8或CSK缓冲液12，13中描述的低渗缓冲液用于裂解乳腺癌细胞。台盼蓝染色可用于确认细胞核分离18。对于人癌细胞系（如MDA-MB-231、T47D、MCF7和A375细胞）中的ATAC-seq文库制备，CSK缓冲液已被多个组12，13，19，20使用。CSK缓冲液还用于其他细胞类型（如胚胎干细胞21，22和果蝇S2细胞23）的ATAC-seq文库制备。对于裂解缓冲液的优化，台盼蓝染色可用于评估细胞裂解效率。当用低渗缓冲液8（参见步骤1）和CSK缓冲液处理非癌性小鼠乳腺上皮细胞NMuMG时，在CSK处理的细胞中观察到更高的细胞裂解效率（图2）。对于冷冻组织，Omni-ATAC已被证明可以改善ATAC-seq信号24。在Omni-ATAC中，含有0.1%NP40、0.1%吐温-20和0.01%洋地黄皂苷的缓冲液用于细胞裂解。尽管已知基于洋地黄皂苷的缓冲液会降低线粒体DNA的比例，但ATAC-seq与CSK缓冲液的信噪比和TSS读取计数在乳腺癌细胞中被证明优于Omni-ATAC的信噪比和TSS读取计数12。因此，本手稿的其余部分主要集中在带有CSK缓冲区的ATAC-seq数据的结果上。
在确定最佳细胞裂解缓冲液（核分离）条件后，优化输入细胞数与Tn5转座酶浓度12，25之间的比率非常重要。通常，Tn5浓度可以通过在25 μL总体积的25 μL反应混合物中将Tn5的体积从1.25 μL、2.5 μL变化到5 μL来滴定。或者，可以改变输入细胞数（例如，从10，000到100，000），同时将Tn5酶保持在2.5μL不变，以优化Tn5标记反应。为了评估ATAC-seq文库的质量和Tn5诱导的染色质消化效率，可以通过琼脂糖凝胶电泳分析文库PCR产物。 图 3 显示了成功的 ATAC-seq 库的示例。通常，8 或 9 个循环（包括初始 PCR 的总 PCR 循环）的 PCR 扩增可产生 3-6 ng/μL ATAC-seq 文库浓度。由于Tn5优先“攻击”开放染色质处的无核小体区域（图1），因此核小体分子量标准在凝胶图像上应该很明显（图3）。溴化乙锭或SYBR金可用于检测琼脂糖凝胶上的扩增DNA。
接下来，使用ATAC-seq文库进行qPCR分析可用于简要检查文库的质量和开放染色质区域（如活性基因启动子）的片段富集（图4）。引物可以设计为使用已知活性基因的启动子作为阳性对照和已知的“封闭”（非活性）染色质区域作为阴性对照来产生<80 bp扩增子（图4A）。在测试条件下，在带有CSK缓冲液的T47D ATAC-seq文库中观察到更高的富集度（图4B）。正如预期的那样，我们发现在雌激素受体α（ESR1）基因启动子区域使用引物K和L相对于具有引物C的ESR1上游封闭区域进行更多的富集（图4B）26。图5显示了具有不同Tn5浓度（使用25，000个细胞）的ATAC-seq数据示例。在这种情况下，在最低（1.25 μL Tn5）Tn5条件下检测到较高的背景噪声（图5，竖条）。来自 2.5 μL 或 5 μL Tn5 的 ATAC-seq 数据显示，在背景信号较低的开放染色质区域，ATAC-seq 信号水平相似。考虑到 Tn5 在较高浓度下潜在的过度消化，可以得出结论，2.5 μL 的 Tn5 适用于这种细胞类型。
我们还使用NMuMG细胞中的不同细胞数进行了ATAC-seq，通常用于研究上皮 - 间充质转化（图6）。为了优化起始体积，使用了四种不同的细胞数（25，000、50，000、75，000 和 100，000）进行 ATAC-seq 文库优化。用CSK缓冲液裂解细胞，并将细胞核与2.5μLTn5转座酶在25μL反应混合物中孵育。为了探索Tn5消化和核小体分子量标准的有效性，对插入DNA的大小分布进行了生物信息学分析（图6A）。当使用较低的细胞数量时，无核小体DNA片段（<100 bp）在测序数据中更丰富。另一方面，与较高的细胞输入条件（75，000个细胞和100，000个细胞）相比，低细胞输入样品（25，000个细胞和50，000个细胞）中单核小体DNA片段（175-225 bp）的比例较低。尽管在样品之间观察到差异的DNA片段模式，但输入细胞数似乎对启动子和其他开放染色质区域的ATAC-seq信号富集的影响很小（图6B）。为了进一步研究输入细胞数对下游分析的影响，定义了ATAC-seq峰。ATAC-seq 峰值由 PeaKDEck 峰值调用程序27 使用以下参数确定：-sig 0.0001 -bin 300 -back 3，000 -npBack 2，500，000。从~490万次唯一映射读取中，在ATAC-seq数据中分别观察到来自25，000、50，000、75，000和100，000个细胞输入的38，878、43，832、41，509和45，530个峰。100，000 个单元格输入条件显示的峰数最多。由于转录起始位点 （TSS） 富集评分已用于评估 ATAC-seq 数据的质量，因此使用 GitHub 程序计算每个 ATAC-seq 条件的 TSS 评分：嘉南林/TSS_enrichment_score_calculation28。25，000、50，000、75，000 和 100，000 个细胞输入条件的 TSS 分数分别为 9.03、9，02、8.82 和 8.28（如果 TSS 富集分数大于 728，则被认为是理想的）。这表明随着细胞数量的增加，TSS富集评分逐渐下降。虽然在 100，000 个单元格输入条件下观察到的最大峰值数，但 25，000 个单元格输入条件的 TSS 评分更高。Homer29 的峰注释分析表明，大多数增加的峰被归类为启动子远端峰（图6C）。基于这些结果，可以得出结论，在这种情况下，与较低的细胞数输入相比，较高的细胞数输入可以产生更多的峰数，并且更频繁地检测非启动子峰。
图1：ATAC-seq方法的概述 。 （A）ATAC-seq使用预装有正向和反向适配器的过度活跃的Tn5转座酶测量染色质可及性。该过程的各个步骤包括（B）细胞裂解（包括优化裂解缓冲液组成，滴定Tn5和使用的细胞数量）;（C）转位（Tn5与开放/可及染色质结合）;（四）染色质的标记;（E）文库的DNA片段纯化和扩增，以及（F）文库的测序和数据分析。ATAC-seq文库的片段长度分布分析通常显示~50 bp（无核小体区域）附近的初始峰和~200 bp（单核小体）的另一个峰。因此，在没有计算或实验尺寸过滤的情况下，ATAC-seq信号在开放染色质中同时包含无核小体和核小体区域。用 BioRender.com 创建。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：使用台盼蓝的细胞裂解效率比较 。 （A）用低渗缓冲液8 处理NMuMG细胞并用台盼蓝染色。（B）用CSK缓冲液处理NMuMG细胞并用台盼蓝染色。比例尺表示 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：ATAC-seq 文库的扩增 DNA 片段分析。 ATAC-seq文库由MDA-MB-231乳腺癌细胞制备。（A）PCR扩增后，在磁珠纯化前后在0.5x TBE，1.5%琼脂糖凝胶上分析PCR产物。引物大多通过初始磁珠纯化去除。还指示来自 （B） 1x TAE、1% 琼脂糖凝胶电泳和 （C） 自动电泳的 DNA 条带图。SYBR Gold用于可视化 A 和 B中显示的DNA片段。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：ATAC-seq 文库的富集分析 。 （A）显示ESR1位点的基因组浏览器轨迹。图中显示了T47D细胞20 中ATAC-seq数据的基因组覆盖率。使用了先前出版物中的引物26，其靶区以黄色突出显示。（B）描述ATAC-seq文库中引物扩增子富集的条形图。ATAC-seq文库由低渗缓冲液或CSK缓冲液制备。不同浓度的Tn5也用于生成ATAC-seq文库。每个文库的1 ng用于进行qPCR。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：用于 ATAC-seq 优化的基因组浏览器可视化。 在文库制备过程中加入不同量的Tn5转座酶。1.25 μL Tn5 条件显示较高的背景信号（以黄色突出显示），而其他两种条件看起来相似。 请点击此处查看此图的大图。
图6：ATAC-seq文库的DNA片段大小分布 。 （A）使用指示的细胞编号制备ATAC-seq文库。来自25，000个细胞输入条件的ATAC-seq数据显示无核小体片段的富集最高，而100，000个细胞输入条件的单核小体DNA最高。（B）基因组浏览器轨迹显示来自不同细胞数的ATAC-seq数据。（C）荷马峰注释分析。每个峰被Homer29分类为启动子-近端或远端峰。 请点击此处查看此图的大图。
| 名字 | 序列 |
| ESR1 C 前向 | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C 反向 | CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC |
| ESR1 K 前进 | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K 反向 | TGTCTCTCTTTCTCTGTGTTTGATTCCC |
| ESR1 L 前进 | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L 反向 | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
表1：本研究中使用的引物列表。
| 步骤 | 温度 | 时间 | 周期 |
| 间隙填充 | 72 °C | 5 分钟 | 1 |
| 初始变性 | 98 °C | 30 秒 | 1 |
| 变性 | 98 °C | 10 秒 | 5 |
| 退火 | 63 °C | 30 秒 | |
| 外延 | 72 °C | 1 分钟 | |
| 拿 | 4°C | 永远 |
表2：PCR扩增程序第1部分。
| 步骤 | 温度 | 周期 |
| 初始变性 | 98 °C 30 秒 | 1 |
| 变性 | 98 °C 10 秒 | 20 |
| 退火 | 63 °C 30 秒 | |
| 外延 | 72 °C 1 分钟 | |
| 板读取 |
表 3：qPCR 设置。
| 步骤 | 温度 | 时间 | 周期 |
| 初始变性 | 98 °C | 30 秒 | 1 |
| 变性 | 98 °C | 10 秒 | 在步骤 6.4 计算的总周期数 |
| 退火 | 63 °C | 30 秒 | |
| 外延 | 72 °C | 1 分钟 | |
| 拿 | 4°C | 永远 |
表 4：PCR 扩增程序第 2 部分。
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Discussion
ATAC-seq已被广泛用于绘制开放和活性染色质区域的图谱。癌细胞进展通常由遗传改变和表观遗传重编程驱动，导致染色质可及性和基因表达改变。在上皮到间充质转化（EMT）及其反向过程间充质到上皮转化（MET）期间可以看到这种重编程的一个例子，已知这是肿瘤转移期间的关键细胞重编程过程30。另一个例子是在管腔乳腺肿瘤31中经常观察到对激素疗法的耐药性的获得。ATAC-seq可用于监测染色质水平的这种细胞表型改变，并可用于预测起源细胞和癌症亚型4。
为了通过ATAC-seq精确测量染色质重塑，有必要建立一个可重复且一致的方案。本文描述了ATAC-seq文库优化的标准策略。来自MDA-MB-231和NMuMG细胞系的ATAC-seq数据用作优化过程的示例。NMuMG细胞已被用于研究EMT，MDA-MB-231细胞已被用于研究其反向过程MET。这些细胞模型以前已用于研究EMT和MET13，32期间的表观遗传改变。使用适当的缓冲液进行细胞裂解和Tn5浓度是成功制备ATAC-seq文库的关键因素。除了这些组分外，高百分比（>90%）的细胞活力、裂解缓冲液中适当浓度的去垢剂以及单细胞悬液的制备也非常重要。当不同样品之间的Tn5消解效率显著不同时，校正数据变化具有挑战性。这是由于缺乏内部和外部控制来定量评估消化效率。对照组的细胞与测试组的细胞之间的细胞特征或性质也可能不同。因此，为了从两个实验组获得高质量的ATAC-seq数据，有必要仔细考虑实验条件，包括裂解缓冲液的选择（图5 和 图6）。
除了开放的染色质分析外，ATAC-seq还用于鉴定转录因子足迹和核小体定位8，33。重要的是要注意，这些信息主要来自开放的染色质区域（图1F）。因此，结果将偏向于开放的染色质区域。尽管如此，ATAC-seq是研究染色质结构的强大工具。这种革命性的工具最近已被用于单细胞基因组学，并继续有助于提高我们对基因调控和染色质生物学的理解。
数据可用性：
该协议中提供的数据可在Gene Expression Omnibus获得，入藏号为GSE202791。分析中还使用了来自GSE72141和GSE99479的ATAC-seq数据。
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Disclosures
作者声明，与本文描述的研究没有相关或重大的经济利益。
Acknowledgments
我们非常感谢UND基因组学核心设施提供的出色技术援助。
这项工作由美国国立卫生研究院[P20GM104360至MT，P20 GM104360至公元]和北达科他大学医学与健康科学学院生物医学科学系提供的启动资金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
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