Summary
ATAC-seq er en DNA-sekventeringsmetode, der bruger den hyperaktive mutanttransposase, Tn5, til at kortlægge ændringer i kromatintilgængelighed medieret af transkriptionsfaktorer. ATAC-seq muliggør opdagelsen af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for fænotypiske ændringer i kræftceller. Denne protokol skitserer optimeringsprocedurer for ATAC-seq i epitelcelletyper, herunder kræftceller.
Abstract
Analysen for transposase-tilgængelig kromatin med high-throughput sekventering (ATAC-seq) sonder deoxyribonukleinsyre (DNA) tilgængelighed ved hjælp af den hyperaktive Tn5 transposase. Tn5 skærer og ligerer adaptere til sekvensering med høj kapacitet inden for tilgængelige kromatinområder. I eukaryote celler pakkes genomisk DNA i kromatin, et kompleks af DNA, histoner og andre proteiner, der fungerer som en fysisk barriere for transkriptionsmaskineriet. Som reaktion på ydre signaler rekrutterer transkriptionsfaktorer kromatinombygningskomplekser for at muliggøre adgang til transkriptionsmaskineriet til genaktivering. Derfor er identifikation af åbne kromatinregioner nyttig, når man overvåger forstærker- og genpromotoraktiviteter under biologiske begivenheder såsom kræftprogression. Da denne protokol er nem at bruge og har et lavt krav til celleinput, er ATAC-seq blevet bredt vedtaget til at definere åbne kromatinregioner i forskellige celletyper, herunder kræftceller. For vellykket dataindsamling skal flere parametre overvejes, når man forbereder ATAC-seq-biblioteker. Blandt dem er valget af cellelysebuffer, titrering af Tn5-enzymet og startvolumen af celler afgørende for ATAC-seq-biblioteksforberedelse i kræftceller. Optimering er afgørende for at generere data af høj kvalitet. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af ATAC-seq-optimeringsmetoderne til epitelcelletyper.
Introduction
Kromatintilgængelighed er et centralt krav til regulering af genekspression på genomskala1. Ændringer i kromatin tilgængelighed er ofte forbundet med flere sygdomstilstande, herunder kræft 2,3,4. I årenes løb er der udviklet adskillige teknikker til at gøre det muligt for forskere at undersøge kromatinlandskabet ved at kortlægge regioner med kromatintilgængelighed. Nogle af dem omfatter DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehydassisteret isolering af regulatoriske elementer)6, MAPit (methyltransferasetilgængelighedsprotokol for individuelle skabeloner)7 og fokus for dette papir, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq kortlægger tilgængelige regioner ved at anvende et centralt træk ved DNase, nemlig præferencefordøjelsen af nøgent DNA fri for histoner og andre proteiner såsom transkriptionsfaktorer5. FAIRE-seq, der ligner ChIP-seq, anvender formaldehydtværbinding og sonikering, bortset fra at der ikke er nogen immunoprecipitation involveret, og de nukleosomfrie regioner isoleres ved phenolchloroformekstraktion6. MAPit-metoden bruger en GC-methyltransferase til at sonde kromatinstruktur ved enkeltmolekyleopløsning7. ATAC-seq er afhængig af den hyperaktive transposase, Tn58. Tn5-transposasen binder fortrinsvis til åbne kromatinområder og indsætter sekventeringsadaptere i tilgængelige regioner. Tn5 fungerer gennem en DNA-medieret "klip og indsæt" -mekanisme, hvorved transposasen forudindlæst med adaptere binder til åbne kromatinsteder, skærer DNA og ligerer adapterne8. Tn5-bundne regioner gendannes ved PCR-forstærkning ved hjælp af primere, der udglødes til disse adaptere. FAIRE-seq og DNase-seq kræver en stor mængde udgangsmateriale (~ 100.000 celler til 225.000 celler) og et separat biblioteksforberedelsestrin før sekventering9. På den anden side er ATAC-seq-protokollen relativt enkel og kræver et lille antal celler (<50.000 celler)10. I modsætning til FAIRE-seq- og DNase-seq-teknikkerne er sekventeringsbibliotekets forberedelse af ATAC-seq relativt let, da den isolerede DNA-prøve allerede mærkes med sekventeringsadapterne af Tn5. Derfor er kun PCR-forstærkningstrin med passende primere nødvendigt for at fuldføre biblioteksforberedelsen, og de forudgående behandlingstrin såsom slutreparation og adapterligering behøver ikke udføres, hvilket sparer tid11. For det andet undgår ATAC-seq behovet for bisulfitkonvertering, kloning og forstærkning med regionsspecifikke primere, der kræves tilMAPit 7. På grund af disse fordele er ATAC-seq blevet en enormt populær metode til at definere åbne kromatinregioner. Selvom ATAC-seq-metoden er enkel, kræver flere trin optimering for at opnå højkvalitets og reproducerbare data. Dette manuskript diskuterer optimeringsprocedurer for standard ATAC-seq biblioteksforberedelse og fremhæver især tre parametre: (1) lysisbuffersammensætning, (2) Tn5-transposasekoncentration og (3) cellenummer. Derudover giver dette papir eksempeldata fra optimeringsbetingelserne ved hjælp af både kræft- og ikke-kræftholdige epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelser inden forsøgets påbegyndelse
- Forbered lysis bufferlager.
BEMÆRK: Den optimale nukleare isolationsbuffer kan være forskellig for hver celletype. Vi anbefaler at teste både den hypotoniske buffer, der blev brugt i det originale papir8, og en CSK-buffer12,13 for hver celletype ved hjælp af trypanblå farvning.- For at forberede hypotonisk buffer (Greenleaf buffer) blandes 10 mM Tris-HCI pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 og 0,1% NP-40.
- For at forberede CSK-buffer blandes 10 mM RØR pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM saccharose, 3 mM MgCl2 og 0,1% Triton X-100.
- Sørg for, at cellekulturforholdene er optimale; Undersøg cellerne under et lysmikroskop for at sikre, at der ikke er forhøjede niveauer af apoptose.
- Tænd centrifugen, så den når 4 °C.
2. Cellehøst
- Aspiratmedier fra en cellekultur ved <80% sammenløb. Celler dyrkes typisk i en 35 mm eller 60 mm skål, baseret på antallet af nødvendige celler, behandlinger osv.
- Vask cellerne med 1 ml eller 3 ml PBS.
- Tilsæt 0,5 ml eller 1 ml Trypsin og inkuber i 2-3 minutter (afhængigt af celletyperne). Brug forsigtigt en 1 ml pipette til at blande godt.
- Tilsæt 1 ml eller 2 ml medier til pladen og bland godt. Overfør til et 15 ml konisk rør. Centrifuger cellerne i et 15 ml rør i 3 minutter ved 300 x g.
BEMÆRK: En svingende spandrotor anbefales for at minimere celletab. - Aspirer mediet og resuspender cellerne i 1 ml eller 2 ml medium.
BEMÆRK: Det er vigtigt at forberede en homogen enkeltcelleopløsning. For væv kan en Dounce homogenisator bruges til at homogenisere væv og minimere store celleklumper eller aggregater. Nogle væv kræver filtrering (f.eks. Cellesi) og / eller FACS-cellesortering for at isolere levedygtige celler og opnå en enkeltcelleopløsning. - Tæl cellerne ved hjælp af en celletæller.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der anvendt en automatiseret celletæller (materialetabel). - Centrifuger det krævede cellevolumen (f.eks. et volumen indeholdende 1 x 106 celler baseret på celleantal) ved 300 x g i 3 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Cellepelleten indeholdende 1 x 106 celler i 1 ml kold PBS gensuspenderes.
BEMÆRK: Hvis cellenumrene er mindre end 1 x 10 6 celler, reduceres det kolde PBS-volumen for at forberede celleopløsningen i samme koncentration (1 x 106 celler / ml).
3. Cellelyse
- Overfør 25 μL (= 2,5 x 104 celler) til et nyt 1,7 ml mikrocentrifugerør. Centrifuge i 5 minutter ved 500 x g ved 4 °C og kassér forsigtigt supernatanten
BEMÆRK: En svingende spandrotor anbefales for at minimere celletab. Efterlad ca. 3 μL supernatant for at sikre, at cellerne ikke kasseres. - Tilsæt 25 μL lysisbuffer og suspenderer cellerne ved blid pipettering op og ned. Inkuberes på is i 5 min
- Centrifuge i 5 minutter ved 500 x g ved 4 °C og kassér forsigtigt supernatanten.
BEMÆRK: En svingende spandrotor anbefales for at minimere celletab. Efterlad ca. 3 μL supernatant for at sikre, at cellerne ikke kasseres.
4. Tn5-mærkning
- Pelleten resuspenderes straks i 25 μL Tn5-reaktionsblanding. Tn5-reaktionsblandingen er som følger: 12,5 μL 2x tagmentations-DNA-buffer (TD-buffer), 1,25-5 μL Tn5-transposase og 11,25-7,5 μL nukleasefrit vand.
BEMÆRK: Standardkoncentrationen af Tn5 er 2,5 μL for 2,5 x 104 celler. - Inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Bland opløsningen hvert 10. minut.
5. DNA-oprensning
BEMÆRK: Oprensning er påkrævet før forstærkning. DNA-oprensning udføres ved hjælp af MinElute PCR-rensningssættet (Tabel over materialer).
- Der tilsættes 5 μL 3 M natriumacetat (pH 5,2).
- Tilsæt straks 125 μL buffer PB og bland godt.
- Følg PCR-oprensningssætprotokollen fra trin 2.
- Placer spinkolonnen i et 2 ml opsamlingsrør.
- Prøven påføres centrifugekolonnen og centrifugeres i 1 minut ved 17.900 x g ved RT.
- Kassér gennemstrømningen, og placer centrifugeringssøjlen tilbage i det samme opsamlingsrør.
- Der tilsættes 750 μL buffer-PE til centrifugekolonnen, og centrifuge i 1 minut ved 17.900 x g ved RT.
- Kassér gennemstrømningen, og placer centrifugeringssøjlen tilbage i det samme opsamlingsrør.
- Centrifuger centrifugeringssøjlen i 5 minutter for at tørre membranen helt.
- Kassér gennemstrømningen, og placer centrifugekolonnen i et nyt 1,7 ml mikrocentrifugerør.
- Elute DNA-fragmenterne med 10 μL buffer EB.
- Lad kolonnen stå i 1 min ved RT.
- Centrifuge i 1 minut ved 17.900 x g ved RT for at udvande DNA'et.
6. PCR-forstærkning
BEMÆRK: PCR-amplifikation af transponerede (tagmenterede) DNA'er er nødvendig for sekventering. Nextera kitadaptere (Tabel over materialer) blev brugt i dette eksempel. De primere, der anvendes i denne undersøgelse, er anført i tabel 1.
- Følgende PCR-reaktion opsættes i 200 μL PCR-rør (50 μL for hver prøve). PCR-reaktionsblandingen er som følger: 10 μL elueret DNA (trin 5.), 2,5 μL 25 mM adapter 1, 2,5 μL 25 mM adapter 2, 25 μL 2x PCR-masterblanding og 10 μL nukleasefrit vand
- Udfør PCR-forstærkningsprogram del 1 (tabel 2).
BEMÆRK: Til indledende forstærkning anvendes de samme betingelser for alle prøver ved hjælp af en standard termisk cyklist. - QPCR i realtid (i alt 14,5 μL pr. prøve)
- Ved hjælp af 5 μL af produktet fra PCR-forstærkningsdelen 1 (trin 6.2.) skal du indstille følgende reaktion, denne gang inklusive SYBR-guld og detektion i en PCR-maskine i realtid.
- Præparer PCR-reaktionsblandingen som følger: 5 μL PCR-produkt fra trin 6.2., 0,75 μL SYBR-guld (1000x fortyndet), 5 μL 2x PCR-masterblanding og 3,75 μL nukleasefrit vand.
BEMÆRK: De nøjagtige cyklustal for biblioteksforstærkning, før de når mætning for hver prøve, bestemmes af qPCR (tabel 3) for at reducere GC og størrelsesbias i PCR10. SYBR Gold blev fortyndet med nukleasefrit vand. For at fremstille den fortyndede opløsning blev 1 μL SYBR Gold (lagerkoncentration 10.000x) tilsat til 999 μL nukleasefrit vand. Driftstiden for RT-qPCR nævnt i tabel 3 er ca. 60 min.
- Bestem det krævede antal yderligere PCR-cyklusser ved hjælp af kørselsparametrene fra trin 6.3.
- Antal cyklusser = 1/4 maksimal (mættet) fluorescensintensitet (typisk 3 eller 4 PCR-cyklusser)
- PCR-forstærkningsprogram del 2 (volumen = 45 μL; Tabel 4): Når du har bestemt cyklusnummeret, skal du konfigurere PCR'er med yderligere cyklusser beregnet i trin 6.4.1. For eksempel, hvis det beregnede cyklusnummer er 3, skal du oprette 3 cyklusser i programmet nedenfor. De samlede cyklusser ville være 8 (5 i trin 6.2. plus 3 yderligere cyklusser i trin 6.5.)
7. Rensning af perler
BEMÆRK: Her blev AMPure XP (Table of Materials) perler brugt.
- Til de PCR-produkter, der blev forstærket i det foregående trin, skal du tilføje 150 μL perler ved RT.
BEMÆRK: Hjemmelavede AMPure perler14 kan bruges i denne proces. - Inkuberes i 15 minutter ved RT.
- Placer rørene på et magnetstativ i 5 minutter.
- Fjern forsigtigt supernatanten.
- Perlerne vaskes med 200 μL 80% ethanol.
BEMÆRK: 80% ethanol skal tilberedes frisk. - Gentag trin 7.4.
- Fjern ethanolen helt.
- Lufttør prøverne i 10 minutter ved RT.
- Resuspender med 50 μL elueringsbuffer (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
- Gentag perlerensningen (trin 7.1.-7.9.) for yderligere at minimere primerforurening.
8. DNA-koncentration og kvalitetskontrol
- Mål DNA-koncentrationen ved hjælp af et nukleinsyrekvantificeringssæt (Materialetabel).
- Kontroller de amplificerede DNA-fragmenter ved gelelektroforese ved hjælp af SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% agarosegel) eller et automatiseret elektroforesesystem (f.eks. TapeStation, bioanalyzer).
9. Sekvensering
- Udfør high-throughput sekventering ved hjælp af de forstærkede DNA-prøver12,13.
BEMÆRK: Amplificerede DNA-prøver er klar til high-throughput sekventering. For at bevare nukleosomal DNA-fragmentinformation anbefales parret sekventering frem for single-end sekventering. Begge ender af DNA-fragmenterne angiver, hvor transposasen binder. Til kortlægning af åbne kromatinregioner er 30 millioner læsninger / prøve typisk tilstrækkelige.
10. Dataanalyse
- Datafiltrering baseret på basisopkaldskvalitet: Indstil den mindste gennemsnitlige basiskvalitetsscore til 20 (99% nøjagtighed).
- Adapterbeskæring: Fjern adaptersekvenserne ved hjælp af et passende værktøj.
BEMÆRK: Trim Galore wrapper-værktøjet (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) blev brugt til at fjerne adaptersekvenser. For ATAC-seq-biblioteker udarbejdet af Illumina Tn5 bruges følgende sekvens som en adaptersekvens: CTGTCTCTTATACACATCT. Den mindste sekvenslængde til at genkende adapterforurening er indstillet til 5. - Genomkortlægning: Kortlæg læsningerne til det relevante genom med Bowtie ved hjælp af følgende parametre "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Et eksempel på kortlægningskvalitet fra MDA-MB-231 basale brystkræftceller er nedenfor:
Læser med mindst én rapporteret justering: 52,79 %
Læsninger, der ikke stemte overens: 13,10%
Læser med justeringer undertrykt på grund af -m: 34,11% - Deduplikering: Marker PCR-duplikaterne med Picard-værktøjer16.
- Generering af en genomdækningsfil til datavisualisering: Konverter de deducerede parrede endelæsninger til enkeltende læsefragmenter. Genom dækningsspor opnås ved hjælp af genomeCoverageBed fra sengeredskaber17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at opnå vellykkede ATAC-seq-data af høj kvalitet er det vigtigt at optimere de eksperimentelle forhold. ATAC-seq biblioteksforberedelse kan opdeles i de fem hovedtrin (figur 1), nemlig cellelysis, tagmentation (fragmentering og adapterindsættelse af Tn5), genomisk DNA-oprensning, PCR-amplifikation og dataanalyse. Som en indledende proces skal cellelysis (nuklear isolation) buffer først optimeres for hver celletype. Enten blev den hypotoniske buffer, der er beskrevet i det originale ATAC-seq-papir8, eller CSK-bufferen12,13 brugt til at lyse brystkræftceller. Trypan blå farvning kan bruges til at bekræfte kerneisolering18. Til ATAC-seq-biblioteksforberedelse i humane kræftcellelinjer såsom MDA-MB-231-, T47D-, MCF7- og A375-celler er CSK-buffer blevet brugt af flere grupper12,13,19,20. CSK-buffer blev også brugt til ATAC-seq-biblioteksforberedelse i andre celletyper såsom embryonale stamceller 21,22 og Drosophila S2-celler 23. Til optimering af lysisbufferen er Trypan blå farvning nyttig til at vurdere cellelyseeffektiviteten. Da NMuMG, ikke-kræftformede musebrystkirtelepitelceller, blev behandlet med den hypotoniske buffer8 (se trin 1) og CSK-buffer, blev der observeret højere cellelysiseffektivitet i CSK-behandlede celler (figur 2). For frosset væv har Omni-ATAC vist sig at forbedre ATAC-seq-signaler24. I Omni-ATAC anvendes en buffer indeholdende 0,1% NP40, 0,1% Tween-20 og 0,01% Digitonin til cellelyse. Selvom den Digitonin-baserede buffer er kendt for at reducere fraktionen af mitokondrie-DNA, viste signal-støj-forholdet og TSS-læsetællingerne fra ATAC-seq med CSK-buffer sig at være bedre end dem fra Omni-ATAC i brystkræftceller12. Derfor er resten af dette manuskript primært fokuseret på resultaterne fra ATAC-seq-data med CSK-buffer.
Efter bestemmelsen af de bedste cellelysisbufferforhold (nuklear isolering) er det vigtigt at optimere forholdet mellem inputcellenummer og Tn5-transposasekoncentration12,25. Typisk kan Tn5-koncentrationen titreres ved at variere volumenet af Tn5 fra 1,25 μL, 2,5 μL til 5 μL i et samlet volumen på 25 μL reaktionsblanding. Alternativt kan inputcellenumre ændres (f.eks. Fra 10.000 til 100.000), samtidig med at Tn5-enzymet forbliver uændret ved 2,5 μL for at optimere Tn5-tagmentationsreaktionen. For at evaluere kvaliteten af ATAC-seq-biblioteker og effektiviteten af Tn5-induceret kromatinfordøjelse kan bibliotekets PCR-produkter analyseres ved agarosegelelektroforese. Figur 3 viser eksempler på vellykkede ATAC-seq-biblioteker. PCR-forstærkning af 8 eller 9 cyklusser (samlede PCR-cyklusser inklusive indledende PCR) resulterer typisk i 3-6 ng / μL ATAC-seq bibliotekskoncentration. Da Tn5 fortrinsvis "angriber" nukleosomfrie regioner ved åbent kromatin (figur 1), bør nukleosomstigerne være tydelige på gelbilledet (figur 3). Ethidiumbromid eller SYBR Gold kan bruges til at detektere forstærkede DNA'er på agarosegelen.
Dernæst kan qPCR-analyse ved hjælp af ATAC-seq-biblioteker bruges til kort at kontrollere kvaliteten af bibliotekerne og fragmentberigelsen i åbne kromatinregioner såsom promotorer af aktive gener (figur 4). Primere kan designes til at generere <80 bp ampliconer ved hjælp af promotorer af kendte aktive gener som positive kontroller og kendte "lukkede" (inaktive) kromatinområder som negative kontroller (figur 4A). Blandt de testede betingelser blev der observeret højere berigelse i T47D ATAC-seq-bibliotekerne med CSK-buffer (figur 4B). Som forventet fandt vi mere berigelse ved hjælp af primere K og L ved østrogenreceptorens alfa (ESR1) genpromotorregion i forhold til et lukket område opstrøms for ESR1 med primer C (figur 4B)26. Figur 5 viser eksempler på ATAC-seq-data med forskellige Tn5-koncentrationer (25.000 celler blev brugt). I dette tilfælde blev der registreret højere baggrundsstøj i den laveste (1,25 μL Tn5) Tn5-tilstand (figur 5, lodrette stænger). ATAC-seq-data fra 2,5 μL eller 5 μL Tn5 viste lignende niveauer af ATAC-seq-signaler ved åbne kromatinområder med lavere baggrundssignaler. I betragtning af den potentielle overfordøjelse af Tn5 ved den højere koncentration kan det konkluderes, at 2,5 μL Tn5 er egnet til denne celletype.
Vi udførte også ATAC-seq ved hjælp af forskellige cellenumre i NMuMG-celler, der ofte bruges til at studere epitel-mesenkymal overgang (figur 6). For at optimere startvolumen blev fire forskellige cellenumre (25.000, 50.000, 75.000 og 100.000) brugt til ATAC-seq-biblioteksoptimering. Cellerne blev lyset med CSK-buffer, og kerner blev inkuberet med 2,5 μL Tn5-transposase i 25 μL af reaktionsblandingen. For at undersøge effekten af Tn5-fordøjelsen og nukleosomale stiger blev størrelsesfordelingen af indsatte DNA'er bioinformatisk analyseret (figur 6A). Når der blev anvendt lavere celletal, blev nukleosomfrie DNA-fragmenter (<100 bp) mere beriget i sekventeringsdataene. På den anden side var fraktionen af mono-nukleosomale DNA-fragmenter (175-225 bp) mindre i prøverne med lavt celleinput (25.000 celler og 50.000 celler) sammenlignet med højere celleindgangsbetingelser (75.000 celler og 100.000 celler). Selvom der blev observeret differentielle DNA-fragmentmønstre mellem prøverne, synes inputcellenummer at have minimal indflydelse på berigelsen af ATAC-seq-signaler ved promotorer og andre åbne kromatinregioner (figur 6B). For yderligere at undersøge virkningen af inputcellenumre på downstream-analyse blev ATAC-seq-toppe defineret. ATAC-seq-toppe blev bestemt af PeaKDEck-peak-opkaldsprogrammet27 ved hjælp af følgende parametre: -sig 0.0001 -bin 300 -back 3.000 -npBack 2.500.000. Fra ~ 4.9 millioner unikt kortlagte læsninger blev 38.878, 43.832, 41.509 og 45.530 toppe observeret i ATAC-seq-data fra henholdsvis 25.000, 50.000, 75.000 og 100.000 celleindgange. Inputtilstanden på 100.000 celler viste det højeste antal toppe. Da TSS-berigelsesscoren (Transcription Start Site) er blevet brugt til at vurdere kvaliteten af ATAC-seq-data, blev TSS-scoren for hver ATAC-seq-tilstand beregnet ved hjælp af GitHub-programmet: Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28. TSS-scorerne for 25.000, 50.000, 75.000 og 100.000 celleindgangsbetingelser var henholdsvis 9,03, 9,02, 8,82 og 8,28 (TSS-berigelsesscoren betragtes som ideel, hvis den er større end 728). Dette indikerede et gradvist fald i TSS-berigelsesscoren med stigende celletal. Mens det største toptal blev observeret i 100.000 celleindgangstilstand, gav 25.000 celleindgangstilstanden en bedre TSS-score. Peak annotation analyse af Homer29 viste, at størstedelen af de øgede toppe er kategoriseret som promotor distale toppe (figur 6C). Baseret på disse resultater kan det konkluderes, at de højere cellenummerinput kan producere et højere antal toppe og oftere detektere ikke-promotorspidser sammenlignet med de lavere cellenummerinput i denne tilstand.
Figur 1: Oversigt over ATAC-seq-metoden. (A) ATAC-seq måler kromatintilgængelighed ved hjælp af en hyperaktiv Tn5-transposase forudindlæst med fremadgående og omvendte adaptere. De forskellige trin i processen omfatter (B) cellelyse (herunder optimering af lysisbuffersammensætning, titrering af Tn5 og antallet af anvendte celler); C) transponering (binding af Tn5 til åbent/tilgængeligt kromatin) D) mærkning af kromatin (E) DNA-fragmentrensning og amplifikation af biblioteker og (F) sekventering af biblioteker og dataanalyse. Fragmentlængdefordelingsanalyse af ATAC-seq-biblioteker viser typisk en indledende top omkring ~ 50 bp (nukleosomfrie regioner) og en anden top ved ~ 200 bp (mono-nukleosom). Derfor indeholder ATAC-seq-signaler uden beregnings- eller eksperimentel størrelsesfiltrering både nukleosomfrie og nukleosomale regioner i åbent kromatin. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sammenligning af cellelyseeffektivitet ved hjælp af trypanblå. (A) NMuMG-celler blev behandlet med den hypotoniske buffer8 og farvet med trypanblå. (B) NMuMG-celler blev behandlet med CSK-buffer og farvet med trypanblå. Skalabjælkerne angiver 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Amplificeret DNA-fragmentanalyse af ATAC-seq-biblioteker. ATAC-seq biblioteker blev udarbejdet fra MDA-MB-231 brystkræftceller. (A) Efter PCR-forstærkning blev PCR-produkter analyseret på en 0,5x TBE, 1,5% agarosegel før og efter perlerensning. Primere fjernes for det meste ved den indledende perlerensning. DNA-båndmønstre fra (B) 1x TAE, 1% agarosegelelektroforese og (C) en automatiseret elektroforese er også indikeret. SYBR Gold blev brugt til at visualisere DNA-fragmenterne vist i A og B. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Berigelsesanalyse af ATAC-seq-biblioteker . (A) Genom browserspor, der viser ESR1-locus. Genomdækningen af ATAC-seq-dataene i T47D-celler20 vises. Primere fra en tidligere publikation blev brugt26, og deres målregioner er fremhævet med gult. (B) Søjlediagram, der viser primerampliconberigelse i ATAC-seq-biblioteker. ATAC-seq-biblioteker blev udarbejdet af den hypotoniske buffer eller CSK-buffer. Forskellige koncentrationer af Tn5 blev også brugt til at generere ATAC-seq-biblioteker. 1 ng af hvert bibliotek blev brugt til at udføre qPCR. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Genom browser visualisering til ATAC-seq optimering. Forskellige mængder Tn5-transposase blev tilføjet under biblioteksforberedelsen. 1,25 μL Tn5-tilstanden viser højere baggrundssignaler (fremhævet med gult), mens de to andre betingelser ligner hinanden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: DNA-fragmentstørrelsesfordeling af ATAC-seq-biblioteker. (A) ATAC-seq-biblioteker blev udarbejdet ved hjælp af de angivne cellenumre. ATAC-seq-dataene fra 25.000 celleindgangstilstanden viste den højeste berigelse af nukleosomfrie fragmenter, mens 100.000 celleindgangsbetingelsen præsenterede de højeste mono-nukleosomale DNA'er. (B) Genombrowserspor, der viser ATAC-seq-data fra forskellige cellenumre. (C) Homer peak annotation analyse. Hver top blev klassificeret som en promotor-proksimal eller distal top af Homer29. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Navn | Sekvens |
| ESR1 C Fremad | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C Omvendt | CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC |
| ESR1 K Fremad | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K omvendt | TGTCTCTCTTTCTTTTTTTGATTCCC |
| ESR1 L fremad | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L omvendt | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
Tabel 1: Liste over primere, der er anvendt i denne undersøgelse.
| Trin | Temperatur | Tidspunkt | Cykle |
| Udfyldning af huller | 72 °C | 5 minutter | 1 |
| Indledende denaturering | 98 °C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 °C | 10 sek. | 5 |
| Udglødning | 63 °C | 30 s | |
| Forlængelse | 72 °C | 1 minut | |
| Holde | 4 °C | for altid |
Tabel 2: PCR-forstærkningsprogram del 1.
| Trin | Temperatur | Cykle |
| Indledende denaturering | 98 °C 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 °C 10 s | 20 |
| Udglødning | 63 °C 30 s | |
| Forlængelse | 72 °C 1 min | |
| Plade læst |
Tabel 3: qPCR-indstillinger.
| Trin | Temperatur | Tidspunkt | Cykle |
| Indledende denaturering | 98 °C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 °C | 10 sek. | Cyklusser i alt beregnet på trin 6.4 |
| Udglødning | 63 °C | 30 s | |
| Forlængelse | 72 °C | 1 minut | |
| Holde | 4 °C | for altid |
Tabel 4: PCR-forstærkningsprogram del 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ATAC-seq er blevet brugt i vid udstrækning til kortlægning af åbne og aktive kromatinområder. Kræftcelleprogression er ofte drevet af genetiske ændringer og epigenetisk omprogrammering, hvilket resulterer i ændret kromatintilgængelighed og genekspression. Et eksempel på denne omprogrammering ses under epitel-til-mesenkymal overgang (EMT) og dens omvendte proces, mesenkymal-til-epitelovergang (MET), som vides at være vigtige cellulære omprogrammeringsprocesser under tumormetastase30. Et andet eksempel er erhvervelsen af lægemiddelresistens mod hormonbehandlinger observeres ofte i lysende brysttumorer31. ATAC-seq er nyttig til at overvåge sådanne cellefænotypiske ændringer på kromatinniveauet og kan bruges til at forudsige en oprindelsescelle og kræftundertype4.
For præcist at måle kromatinombygning ved ATAC-seq er det nødvendigt at etablere en reproducerbar og konsistent protokol. I dette manuskript beskrives en standardstrategi for ATAC-seq biblioteksoptimering. ATAC-seq-dataene fra MDA-MB-231 og NMuMG cellelinjer bruges som eksempler på optimeringsprocesser. NMuMG-celler er blevet brugt til at studere EMT, og MDA-MB-231-celler er blevet brugt til at studere dens omvendte proces, MET. Disse cellulære modeller er tidligere blevet brugt til at studere epigenetiske ændringer under EMT og MET13,32. Anvendelsen af en passende buffer til cellelyse og Tn5-koncentration er nøglekomponenten i vellykket ATAC-seq-biblioteksforberedelse. Ud over disse komponenter er en høj procentdel (>90%) af cellelevedygtighed, passende koncentrationer af vaskemiddel i lysisbufferen og fremstillingen af enkeltcellesuspensionen også meget vigtige. Når Tn5-fordøjelseseffektiviteten er signifikant forskellig på tværs af prøver, er det udfordrende at korrigere datavariationer. Dette skyldes manglen på interne og eksterne kontroller til kvantitativ vurdering af fordøjelseseffektiviteten. Cellulære egenskaber eller egenskaber kan også være forskellige mellem cellerne fra kontrolgruppen versus cellerne fra testgruppen. Derfor er det nødvendigt nøje at overveje de eksperimentelle betingelser, herunder valget af lysisbuffer, for at opnå ATAC-seq-data af høj kvalitet fra begge forsøgsgrupper (figur 5 og figur 6).
Udover åben kromatinprofilering er ATAC-seq blevet brugt til at identificere transkriptionsfaktorfodspor og nukleosompositionering 8,33. Det er vigtigt at bemærke, at sådanne oplysninger hovedsagelig stammer fra åbne kromatinregioner (figur 1F). Derfor ville resultaterne være forudindtaget mod åbne kromatinregioner. Ikke desto mindre er ATAC-seq et kraftfuldt værktøj til at studere kromatinarkitektur. Dette revolutionerende værktøj er for nylig blevet vedtaget til enkeltcellegenomik og bidrager fortsat til at forbedre vores forståelse af genregulering og kromatinbiologi.
TILGÆNGELIGHED AF DATA:
Dataene i denne protokol er tilgængelige på Gene Expression Omnibus under tiltrædelsesnummer GSE202791. ATAC-seq-dataene fra GSE72141 og GSE99479 blev også brugt i analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen relevante eller materielle økonomiske interesser, der vedrører den forskning, der er beskrevet i dette papir.
Acknowledgments
Vi anerkender taknemmeligt UND Genomics Core-faciliteten for fremragende teknisk bistand.
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health [P20GM104360 til M.T., P20 GM104360 til AD] og opstartsmidler leveret af University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Institut for Biomedicinsk Videnskab [til M.T.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
