Summary

ATAC-Seq optimering til kræft epigenetik forskning

Published: June 30, 2022
doi:

Summary

ATAC-seq er en DNA-sekventeringsmetode, der bruger den hyperaktive mutanttransposase, Tn5, til at kortlægge ændringer i kromatintilgængelighed medieret af transkriptionsfaktorer. ATAC-seq muliggør opdagelsen af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for fænotypiske ændringer i kræftceller. Denne protokol skitserer optimeringsprocedurer for ATAC-seq i epitelcelletyper, herunder kræftceller.

Abstract

Analysen for transposase-tilgængelig kromatin med high-throughput sekventering (ATAC-seq) sonder deoxyribonukleinsyre (DNA) tilgængelighed ved hjælp af den hyperaktive Tn5 transposase. Tn5 skærer og ligerer adaptere til sekvensering med høj kapacitet inden for tilgængelige kromatinområder. I eukaryote celler pakkes genomisk DNA i kromatin, et kompleks af DNA, histoner og andre proteiner, der fungerer som en fysisk barriere for transkriptionsmaskineriet. Som reaktion på ydre signaler rekrutterer transkriptionsfaktorer kromatinombygningskomplekser for at muliggøre adgang til transkriptionsmaskineriet til genaktivering. Derfor er identifikation af åbne kromatinregioner nyttig, når man overvåger forstærker- og genpromotoraktiviteter under biologiske begivenheder såsom kræftprogression. Da denne protokol er nem at bruge og har et lavt krav til celleinput, er ATAC-seq blevet bredt vedtaget til at definere åbne kromatinregioner i forskellige celletyper, herunder kræftceller. For vellykket dataindsamling skal flere parametre overvejes, når man forbereder ATAC-seq-biblioteker. Blandt dem er valget af cellelysebuffer, titrering af Tn5-enzymet og startvolumen af celler afgørende for ATAC-seq-biblioteksforberedelse i kræftceller. Optimering er afgørende for at generere data af høj kvalitet. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af ATAC-seq-optimeringsmetoderne til epitelcelletyper.

Introduction

Kromatintilgængelighed er et centralt krav til regulering af genekspression på genomskala1. Ændringer i kromatin tilgængelighed er ofte forbundet med flere sygdomstilstande, herunder kræft 2,3,4. I årenes løb er der udviklet adskillige teknikker til at gøre det muligt for forskere at undersøge kromatinlandskabet ved at kortlægge regioner med kromatintilgængelighed. Nogle af dem omfatter DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehydassisteret isolering af regulatoriske elementer)6, MAPit (methyltransferasetilgængelighedsprotokol for individuelle skabeloner)7 og fokus for dette papir, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq kortlægger tilgængelige regioner ved at anvende et centralt træk ved DNase, nemlig præferencefordøjelsen af nøgent DNA fri for histoner og andre proteiner såsom transkriptionsfaktorer5. FAIRE-seq, der ligner ChIP-seq, anvender formaldehydtværbinding og sonikering, bortset fra at der ikke er nogen immunoprecipitation involveret, og de nukleosomfrie regioner isoleres ved phenolchloroformekstraktion6. MAPit-metoden bruger en GC-methyltransferase til at sonde kromatinstruktur ved enkeltmolekyleopløsning7. ATAC-seq er afhængig af den hyperaktive transposase, Tn58. Tn5-transposasen binder fortrinsvis til åbne kromatinområder og indsætter sekventeringsadaptere i tilgængelige regioner. Tn5 fungerer gennem en DNA-medieret “klip og indsæt” -mekanisme, hvorved transposasen forudindlæst med adaptere binder til åbne kromatinsteder, skærer DNA og ligerer adapterne8. Tn5-bundne regioner gendannes ved PCR-forstærkning ved hjælp af primere, der udglødes til disse adaptere. FAIRE-seq og DNase-seq kræver en stor mængde udgangsmateriale (~ 100.000 celler til 225.000 celler) og et separat biblioteksforberedelsestrin før sekventering9. På den anden side er ATAC-seq-protokollen relativt enkel og kræver et lille antal celler (<50.000 celler)10. I modsætning til FAIRE-seq- og DNase-seq-teknikkerne er sekventeringsbibliotekets forberedelse af ATAC-seq relativt let, da den isolerede DNA-prøve allerede mærkes med sekventeringsadapterne af Tn5. Derfor er kun PCR-forstærkningstrin med passende primere nødvendigt for at fuldføre biblioteksforberedelsen, og de forudgående behandlingstrin såsom slutreparation og adapterligering behøver ikke udføres, hvilket sparer tid11. For det andet undgår ATAC-seq behovet for bisulfitkonvertering, kloning og forstærkning med regionsspecifikke primere, der kræves tilMAPit 7. På grund af disse fordele er ATAC-seq blevet en enormt populær metode til at definere åbne kromatinregioner. Selvom ATAC-seq-metoden er enkel, kræver flere trin optimering for at opnå højkvalitets og reproducerbare data. Dette manuskript diskuterer optimeringsprocedurer for standard ATAC-seq biblioteksforberedelse og fremhæver især tre parametre: (1) lysisbuffersammensætning, (2) Tn5-transposasekoncentration og (3) cellenummer. Derudover giver dette papir eksempeldata fra optimeringsbetingelserne ved hjælp af både kræft- og ikke-kræftholdige epitelceller.

Protocol

1. Forberedelser inden forsøgets påbegyndelse Forbered lysis bufferlager.BEMÆRK: Den optimale nukleare isolationsbuffer kan være forskellig for hver celletype. Vi anbefaler at teste både den hypotoniske buffer, der blev brugt i det originale papir8, og en CSK-buffer12,13 for hver celletype ved hjælp af trypanblå farvning.For at forberede hypotonisk buffer (Greenleaf buffer) blandes 10 mM Tris-H…

Representative Results

For at opnå vellykkede ATAC-seq-data af høj kvalitet er det vigtigt at optimere de eksperimentelle forhold. ATAC-seq biblioteksforberedelse kan opdeles i de fem hovedtrin (figur 1), nemlig cellelysis, tagmentation (fragmentering og adapterindsættelse af Tn5), genomisk DNA-oprensning, PCR-amplifikation og dataanalyse. Som en indledende proces skal cellelysis (nuklear isolation) buffer først optimeres for hver celletype. Enten blev den hypotoniske buffer, der er beskrevet i det originale A…

Discussion

ATAC-seq er blevet brugt i vid udstrækning til kortlægning af åbne og aktive kromatinområder. Kræftcelleprogression er ofte drevet af genetiske ændringer og epigenetisk omprogrammering, hvilket resulterer i ændret kromatintilgængelighed og genekspression. Et eksempel på denne omprogrammering ses under epitel-til-mesenkymal overgang (EMT) og dens omvendte proces, mesenkymal-til-epitelovergang (MET), som vides at være vigtige cellulære omprogrammeringsprocesser under tumormetastase30. Et …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkender taknemmeligt UND Genomics Core-faciliteten for fremragende teknisk bistand.

Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health [P20GM104360 til M.T., P20 GM104360 til AD] og opstartsmidler leveret af University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Institut for Biomedicinsk Videnskab [til M.T.].

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500 Natural
10 µL XL TipOne tips USA Scientific 1120-3810 Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tips USA Scientific 1182-1830 Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tips USA Scientific 1120-1840 Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352096
20 µL TipOne RPT tips USA Scientific 1183-1810 Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tips USA Scientific 1180-8810 Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge Tubes Fisherbrand 06-443-19
Agarose ThermoFisher Scientific YBP136010 Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCC ATCC
Allegra X-30R Centrifuge Beckman Coulter 364658 SX2415
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 Bead purification kit
CellDrop Cell Counter DeNovix CellDrop FL Cell counter
EDTA MilliporeSigma EDS BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTA MilliporeSigma E3889
Ethanol 100% ThermoFisher Scientific AC615100020 Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum – TET Tested R&D Systems S10350 Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1x ThermoFisher Scientific 11965092 [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1x ThermoFisher Scientific 10010023 pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1x ThermoFisher Scientific 25200056 (0.25%), phenol red
Glycerol IBI Scientific 56-81-5
Glycine MilliporeSigma G8898
HCl MilliporeSigma H1758
HEPES MilliporeSigma H3375
Invitrogen Qubit Fluorometer ThermoFisher Scientific Q32857
MgCl2 MilliporeSigma M3634
MinElute PCR Purification kit Qiagen 28004 DNA purification kit
NaCl IBI Scientific 7647-14-5
NaOH MilliporeSigma S8045 BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541
Nextera DNA Sample Preparation Kit Illumina FC-121-1030 2x TD and Tn5 Transposase
NP – 40 (IGEPAL CA-630) MilliporeSigma I8896 for molecular biology
PCR Detection System BioRad 1855484 CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPES MilliporeSigma P1851 BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kit ThermoFisher Scientific Q32854 Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay Tubes ThermoFisher Scientific Q32856 Invitrogen
SDS MilliporeSigma L3771
Sodium Acetate Homemade pH 5.2
Sucrose IBI Scientific 57-50-1
SYBR Gold ThermoFisher Scientific S11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mL BioRad 1708882
T100 Thermal Cycler BioRad 1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips USA Scientific 1402-4700 Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATE USA Scientific 1438-4700 Single notch. Natural polypropylene
Tris Base MilliporeSigma 648311 ULTROL Grade
Triton x-100 IBI Scientific 9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit Illumina PE-121-1003 paired-end
Trypan Blue Stain ThermoFisher Scientific Q32851
Tween-20 MilliporeSigma P7949 BioXtra, viscous liquid
Water MilliporeSigma W3500 sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture

References

  1. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  2. Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
  3. Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
  4. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
  5. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  6. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  7. Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
  8. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  9. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
  11. Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
  12. Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
  13. Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
  14. Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  15. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
  16. . Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022)
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  19. Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
  20. Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
  21. Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
  22. Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
  23. Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
  24. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  25. Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
  26. Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
  27. McCarthy, M. T., O’Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
  28. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
  29. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  30. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  31. Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
  32. Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
  33. Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).

Play Video

Cite This Article
Cooper, M., Ray, A., Bhattacharya, A., Dhasarathy, A., Takaku, M. ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research. J. Vis. Exp. (184), e64242, doi:10.3791/64242 (2022).

View Video