ATAC-seq er en DNA-sekventeringsmetode, der bruger den hyperaktive mutanttransposase, Tn5, til at kortlægge ændringer i kromatintilgængelighed medieret af transkriptionsfaktorer. ATAC-seq muliggør opdagelsen af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for fænotypiske ændringer i kræftceller. Denne protokol skitserer optimeringsprocedurer for ATAC-seq i epitelcelletyper, herunder kræftceller.
Analysen for transposase-tilgængelig kromatin med high-throughput sekventering (ATAC-seq) sonder deoxyribonukleinsyre (DNA) tilgængelighed ved hjælp af den hyperaktive Tn5 transposase. Tn5 skærer og ligerer adaptere til sekvensering med høj kapacitet inden for tilgængelige kromatinområder. I eukaryote celler pakkes genomisk DNA i kromatin, et kompleks af DNA, histoner og andre proteiner, der fungerer som en fysisk barriere for transkriptionsmaskineriet. Som reaktion på ydre signaler rekrutterer transkriptionsfaktorer kromatinombygningskomplekser for at muliggøre adgang til transkriptionsmaskineriet til genaktivering. Derfor er identifikation af åbne kromatinregioner nyttig, når man overvåger forstærker- og genpromotoraktiviteter under biologiske begivenheder såsom kræftprogression. Da denne protokol er nem at bruge og har et lavt krav til celleinput, er ATAC-seq blevet bredt vedtaget til at definere åbne kromatinregioner i forskellige celletyper, herunder kræftceller. For vellykket dataindsamling skal flere parametre overvejes, når man forbereder ATAC-seq-biblioteker. Blandt dem er valget af cellelysebuffer, titrering af Tn5-enzymet og startvolumen af celler afgørende for ATAC-seq-biblioteksforberedelse i kræftceller. Optimering er afgørende for at generere data af høj kvalitet. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af ATAC-seq-optimeringsmetoderne til epitelcelletyper.
Kromatintilgængelighed er et centralt krav til regulering af genekspression på genomskala1. Ændringer i kromatin tilgængelighed er ofte forbundet med flere sygdomstilstande, herunder kræft 2,3,4. I årenes løb er der udviklet adskillige teknikker til at gøre det muligt for forskere at undersøge kromatinlandskabet ved at kortlægge regioner med kromatintilgængelighed. Nogle af dem omfatter DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehydassisteret isolering af regulatoriske elementer)6, MAPit (methyltransferasetilgængelighedsprotokol for individuelle skabeloner)7 og fokus for dette papir, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq kortlægger tilgængelige regioner ved at anvende et centralt træk ved DNase, nemlig præferencefordøjelsen af nøgent DNA fri for histoner og andre proteiner såsom transkriptionsfaktorer5. FAIRE-seq, der ligner ChIP-seq, anvender formaldehydtværbinding og sonikering, bortset fra at der ikke er nogen immunoprecipitation involveret, og de nukleosomfrie regioner isoleres ved phenolchloroformekstraktion6. MAPit-metoden bruger en GC-methyltransferase til at sonde kromatinstruktur ved enkeltmolekyleopløsning7. ATAC-seq er afhængig af den hyperaktive transposase, Tn58. Tn5-transposasen binder fortrinsvis til åbne kromatinområder og indsætter sekventeringsadaptere i tilgængelige regioner. Tn5 fungerer gennem en DNA-medieret “klip og indsæt” -mekanisme, hvorved transposasen forudindlæst med adaptere binder til åbne kromatinsteder, skærer DNA og ligerer adapterne8. Tn5-bundne regioner gendannes ved PCR-forstærkning ved hjælp af primere, der udglødes til disse adaptere. FAIRE-seq og DNase-seq kræver en stor mængde udgangsmateriale (~ 100.000 celler til 225.000 celler) og et separat biblioteksforberedelsestrin før sekventering9. På den anden side er ATAC-seq-protokollen relativt enkel og kræver et lille antal celler (<50.000 celler)10. I modsætning til FAIRE-seq- og DNase-seq-teknikkerne er sekventeringsbibliotekets forberedelse af ATAC-seq relativt let, da den isolerede DNA-prøve allerede mærkes med sekventeringsadapterne af Tn5. Derfor er kun PCR-forstærkningstrin med passende primere nødvendigt for at fuldføre biblioteksforberedelsen, og de forudgående behandlingstrin såsom slutreparation og adapterligering behøver ikke udføres, hvilket sparer tid11. For det andet undgår ATAC-seq behovet for bisulfitkonvertering, kloning og forstærkning med regionsspecifikke primere, der kræves tilMAPit 7. På grund af disse fordele er ATAC-seq blevet en enormt populær metode til at definere åbne kromatinregioner. Selvom ATAC-seq-metoden er enkel, kræver flere trin optimering for at opnå højkvalitets og reproducerbare data. Dette manuskript diskuterer optimeringsprocedurer for standard ATAC-seq biblioteksforberedelse og fremhæver især tre parametre: (1) lysisbuffersammensætning, (2) Tn5-transposasekoncentration og (3) cellenummer. Derudover giver dette papir eksempeldata fra optimeringsbetingelserne ved hjælp af både kræft- og ikke-kræftholdige epitelceller.
ATAC-seq er blevet brugt i vid udstrækning til kortlægning af åbne og aktive kromatinområder. Kræftcelleprogression er ofte drevet af genetiske ændringer og epigenetisk omprogrammering, hvilket resulterer i ændret kromatintilgængelighed og genekspression. Et eksempel på denne omprogrammering ses under epitel-til-mesenkymal overgang (EMT) og dens omvendte proces, mesenkymal-til-epitelovergang (MET), som vides at være vigtige cellulære omprogrammeringsprocesser under tumormetastase30. Et …
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender taknemmeligt UND Genomics Core-faciliteten for fremragende teknisk bistand.
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health [P20GM104360 til M.T., P20 GM104360 til AD] og opstartsmidler leveret af University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Institut for Biomedicinsk Videnskab [til M.T.].
1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |