Summary
ATAC-seq is een DNA-sequencingmethode die de hyperactieve mutant transposase, Tn5, gebruikt om veranderingen in chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen, gemedieerd door transcriptiefactoren. ATAC-seq maakt de ontdekking mogelijk van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische veranderingen in kankercellen. Dit protocol schetst optimalisatieprocedures voor ATAC-seq in epitheelceltypen, waaronder kankercellen.
Abstract
De test voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) onderzoekt de toegankelijkheid van desoxyribonucleïnezuur (DNA) met behulp van het hyperactieve Tn5-transposase. Tn5 snijdt en ligeert adapters voor high-throughput sequencing binnen toegankelijke chromatinegebieden. In eukaryote cellen is genomisch DNA verpakt in chromatine, een complex van DNA, histonen en andere eiwitten, dat fungeert als een fysieke barrière voor de transcriptionele machinerie. Als reactie op extrinsieke signalen rekruteren transcriptiefactoren chromatineremodelleringscomplexen om toegang tot de transcriptionele machinerie mogelijk te maken voor genactivering. Daarom is het identificeren van open chromatinegebieden nuttig bij het monitoren van versterker- en genpromotoractiviteiten tijdens biologische gebeurtenissen zoals kankerprogressie. Omdat dit protocol gemakkelijk te gebruiken is en een lage celinvoervereiste heeft, is ATAC-seq op grote schaal gebruikt om open chromatinegebieden in verschillende celtypen, waaronder kankercellen, te definiëren. Voor succesvolle data-acquisitie moeten verschillende parameters worden overwogen bij het voorbereiden van ATAC-seq-bibliotheken. Onder hen zijn de keuze van de cellysebuffer, de titratie van het Tn5-enzym en het startvolume van cellen cruciaal voor de atac-seq-bibliotheekvoorbereiding in kankercellen. Optimalisatie is essentieel voor het genereren van hoogwaardige gegevens. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de ATAC-seq-optimalisatiemethoden voor epitheelceltypen.
Introduction
Chromatine toegankelijkheid is een belangrijke vereiste voor de regulatie van genexpressie op een genoombrede schaal1. Veranderingen in de toegankelijkheid van chromatine worden vaak geassocieerd met verschillende ziektetoestanden, waaronder kanker 2,3,4. In de loop der jaren zijn tal van technieken ontwikkeld om onderzoekers in staat te stellen het chromatinelandschap te onderzoeken door gebieden van chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen. Sommigen van hen omvatten DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, en de focus van dit artikel, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq brengt toegankelijke gebieden in kaart door gebruik te maken van een belangrijk kenmerk van DNase, namelijk de preferentiële vertering van naakt DNA vrij van histonen en andere eiwitten zoals transcriptiefactoren5. FAIRE-seq, vergelijkbaar met ChIP-seq, maakt gebruik van formaldehyde crosslinking en sonicatie, behalve dat er geen immunoprecipitatie bij betrokken is en de nucleosoomvrije regio's worden geïsoleerd door fenol-chloroformextractie6. De MAPit-methode maakt gebruik van een GC-methyltransferase om de chromatinestructuur te testen met een resolutie van één molecuul7. ATAC-seq vertrouwt op de hyperactieve transposase, Tn58. De Tn5 transposase bindt bij voorkeur aan open chromatinegebieden en plaatst sequencingadapters in toegankelijke gebieden. Tn5 werkt via een DNA-gemedieerd "knip en plak" mechanisme, waarbij de transposase vooraf geladen met adapters bindt aan open chromatine sites, knipt DNA en ligeert de adapters8. Tn5-gebonden gebieden worden hersteld door PCR-versterking met behulp van primers die naar deze adapters gloeien. FAIRE-seq en DNase-seq vereisen een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal (~ 100.000 cellen tot 225.000 cellen) en een afzonderlijke bibliotheekvoorbereidingsstap voordat9 wordt gesequenceerd. Aan de andere kant is het ATAC-seq-protocol relatief eenvoudig en vereist het een klein aantal cellen (<50.000 cellen)10. In tegenstelling tot de FAIRE-seq- en DNase-seq-technieken is de sequencingbibliotheekvoorbereiding van ATAC-seq relatief eenvoudig, omdat het geïsoleerde DNA-monster al door Tn5 wordt getagd met de sequencingadapters. Daarom is alleen de PCR-versterkingsstap met de juiste primers nodig om de bibliotheekvoorbereiding te voltooien en hoeven de voorafgaande verwerkingsstappen zoals eindreparatie en adapterligatie niet te worden uitgevoerd, waardoor tijd wordt bespaard11. Ten tweede vermijdt ATAC-seq de noodzaak van bisulfietconversie, klonen en versterking met regiospecifieke primers die vereist zijn voor MAPit7. Vanwege deze voordelen is ATAC-seq een enorm populaire methode geworden voor het definiëren van open chromatinegebieden. Hoewel de ATAC-seq-methode eenvoudig is, vereisen meerdere stappen optimalisatie om hoogwaardige en reproduceerbare gegevens te verkrijgen. Dit manuscript bespreekt optimalisatieprocedures voor standaard ATAC-seq bibliotheekvoorbereiding, met name drie parameters: (1) lysisbuffersamenstelling, (2) Tn5-transposaseconcentratie en (3) celnummer. Daarnaast biedt dit artikel voorbeeldgegevens van de optimalisatieomstandigheden met behulp van zowel kankerachtige als niet-kankerachtige aanhangende epitheelcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereidingen voordat het experiment begint
- Bereid lysis buffervoorraad voor.
OPMERKING: De optimale nucleaire isolatiebuffer kan voor elk celtype anders zijn. We raden aan om zowel de hypotone buffer die in het originele artikel8 is gebruikt als een CSK-buffer12,13 voor elk celtype te testen met behulp van trypanblauwe kleuring.- Om hypotone buffer (Greenleaf buffer) te bereiden, mengt u 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 en 0,1% NP-40.
- Om CSK-buffer te bereiden, mengt u 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl2 en 0,1% Triton X-100.
- Zorg ervoor dat de celkweekcondities optimaal zijn; onderzoek de cellen onder een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat er geen verhoogde niveaus van apoptose zijn.
- Zet de centrifuge aan om deze op 4 °C te laten komen.
2. Celoogst
- Aspirate media uit een celcultuur met <80% samenvloeiing. Cellen worden meestal gekweekt in een schaal van 35 mm of 60 mm, op basis van het aantal benodigde cellen, behandelingen, enz.
- Was de cellen met 1 ml of 3 ml PBS.
- Voeg 0,5 ml of 1 ml trypsine toe en incubeer gedurende 2-3 minuten (afhankelijk van de celtypen). Gebruik voorzichtig een pipet van 1 ml om goed te mengen.
- Voeg 1 ml of 2 ml media toe aan het bord en meng goed. Breng over naar een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen in een buis van 15 ml gedurende 3 minuten bij 300 x g.
OPMERKING: Een zwenkbakrotor wordt aanbevolen om celverlies te minimaliseren. - Aspirateer de media en resuspendeer de cellen in 1 ml of 2 ml medium.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om een homogene eencellige oplossing te bereiden. Voor weefsels kan een Dounce-homogenisator worden gebruikt om weefsels te homogeniseren en grote celklompen of aggregaten te minimaliseren. Sommige weefsels vereisen filtratie (bijv. Celzeefmachines) en/of FACS-celsortering om levensvatbare cellen te isoleren en een oplossing met één cel te verkrijgen. - Tel de cellen met behulp van een celteller.
OPMERKING: In deze studie werd een geautomatiseerde celteller (Tabel van Materialen) gebruikt. - Centrifugeer het vereiste celvolume (bijvoorbeeld een volume met 1 x 106 cellen op basis van het celgetal) bij 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Resuspendeer de celpellet met 1 x 106 cellen in 1 ml koude PBS.
OPMERKING: Als het aantal cellen kleiner is dan 1 x 106 cellen, verlaagt u het koude PBS-volume om de celoplossing in dezelfde concentratie te bereiden (1 x 106 cellen/ml).
3. Cellyse
- Breng 25 μL (= 2,5 x 104 cellen) over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C en gooi het supernatant voorzichtig weg
OPMERKING: Een zwenkbakrotor wordt aanbevolen om celverlies te minimaliseren. Laat ongeveer 3 μL supernatant achter om ervoor te zorgen dat de cellen niet worden weggegooid. - Voeg 25 μL lysisbuffer toe en resuspensieer de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C en gooi het supernatant voorzichtig weg.
OPMERKING: Een zwenkbakrotor wordt aanbevolen om celverlies te minimaliseren. Laat ongeveer 3 μL supernatant achter om ervoor te zorgen dat de cellen niet worden weggegooid.
4. Tn5 tagmentatie
- Resuspenseer de pellet onmiddellijk in 25 μL Tn5-reactiemengsel. Het Tn5-reactiemengsel is als volgt: 12,5 μL 2x Tagmentation DNA-buffer (TD-buffer), 1,25-5 μL Tn5 transposase en 11,25-7,5 μL nucleasevrij water.
OPMERKING: De standaardconcentratie van Tn5 is 2,5 μL voor 2,5 x 104 cellen. - Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
OPMERKING: Meng de oplossing elke 10 min.
5. DNA-zuivering
OPMERKING: Zuivering is vereist voor versterking. DNA-zuivering gebeurt met behulp van de MinElute PCR-zuiveringskit (Materiaaltabel).
- Voeg 5 μL natriumacetaat van 3 M (pH 5,2) toe.
- Voeg onmiddellijk 125 μL Buffer PB toe en meng goed.
- Volg het PCR-zuiveringskitprotocol vanaf stap 2.
- Plaats de spinkolom in een opvangbuis van 2 ml.
- Breng het monster aan op de spinkolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 17.900 x g bij RT.
- Gooi de doorstroom weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde opvangbuis.
- Voeg 750 μL buffer PE toe aan de spinkolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 17.900 x g bij RT.
- Gooi de doorstroom weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde opvangbuis.
- Centrifugeer de spinkolom gedurende 5 minuten om het membraan volledig te drogen.
- Gooi de doorstroom weg en plaats de spinkolom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 ml.
- Eluteer de DNA-fragmenten met 10 μL buffer EB.
- Laat de kolom 1 min staan bij RT.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 17.900 x g bij RT om het DNA te elueren.
6. PCR-versterking
OPMERKING: PCR-versterking van getransponeerde (tagmented) DNA's is noodzakelijk voor sequencing. In dit voorbeeld zijn nextera kitadapters (Materiaaltabel) gebruikt. De in dit onderzoek gebruikte primers zijn opgenomen in tabel 1.
- Stel de volgende PCR-reactie in 200 μL PCR-buizen in (50 μL voor elk monster). Het PCR-reactiemengsel is als volgt: 10 μL geëlueerd DNA (stap 5.), 2,5 μL van 25 mM Adapter 1, 2,5 μL van 25 mM Adapter 2, 25 μL van 2x PCR-mastermix en 10 μL nucleasevrij water
- Voer pcr-versterkingsprogramma deel 1 uit (tabel 2).
OPMERKING: Voor initiële versterking worden dezelfde voorwaarden gebruikt voor alle monsters die een standaard thermische cycler gebruiken. - Real-time qPCR (totaal 14,5 μL per monster)
- Stel met behulp van 5 μL van het product uit het PCR-versterkingsdeel 1 (stap 6.2.) de volgende reactie in, dit keer inclusief SYBR-goud en detectie in een real-time PCR-machine.
- Bereid het PCR-reactiemengsel als volgt: 5 μL PCR-product uit stap 6.2., 0,75 μL SYBR-goud (1000x verdund), 5 μL 2x PCR-mastermix en 3,75 μL nucleasevrij water.
OPMERKING: De precieze cyclusnummers voor bibliotheekversterking voordat de verzadiging voor elk monster wordt bereikt, worden bepaald door qPCR (tabel 3) om de GC- en groottebias in PCR10 te verminderen. SYBR Gold werd verdund met nucleasevrij water. Om de verdunde oplossing te maken, werd 1 μL SYBR Gold (voorraadconcentratie 10.000x) toegevoegd aan 999 μL nucleasevrij water. De looptijd van RT-qPCR vermeld in tabel 3 is ongeveer 60 min.
- Bepaal het vereiste aantal extra PCR-cycli met behulp van de uitvoeringsparameters uit stap 6.3.
- Aantal cycli = 1/4 maximale (verzadigde) fluorescentie-intensiteit (typisch 3 of 4 PCR-cycli)
- PCR-versterkingsprogramma deel 2 (volume = 45 μL; Tabel 4): Nadat u het cyclusnummer hebt bepaald, stelt u PCR's in met extra cycli berekend in stap 6.4.1. Als het berekende cyclusgetal bijvoorbeeld 3 is, stelt u 3 cycli in het onderstaande programma in. De totale cycli zouden 8 zijn (5 in stap 6.2., plus 3 extra cycli in stap 6.5.)
7. Kralen zuivering
OPMERKING: Hier werden AMPure XP (Table of Materials) kralen gebruikt.
- Voeg aan de PCR-producten die in de vorige stap zijn versterkt 150 μL kralen toe bij RT.
OPMERKING: Zelfgemaakte AMPure kralen14 kunnen in dit proces worden gebruikt. - Incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
- Plaats de buizen gedurende 5 minuten op een magnetische standaard.
- Verwijder het supernatant voorzichtig.
- Was de kralen met 200 μL 80% ethanol.
OPMERKING: 80% ethanol moet vers worden bereid. - Herhaal stap 7.4.
- Verwijder de ethanol volledig.
- Droog de monsters gedurende 10 minuten aan de lucht bij RT.
- Resuspend met 50 μL el elutiebuffer (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
- Herhaal de kralenzuivering (stappen 7.1.-7.9.) om de primerbesmetting verder te minimaliseren.
8. DNA-concentratie en kwaliteitscontrole
- Meet de DNA-concentratie met behulp van een nucleïnezuurkwantificatiekit (Tabel van materialen).
- Controleer de versterkte DNA-fragmenten door gel-elektroforese met SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% agarosegel) of een geautomatiseerd elektroforesesysteem (bijv. TapeStation, bioanalyzer).
9. Volgorde
- Voer high-throughput sequencing uit met behulp van de versterkte DNA-monsters12,13.
OPMERKING: Versterkte DNA-monsters zijn klaar voor high-throughput sequencing. Om nucleosomale DNA-fragmentinformatie te behouden, wordt paired-end sequencing aanbevolen boven single-end sequencing. Beide uiteinden van de DNA-fragmenten geven aan waar de transposase bindt. Voor het in kaart brengen van open chromatinegebieden is 30 miljoen reads/sample doorgaans voldoende.
10. Data-analyse
- Gegevensfiltratie op basis van de kwaliteit van de basisoproep: stel de minimale gemiddelde basiskwaliteitsscore in op 20 (99% nauwkeurigheid).
- Adapter bijsnijden: verwijder de adapterreeksen met een geschikt gereedschap.
OPMERKING: Het trim galore wrapper tool (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) werd gebruikt om adaptersequenties te verwijderen. Voor ATAC-seq bibliotheken die door Illumina Tn5 zijn voorbereid, wordt de volgende reeks gebruikt als adaptersequentie: CTGTCTCTTATACACATCT. De minimale volgordelengte om adapterverontreiniging te herkennen is ingesteld op 5. - Genoomkartering: Breng de metingen in kaart aan het juiste genoom met Bowtie met behulp van de volgende parameters "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Een voorbeeld van het in kaart brengen van kwaliteit van MDA-MB-231 basale borstkankercellen is hieronder:
Leest met ten minste één gerapporteerde uitlijning: 52,79%
Leeswaarden die niet uitlijnd zijn: 13,10%
Leest met uitlijningen onderdrukt als gevolg van -m: 34,11% - Ontdubbeling: Markeer de PCR-duplicaten door Picard tools16.
- Een genoomdekkingsbestand genereren voor gegevensvisualisatie: converteer de ontdubbelde paired-end reads naar single-end leesfragmenten. Genoomdekkingssporen worden verkregen met behulp van genomeCoverageBed van bedtools17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om succesvolle en hoogwaardige ATAC-seq-gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om de experimentele omstandigheden te optimaliseren. ATAC-seq bibliotheekvoorbereiding kan worden onderverdeeld in de vijf belangrijkste stappen (figuur 1), namelijk cellyse, tagmentatie (fragmentatie en adapterinbrenging door Tn5), genomische DNA-zuivering, PCR-amplificatie en gegevensanalyse. Als eerste proces moet de cellysisbuffer (nucleaire isolatie) eerst voor elk celtype worden geoptimaliseerd. Ofwel de hypotone buffer beschreven in het oorspronkelijke ATAC-seq paper8 of de CSK buffer12,13 werd gebruikt om borstkankercellen te lyseren. Trypan blauwe kleuring kan worden gebruikt om kernisolatie te bevestigen18. Voor ATAC-seq bibliotheekvoorbereiding in menselijke kankercellijnen zoals MDA-MB-231, T47D, MCF7 en A375 cellen, is CSK-buffer gebruikt door meerdere groepen 12,13,19,20. CSK-buffer werd ook gebruikt voor ATAC-seq-bibliotheekvoorbereiding in andere celtypen zoals embryonale stamcellen21,22 en Drosophila S2-cellen23. Voor de lysisbufferoptimalisatie is Trypan blue staining nuttig om de cellysis-efficiëntie te beoordelen. Wanneer NMuMG, niet-kankerachtige mammalinecellen van muizen, werden behandeld met de hypotone buffer8 (zie stap 1) en CSK-buffer, werd een hogere cellysis-efficiëntie waargenomen in met CSK behandelde cellen (figuur 2). Voor bevroren weefsels is aangetoond dat Omni-ATAC ATAC-seq-signalenverbetert 24. In de Omni-ATAC wordt een buffer met 0,1% NP40, 0,1% Tween-20 en 0,01% Digitonine gebruikt voor cellyse. Hoewel bekend is dat de op Digitonine gebaseerde buffer de fractie van mitochondriaal DNA vermindert, bleken de signaal-ruisverhoudingen en TSS-leestellingen van ATAC-seq met CSK-buffer beter te zijn dan die van Omni-ATAC in borstkankercellen12. Daarom is de rest van dit manuscript vooral gericht op de resultaten van ATAC-seq data met CSK buffer.
Na de bepaling van de beste cellysisbuffer (nucleaire isolatie) condities, is het belangrijk om de verhoudingen tussen het aantal inputcellen en de Tn5-transposaseconcentratie12,25 te optimaliseren. Doorgaans kan de Tn5-concentratie worden getitreerd door het volume van Tn5 te variëren van 1,25 μL, 2,5 μL, tot 5 μL in een totaal volume van 25 μL reactiemengsel. Als alternatief kunnen de aantallen invoercellen worden gewijzigd (bijvoorbeeld van 10.000 naar 100.000), terwijl het Tn5-enzym onveranderd blijft op 2,5 μL om de Tn5-tagmentatiereactie te optimaliseren. Om de kwaliteit van ATAC-seq-bibliotheken en de efficiëntie van Tn5-geïnduceerde chromatinevertering te evalueren, kunnen de pcr-producten van de bibliotheek worden geanalyseerd door agarose-gel-elektroforese. Figuur 3 toont voorbeelden van succesvolle ATAC-seq bibliotheken. Doorgaans resulteert PCR-versterking van 8 of 9 cycli (totale PCR-cycli inclusief initiële PCR) in 3-6 ng / μL ATAC-seq-bibliotheekconcentratie. Aangezien Tn5 bij voorkeur nucleosoomvrije gebieden "aanvalt" bij open chromatine (figuur 1), moeten de nucleosoomladders duidelijk zijn op het gelbeeld (figuur 3). Ethidiumbromide of SYBR Gold kan worden gebruikt om versterkte DNA's op de agarose-gel te detecteren.
Vervolgens kan qPCR-analyse met behulp van ATAC-seq-bibliotheken worden gebruikt om kort de kwaliteit van de bibliotheken en de fragmentverrijking in open chromatinegebieden zoals promotors van actieve genen te controleren (figuur 4). Primers kunnen worden ontworpen om <80 bp amplicons te genereren met behulp van promotors van bekende actieve genen als positieve controles en bekende "gesloten" (inactieve) chromatinegebieden als negatieve controles (figuur 4A). Onder de geteste omstandigheden werd een hogere verrijking waargenomen in de T47D ATAC-seq-bibliotheken met CSK-buffer (figuur 4B). Zoals verwacht vonden we meer verrijking met primers K en L in het oestrogeenreceptor alfa (ESR1) genpromotorgebied ten opzichte van een gesloten gebied stroomopwaarts van ESR1 met primer C (figuur 4B)26. Figuur 5 toont voorbeelden van ATAC-seq-gegevens met verschillende Tn5-concentraties (er werden 25.000 cellen gebruikt). In dit geval werd een hoger achtergrondgeluid gedetecteerd in de laagste (1,25 μL Tn5) Tn5-toestand (figuur 5, verticale balken). ATAC-seq-gegevens van 2,5 μL of 5 μL Tn5 toonden vergelijkbare niveaus van ATAC-seq-signalen op open chromatinegebieden met lagere achtergrondsignalen. Gezien de mogelijke oververtering door Tn5 bij de hogere concentratie, kan worden geconcludeerd dat 2,5 μL Tn5 geschikt is voor dit celtype.
We voerden ook de ATAC-seq uit met behulp van verschillende celnummers in NMuMG-cellen, vaak gebruikt om de epitheliale-mesenchymale overgang te bestuderen (figuur 6). Om het startvolume te optimaliseren, werden vier verschillende celnummers (25.000, 50.000, 75.000 en 100.000) gebruikt voor de atac-seq bibliotheekoptimalisatie. De cellen werden gelyseerd met CSK-buffer en kernen werden geïncubeerd met 2,5 μL Tn5 transposase in 25 μL van het reactiemengsel. Om de werkzaamheid van Tn5-spijsvertering en nucleosomale ladders te onderzoeken, werd de grootteverdeling van ingebrachte DNA's bioinformatisch geanalyseerd (figuur 6A). Wanneer lagere celaantallen werden gebruikt, werden nucleosoomvrije DNA-fragmenten (<100 bp) meer verrijkt in de sequencinggegevens. Aan de andere kant was de fractie van mono-nucleosomale DNA-fragmenten (175-225 bp) minder in de laagcellige inputmonsters (25.000 cellen en 50.000 cellen) in vergelijking met hogere celinvoercondities (75.000 cellen en 100.000 cellen). Hoewel differentiële DNA-fragmentpatronen tussen de monsters werden waargenomen, lijkt het aantal invoercellen een minimale impact te hebben op de verrijking van ATAC-seq-signalen bij promotors en andere open chromatinegebieden (figuur 6B). Om de impact van inputcelaantallen op downstream-analyse verder te onderzoeken, werden ATAC-seq-pieken gedefinieerd. De ATAC-seq pieken werden bepaald door het PeaKDEck piek aanroepprogramma27 met behulp van de volgende parameters: -sig 0.0001 -bin 300 -back 3.000 -npBack 2.500.000. Van ~ 4,9 miljoen uniek in kaart gebrachte reads werden 38.878, 43.832, 41.509 en 45.530 pieken waargenomen in ATAC-seq-gegevens van respectievelijk 25.000, 50.000, 75.000 en 100.000 celinvoer. De invoerconditie van 100.000 cellen vertoonde het hoogste aantal pieken. Aangezien de Transcription Start Site (TSS) verrijkingsscore is gebruikt om de kwaliteit van ATAC-seq-gegevens te beoordelen, is de TSS-score van elke ATAC-seq-conditie berekend met behulp van het GitHub-programma: Jiananlin / TSS_enrichment_score_calculation28. De TSS-scores voor de invoeromstandigheden van 25.000, 50.000, 75.000 en 100.000 cellen waren respectievelijk 9,03, 9,02, 8,82 en 8,28 (de TSS-verrijkingsscore wordt als ideaal beschouwd als deze groter is dan 728). Dit duidde op een geleidelijke afname van de TSS-verrijkingsscore met toenemende celaantallen. Terwijl het grootste piekgetal werd waargenomen in de invoerconditie van 100.000 cellen, gaf de invoerconditie van 25.000 cellen een betere TSS-score. Piekannotatieanalyse door Homerus29 gaf aan dat de meerderheid van de verhoogde pieken worden gecategoriseerd als promotor distale pieken (figuur 6C). Op basis van deze resultaten kan worden geconcludeerd dat de hogere celnummeringangen een hoger aantal pieken kunnen produceren en vaker niet-promotorpieken detecteren in vergelijking met de lagere celnummeringangen in deze toestand.
Figuur 1: Overzicht van de ATAC-seq-methode. (A) ATAC-seq meet de toegankelijkheid van chromatine met behulp van een hyperactieve Tn5-transposase die vooraf is geladen met voorwaartse en omgekeerde adapters. De verschillende stappen in het proces omvatten (B) cellyse (inclusief optimalisatie van de lysisbuffersamenstelling, titratie van Tn5 en het aantal gebruikte cellen); C) transpositie (binding van Tn5 aan open/toegankelijk chromatine); D) tagmentatie van chromatine; (E) DNA-fragmentzuivering en -versterking van bibliotheken, en (F) sequencing van bibliotheken en data-analyse. Fragmentlengteverdelingsanalyse van ATAC-seq-bibliotheken toont meestal een initiële piek rond ~ 50 bp (nucleosoomvrije regio's) en een andere piek bij ~ 200 bp (mono-nucleosoom). Daarom bevatten ATAC-seq-signalen zonder computationele of experimentele groottefiltratie zowel nucleosoomvrije als nucleosomale gebieden in open chromatine. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van de efficiëntie van de cellyse met behulp van trypan blue. (A) NMuMG-cellen werden behandeld met de hypotone buffer8 en gekleurd met trypan blue. (B) NMuMG-cellen werden behandeld met CSK-buffer en gekleurd met trypanblauw. De schaalbalken geven 50 μm aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Versterkte DNA-fragmentanalyse van ATAC-seq-bibliotheken. ATAC-seq bibliotheken werden bereid uit MDA-MB-231 borstkankercellen. (A) Na PCR-versterking werden PCR-producten geanalyseerd op een 0,5x TBE, 1,5% agarose-gel voor en na kralenzuivering. Primers worden meestal verwijderd door de eerste kralenzuivering. DNA-bandpatronen van (B) 1x TAE, 1% agarose gel-elektroforese en (C) een geautomatiseerde elektroforese zijn ook geïndiceerd. SYBR Gold werd gebruikt om de DNA-fragmenten in A en B te visualiseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verrijkingsanalyse van ATAC-seq-bibliotheken. (A) Genoombrowsertrack met de ESR1-locus. De genoomdekking van de ATAC-seq-gegevens in T47D-cellen20 wordt weergegeven. Primers uit een eerdere publicatie werdengebruikt 26, en hun doelgebieden zijn gemarkeerd in geel. (B) Staafdiagram met primer ampliconverrijking in ATAC-seq-bibliotheken. ATAC-seq bibliotheken werden voorbereid door de hypotone buffer of CSK buffer. Verschillende concentraties Tn5 werden ook gebruikt om ATAC-seq-bibliotheken te genereren. 1 ng van elke bibliotheek werd gebruikt om qPCR uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Genoombrowservisualisatie voor ATAC-seq-optimalisatie. Verschillende hoeveelheden Tn5 transposase werden toegevoegd tijdens de voorbereiding van de bibliotheek. De 1,25 μL Tn5-conditie toont hogere achtergrondsignalen (geel gemarkeerd), terwijl de andere twee voorwaarden er hetzelfde uitzien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: DNA-fragmentgrootteverdeling van ATAC-seq-bibliotheken. (A) ATAC-seq-bibliotheken werden voorbereid met behulp van de aangegeven celnummers. De ATAC-seq-gegevens van de invoerconditie van 25.000 cellen toonden de hoogste verrijking van nucleosoomvrije fragmenten, terwijl de invoerconditie van 100.000 cellen de hoogste mono-nucleosomale DNA's vertoonde. (B) Genoombrowsertracks met ATAC-seq-gegevens van verschillende celnummers. (C) Homer piek annotatie analyse. Elke piek werd geclassificeerd als een promotor-proximale of distale piek door Homerus29. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam | Volgorde |
| ESR1 C Vooruit | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C Achteruit | CTCCTCCGTTGAATGTCTCC |
| ESR1 K Vooruit | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K Achteruit | TGTCTCTCTTTCTGTTTGATTCCC |
| ESR1 L Vooruit | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L Achteruit | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
Tabel 1: Lijst van primers die in dit onderzoek zijn gebruikt.
| Stappen | Temperatuur | Tijd | Cyclus |
| Gaten vullen | 72 °C | 5 min. | 1 |
| Initiële denaturatie | 98 °C | 30 s | 1 |
| Denaturatie | 98 °C | 10 s | 5 |
| Annealing | 63 °C | 30 s | |
| Extensie | 72 °C | 1 min | |
| Houden | 4 °C | eeuwig |
Tabel 2: PCR-versterkingsprogramma deel 1.
| Stappen | Temperatuur | Cyclus |
| Initiële denaturatie | 98 °C 30 s | 1 |
| Denaturatie | 98 °C 10 s | 20 |
| Annealing | 63 °C 30 s | |
| Extensie | 72 °C 1 min | |
| Plaat lezen |
Tabel 3: qPCR-instellingen.
| Stappen | Temperatuur | Tijd | Cyclus |
| Initiële denaturatie | 98 °C | 30 s | 1 |
| Denaturatie | 98 °C | 10 s | Totaal aantal cycli berekend bij stap 6.4 |
| Annealing | 63 °C | 30 s | |
| Extensie | 72 °C | 1 min | |
| Houden | 4 °C | eeuwig |
Tabel 4: PCR-versterkingsprogramma deel 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ATAC-seq is op grote schaal gebruikt voor het in kaart brengen van open en actieve chromatinegebieden. De progressie van kankercellen wordt vaak aangedreven door genetische veranderingen en epigenetische herprogrammering, wat resulteert in veranderde chromatinetoegankelijkheid en genexpressie. Een voorbeeld van deze herprogrammering wordt gezien tijdens de epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) en het omgekeerde proces, mesenchymale naar epitheliale overgang (MET), waarvan bekend is dat het belangrijke cellulaire herprogrammeringsprocessen zijn tijdens tumormetastase30. Een ander voorbeeld is de verwerving van medicijnresistentie tegen hormoontherapieën wordt vaak waargenomen bij luminale borsttumoren31. ATAC-seq is nuttig om dergelijke celfenotypische veranderingen op chromatineniveau te monitoren en kan worden gebruikt om een cel van oorsprong en kankersubtypen4 te voorspellen.
Om chromatineremodellering door ATAC-seq nauwkeurig te meten, is het opstellen van een reproduceerbaar en consistent protocol noodzakelijk. In dit manuscript wordt een standaardstrategie voor ATAC-seq bibliotheekoptimalisatie beschreven. De ATAC-seq-gegevens van MDA-MB-231- en NMuMG-cellijnen worden gebruikt als voorbeelden van optimalisatieprocessen. NMuMG-cellen zijn gebruikt om EMT te bestuderen en MDA-MB-231-cellen zijn gebruikt om het omgekeerde proces, MET, te bestuderen. Deze cellulaire modellen zijn eerder gebruikt om epigenetische veranderingen tijdens EMT en MET13,32 te bestuderen. Het gebruik van een geschikte buffer voor cellyse en Tn5-concentratie is het belangrijkste onderdeel van een succesvolle ATAC-seq-bibliotheekvoorbereiding. Naast deze componenten zijn ook een hoog percentage (>90%) van de levensvatbaarheid van de cel, geschikte concentraties van detergent in de lysisbuffer en de bereiding van de eencellige suspensie erg belangrijk. Wanneer de efficiëntie van de Tn5-vergisting aanzienlijk verschilt tussen monsters, is het een uitdaging om gegevensvariaties te corrigeren. Dit komt door het gebrek aan interne en externe controles om de verteringsefficiëntie kwantitatief te beoordelen. Cellulaire kenmerken of eigenschappen kunnen ook verschillen tussen de cellen uit de controlegroep versus de cellen uit de testgroep. Daarom is een zorgvuldige afweging van de experimentele omstandigheden, inclusief de keuze van de lysisbuffer, noodzakelijk om hoogwaardige ATAC-seq-gegevens van beide experimentele groepen te verkrijgen (figuur 5 en figuur 6).
Naast open chromatineprofilering is ATAC-seq gebruikt om transcriptiefactorvoetafdrukken en nucleosoompositioneringte identificeren 8,33. Het is belangrijk op te merken dat dergelijke informatie meestal is afgeleid van open chromatinegebieden (figuur 1F)." Daarom zouden de resultaten vertekend zijn in de richting van open chromatinegebieden. Toch is ATAC-seq een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van chromatine-architectuur. Deze revolutionaire tool is meer recent gebruikt voor eencellige genomica en blijft bijdragen aan het verbeteren van ons begrip van genregulatie en chromatinebiologie.
BESCHIKBAARHEID VAN GEGEVENS:
De gegevens in dit protocol zijn beschikbaar op Gene Expression Omnibus onder toetredingsnummer GSE202791. De ATAC-seq-gegevens van GSE72141 en GSE99479 werden ook gebruikt in de analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen relevante of materiële financiële belangen zijn die verband houden met het onderzoek dat in dit artikel wordt beschreven.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de UND Genomics Core-faciliteit voor uitstekende technische assistentie.
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health [P20GM104360 tot M.T., P20 GM104360 tot A.D.] en start-upfondsen verstrekt door de University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [tot M.T.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
