Summary
ATAC-seq est une méthode de séquençage de l’ADN qui utilise la transposase mutante hyperactive, Tn5, pour cartographier les changements dans l’accessibilité de la chromatine médiés par des facteurs de transcription. ATAC-seq permet la découverte des mécanismes moléculaires sous-jacents aux altérations phénotypiques dans les cellules cancéreuses. Ce protocole décrit les procédures d’optimisation pour ATAC-seq dans les types de cellules épithéliales, y compris les cellules cancéreuses.
Abstract
Le test de chromatine accessible à la transposase avec séquençage à haut débit (ATAC-seq) sonde l’accessibilité de l’acide désoxyribonucléique (ADN) à l’aide de la transposase Tn5 hyperactive. Tn5 coupe et ligature les adaptateurs pour un séquençage à haut débit dans les régions de chromatine accessibles. Dans les cellules eucaryotes, l’ADN génomique est emballé dans la chromatine, un complexe d’ADN, d’histones et d’autres protéines, qui agit comme une barrière physique à la machinerie transcriptionnelle. En réponse aux signaux extrinsèques, les facteurs de transcription recrutent des complexes de remodelage de la chromatine pour permettre l’accès à la machinerie transcriptionnelle pour l’activation des gènes. Par conséquent, l’identification des régions ouvertes de la chromatine est utile lors de la surveillance des activités des amplificateurs et des promoteurs de gènes lors d’événements biologiques tels que la progression du cancer. Étant donné que ce protocole est facile à utiliser et nécessite peu d’entrée cellulaire, ATAC-seq a été largement adopté pour définir des régions de chromatine ouvertes dans divers types de cellules, y compris les cellules cancéreuses. Pour une acquisition de données réussie, plusieurs paramètres doivent être pris en compte lors de la préparation des bibliothèques ATAC-seq. Parmi eux, le choix du tampon de lyse cellulaire, le titrage de l’enzyme Tn5 et le volume de départ des cellules sont cruciaux pour la préparation de la bibliothèque ATAC-seq dans les cellules cancéreuses. L’optimisation est essentielle pour générer des données de haute qualité. Ici, nous fournissons une description détaillée des méthodes d’optimisation ATAC-seq pour les types de cellules épithéliales.
Introduction
L’accessibilité de la chromatine est une exigence clé pour la régulation de l’expression génique à l’échelle du génome1. Les changements dans l’accessibilité de la chromatine sont fréquemment associés à plusieurs états pathologiques, y compris le cancer 2,3,4. Au fil des ans, de nombreuses techniques ont été développées pour permettre aux chercheurs de sonder le paysage de la chromatine en cartographiant les régions d’accessibilité de la chromatine. Certains d’entre eux incluent DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, et l’objet de cet article, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq cartographie les régions accessibles en utilisant une caractéristique clé de DNase, à savoir la digestion préférentielle de l’ADN nu exempt d’histones et d’autres protéines telles que les facteurs de transcription5. FAIRE-seq, similaire à ChIP-seq, utilise la réticulation et la sonication du formaldéhyde, sauf qu’aucune immunoprécipitation n’est impliquée, et les régions exemptes de nucléosomes sont isolées par extraction phénol-chloroforme6. La méthode MAPit utilise une méthyltransférase GC pour sonder la structure de la chromatine à une résolutionde 7 molécule unique. ATAC-seq s’appuie sur la transposase hyperactive, Tn58. La transposase Tn5 se lie préférentiellement aux régions de chromatine ouvertes et insère des adaptateurs de séquençage dans les régions accessibles. Tn5 fonctionne par un mécanisme de « copier-coller » médié par l’ADN, par lequel la transposase préchargée avec des adaptateurs se lie aux sites de chromatine ouverts, coupe l’ADN et ligature les adaptateurs8. Les régions liées à Tn5 sont récupérées par amplification PCR à l’aide d’amorces qui recuisent ces adaptateurs. FAIRE-seq et DNase-seq nécessitent une grande quantité de matériel de départ (~100 000 cellules à 225 000 cellules) et une étape de préparation de bibliothèque séparée avant le séquençage9. D’autre part, le protocole ATAC-seq est relativement simple et nécessite un petit nombre de cellules (<50 000 cellules)10. Contrairement aux techniques FAIRE-seq et DNase-seq, la préparation de la bibliothèque de séquençage d’ATAC-seq est relativement facile, car l’échantillon d’ADN isolé est déjà étiqueté avec les adaptateurs de séquençage par Tn5. Par conséquent, seule l’étape d’amplification PCR avec les amorces appropriées est nécessaire pour terminer la préparation de la bibliothèque, et les étapes de traitement préalables telles que la réparation finale et la ligature de l’adaptateur ne doivent pas être effectuées, ce qui permet de gagner du temps11. Deuxièmement, ATAC-seq évite le besoin de conversion, de clonage et d’amplification du bisulfite avec des amorces spécifiques à la région requises pour MAPit7. En raison de ces avantages, ATAC-seq est devenu une méthode extrêmement populaire pour définir des régions de chromatine ouvertes. Bien que la méthode ATAC-seq soit simple, plusieurs étapes nécessitent une optimisation pour obtenir des données de haute qualité et reproductibles. Ce manuscrit traite des procédures d’optimisation pour la préparation de bibliothèques ATAC-seq standard, en mettant particulièrement l’accent sur trois paramètres: (1) la composition du tampon de lyse, (2) la concentration de la transposase Tn5 et (3) le nombre de cellules. En outre, cet article fournit des exemples de données sur les conditions d’optimisation utilisant des cellules épithéliales adhérentes cancéreuses et non cancéreuses.
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Protocol
1. Préparatifs avant de commencer l’expérience
- Préparer le stock tampon de lyse.
REMARQUE: Le tampon d’isolation nucléaire optimal peut être différent pour chaque type de cellule. Nous recommandons de tester à la fois le tampon hypotonique utilisé dans l’article original8 et un tampon CSK12,13 pour chaque type de cellule en utilisant une coloration au bleu trypan.- Pour préparer un tampon hypotonique (tampon Greenleaf), mélanger 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 et 0,1% NP-40.
- Pour préparer le tampon CSK, mélanger 10 mM de PIPES pH 6,8, 100 mM de NaCl, 300 mM de saccharose, 3 mM de MgCl2 et 0,1% de Triton X-100.
- S’assurer que les conditions de culture cellulaire sont optimales; Examinez les cellules au microscope optique pour vous assurer qu’il n’y a pas de niveaux élevés d’apoptose.
- Allumez la centrifugeuse pour la laisser atteindre 4 °C.
2. Récolte de cellules
- Aspirer les milieux à partir d’une culture de cellules à <80% de confluence. Les cellules sont généralement cultivées dans une boîte de 35 mm ou 60 mm, en fonction du nombre de cellules nécessaires, des traitements, etc.
- Lavez les cellules avec 1 mL ou 3 mL de PBS.
- Ajouter 0,5 mL ou 1 mL de trypsine et incuber pendant 2-3 min (selon les types de cellules). Utilisez soigneusement une pipette de 1 mL pour bien mélanger.
- Ajouter 1 mL ou 2 mL de média dans la plaque et bien mélanger. Transvaser dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules dans un tube de 15 mL pendant 3 min à 300 x g.
REMARQUE: Un rotor de godet oscillant est recommandé pour minimiser la perte de cellule. - Aspirer le média et remettre les cellules en suspension dans 1 mL ou 2 mL de milieu.
REMARQUE: Il est essentiel de préparer une solution unicellulaire homogène. Pour les tissus, un homogénéisateur Dounce peut être utilisé pour homogénéiser les tissus et minimiser les amas ou agrégats de grandes cellules. Certains tissus nécessitent une filtration (p. ex. crépines cellulaires) et/ou un tri cellulaire FACS pour isoler les cellules viables et obtenir une solution unicellulaire. - Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
REMARQUE : Dans cette étude, un compteur de cellules automatisé (Tableau des matériaux) a été utilisé. - Centrifuger le volume de cellules requis (p. ex., un volume contenant 1 x 106 cellules en fonction du nombre de cellules) à 300 x g pendant 3 min à température ambiante (RT).
- Remettez en suspension la pastille de cellule contenant 1 x 106 cellules dans 1 mL de PBS froid.
REMARQUE: Si le nombre de cellules est inférieur à 1 x 10 6 cellules, diminuer le volume de PBS froid pour préparer la solution cellulaire à la même concentration (1 x 106 cellules / mL).
3. Lyse cellulaire
- Transférer 25 μL (= 2,5 x 104 cellules) dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 mL. Centrifuger pendant 5 min à 500 x g à 4 °C et jeter soigneusement le surnageant
REMARQUE: Un rotor de godet oscillant est recommandé pour minimiser la perte de cellule. Laissez environ 3 μL de surnageant pour vous assurer que les cellules ne sont pas jetées. - Ajouter 25 μL de tampon de lyse et remettre les cellules en suspension en faisant un pipetage doux de haut en bas. Incuber sur glace pendant 5 min
- Centrifuger pendant 5 min à 500 x g à 4 °C et jeter soigneusement le surnageant.
REMARQUE: Un rotor de godet oscillant est recommandé pour minimiser la perte de cellule. Laissez environ 3 μL de surnageant pour vous assurer que les cellules ne sont pas jetées.
4. Étiquetage Tn5
- Remettez immédiatement la pastille en suspension dans 25 μL de mélange réactionnel Tn5. Le mélange réactionnel Tn5 est le suivant : 12,5 μL de tampon ADN de tagmentation 2x (tampon TD), 1,25-5 μL de transposase Tn5 et 11,25-7,5 μL d’eau exempte de nucléase.
NOTE: La concentration standard de Tn5 est de 2,5 μL pour 2,5 x 104 cellules. - Incuber pendant 30 min à 37 °C.
REMARQUE: Mélanger la solution toutes les 10 minutes.
5. Purification de l’ADN
NOTE: Une purification est nécessaire avant l’amplification. La purification de l’ADN est effectuée à l’aide du kit de purification MinElute PCR (Table of Materials).
- Ajouter 5 μL d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2).
- Ajouter immédiatement 125 μL de Buffer PB et bien mélanger.
- Suivez le protocole du kit de purification PCR à partir de l’étape 2.
- Placer la colonne d’essorage dans un tube de prélèvement de 2 mL.
- Appliquer l’échantillon sur la colonne de spin et centrifuger pendant 1 min à 17 900 x g à TA.
- Jetez l’écoulement continu et replacez la colonne de rotation dans le même tube de collecte.
- Ajouter 750 μL de Buffer PE à la colonne de spin et centrifuger pendant 1 min à 17 900 x g à TA.
- Jetez l’écoulement continu et replacez la colonne de rotation dans le même tube de collecte.
- Centrifuger la colonne de spin pendant 5 min pour sécher complètement la membrane.
- Jeter l’écoulement continu et placer la colonne d’essorage dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 mL.
- Éluer les fragments d’ADN avec 10 μL de Buffer EB.
- Laissez la colonne reposer pendant 1 min à RT.
- Centrifuger pendant 1 min à 17 900 x g à RT pour éluer l’ADN.
6. Amplification PCR
REMARQUE: L’amplification par PCR de l’ADN transposé (marqué) est nécessaire pour le séquençage. Les adaptateurs de kit Nextera (Table of Materials) ont été utilisés dans cet exemple. Les amorces utilisées dans cette étude sont énumérées au tableau 1.
- Mettre en place la réaction PCR suivante dans des tubes PCR de 200 μL (50 μL pour chaque échantillon). Le mélange réactionnel PCR est le suivant : 10 μL d’ADN élué (étape 5.), 2,5 μL d’Adaptateur 25 mM 1, 2,5 μL d’Adaptateur 25 mM, 25 μL de 2x mélange maître PCR et 10 μL d’eau sans nucléase
- Effectuer le programme d’amplification PCR partie 1 (Tableau 2).
REMARQUE: Pour l’amplification initiale, les mêmes conditions sont utilisées pour tous les échantillons utilisant un cycleur thermique standard. - qPCR en temps réel (total de 14,5 μL par échantillon)
- En utilisant 5 μL du produit de la partie 1 de l’amplification PCR (étape 6.2.), configurez la réaction suivante, incluant cette fois l’or SYBR et la détection dans une machine de PCR en temps réel.
- Préparer le mélange réactionnel PCR comme suit : 5 μL de produit PCR de l’étape 6.2., 0,75 μL d’or SYBR (1000x dilué), 5 μL de 2x mélange maître PCR et 3,75 μL d’eau sans nucléase.
REMARQUE : Les numéros de cycle précis pour l’amplification de la bibliothèque avant d’atteindre la saturation pour chaque échantillon sont déterminés par qPCR (tableau 3) afin de réduire le biais GC et de taille dans la PCR10. SYBR Gold a été dilué avec de l’eau sans nucléase. Pour fabriquer la solution diluée, 1 μL de SYBR Gold (concentration mère 10 000x) a été ajouté à 999 μL d’eau sans nucléase. La durée d’exécution de la RT-qPCR mentionnée dans le tableau 3 est d’environ 60 min.
- Déterminez le nombre requis de cycles de PCR supplémentaires à l’aide des paramètres d’exécution de l’étape 6.3.
- Nombre de cycles = 1/4 d’intensité de fluorescence maximale (saturée) (généralement 3 ou 4 cycles de PCR)
- Programme d’amplification par PCR partie 2 (volume = 45 μL; Tableau 4) : Une fois que vous avez déterminé le numéro de cycle, configurez les PCR avec des cycles supplémentaires calculés à l’étape 6.4.1. Par exemple, si le nombre de cycles calculé est 3, configurez 3 cycles dans le programme ci-dessous. Le nombre total de cycles serait de 8 (5 à l’étape 6.2., plus 3 cycles supplémentaires à l’étape 6.5).
7. Purification des perles
REMARQUE: Ici, des perles AMPure XP (Table of Materials) ont été utilisées.
- Aux produits PCR amplifiés à l’étape précédente, ajouter 150 μL de billes à TA.
REMARQUE: Les perles AMPure14 faites maison peuvent être utilisées dans ce processus. - Incuber pendant 15 min à TA.
- Placez les tubes sur un support magnétique pendant 5 min.
- Retirez délicatement le surnageant.
- Lavez les billes avec 200 μL d’éthanol à 80 %.
NOTE: L’éthanol à 80% doit être préparé frais. - Répétez l’étape 7.4.
- Retirez complètement l’éthanol.
- Sécher les échantillons à l’air libre pendant 10 min à TA.
- Resuspendre avec 50 μL de tampon d’élution (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
- Répétez la purification des billes (étapes 7.1.-7.9.) pour minimiser davantage la contamination de l’apprêt.
8. Concentration de l’ADN et contrôle de la qualité
- Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un kit de quantification des acides nucléiques (Tableau des matériaux).
- Vérifiez les fragments d’ADN amplifiés par électrophorèse sur gel à l’aide de SYBR Gold (0,5x TBE, gel d’agarose à 1,5%) ou d’un système d’électrophorèse automatisé (par exemple, TapeStation, bioanalyseur).
9. Séquençage
- Effectuer un séquençage à haut débit à l’aide des échantillons d’ADN amplifiés12,13.
REMARQUE: Les échantillons d’ADN amplifiés sont prêts pour le séquençage à haut débit. Pour conserver les informations sur les fragments d’ADN nucléosomiques, le séquençage par paires est recommandé plutôt que le séquençage à une extrémité. Les deux extrémités des fragments d’ADN indiquent où la transposase se lie. Pour cartographier les régions de chromatine ouverte, 30 millions de lectures/échantillon sont généralement suffisantes.
10. Analyse des données
- Filtrage des données basé sur la qualité des appels de base : définissez le score de qualité de base moyen minimum sur 20 (précision de 99 %).
- Découpage de l’adaptateur : supprimez les séquences de l’adaptateur à l’aide d’un outil approprié.
REMARQUE : L’outil wrapper Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) a été utilisé pour supprimer des séquences d’adaptateurs. Pour les bibliothèques ATAC-seq préparées par Illumina Tn5, la séquence suivante est utilisée comme séquence d’adaptateurs : CTGTCTCTTATACACATCT. La longueur de séquence minimale pour reconnaître la contamination de la carte est définie sur 5. - Cartographie du génome: Mappez les lectures au génome approprié avec Bowtie en utilisant les paramètres suivants « -I 0 -X 2000 -m 1"15. Voici un exemple de cartographie de la qualité des cellules cancéreuses basales du sein MDA-MB-231 :
Lectures avec au moins un alignement signalé : 52,79 %
Lectures qui n’ont pas réussi à s’aligner : 13,10 %
Lectures avec alignements supprimés en raison de -m : 34,11 % - Déduplication : Marquez les doublons PCR par outils Picard16.
- Génération d’un fichier de couverture génomique pour la visualisation des données : convertissez les lectures appariées dédupliquées en fragments de lecture à une extrémité. Les traces de couverture du génome sont obtenues à l’aide de genomeCoverageBed à partir d’outils de lit17.
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Representative Results
Pour obtenir des données ATAC-seq réussies et de haute qualité, il est important d’optimiser les conditions expérimentales. La préparation de la bibliothèque ATAC-seq peut être séparée en cinq étapes principales (Figure 1), à savoir la lyse cellulaire, le marquage (fragmentation et insertion de l’adaptateur par Tn5), la purification de l’ADN génomique, l’amplification par PCR et l’analyse des données. En tant que processus initial, le tampon de lyse cellulaire (isolement nucléaire) doit d’abord être optimisé pour chaque type de cellule. Le tampon hypotonique décrit dans l’article original ATAC-seq8 ou le tampon CSK12,13 ont été utilisés pour lyser les cellules cancéreuses du sein. La coloration au bleu de trypan peut être utilisée pour confirmer l’isolement des noyaux18. Pour la préparation de la bibliothèque ATAC-seq dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines telles que les cellules MDA-MB-231, T47D, MCF7 et A375, le tampon CSK a été utilisé par plusieurs groupes12,13,19,20. Le tampon CSK a également été utilisé pour la préparation de la bibliothèque ATAC-seq dans d’autres types de cellules telles que les cellules souches embryonnaires 21,22 et les cellules S2 de drosophile 23. Pour l’optimisation du tampon de lyse, la coloration au bleu de trypan est utile pour évaluer l’efficacité de la lyse cellulaire. Lorsque la NMuMG, des cellules épithéliales non cancéreuses de la glande mammaire de souris, ont été traitées avec le tampon hypotonique8 (voir étape 1) et le tampon CSK, une efficacité de lyse cellulaire plus élevée a été observée dans les cellules traitées par CSK (Figure 2). Pour les tissus congelés, il a été démontré qu’Omni-ATAC améliore les signaux ATAC-seq24. Dans l’Omni-ATAC, un tampon contenant 0,1 % de NP40, 0,1 % de Tween-20 et 0,01 % de Digitonine est utilisé pour la lyse cellulaire. Bien que le tampon à base de digitonine soit connu pour diminuer la fraction de l’ADN mitochondrial, les rapports signal sur bruit et le nombre de lectures TSS de l’ATAC-seq avec tampon CSK se sont révélés meilleurs que ceux d’Omni-ATAC dans les cellules cancéreuses du sein12. Par conséquent, le reste de ce manuscrit est principalement axé sur les résultats des données ATAC-seq avec tampon CSK.
Suite à la détermination des meilleures conditions tampons de lyse cellulaire (isolement nucléaire), il est important d’optimiser les rapports entre le nombre de cellules d’entrée et la concentration de transvasase Tn512,25. En règle générale, la concentration de Tn5 peut être titrée en faisant varier le volume de Tn5 de 1,25 μL, 2,5 μL à 5 μL dans un volume total de 25 μL de mélange réactionnel. Alternativement, le nombre de cellules d’entrée peut être modifié (par exemple, de 10 000 à 100 000), tout en maintenant l’enzyme Tn5 inchangée à 2,5 μL pour optimiser la réaction de marquage Tn5. Pour évaluer la qualité des bibliothèques ATAC-seq et l’efficacité de la digestion de la chromatine induite par Tn5, les produits PCR de la bibliothèque peuvent être analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. La figure 3 montre des exemples de bibliothèques ATAC-seq réussies. En règle générale, l’amplification de la PCR de 8 ou 9 cycles (cycles de PCR totaux, y compris la PCR initiale) entraîne une concentration de bibliothèque ATAC-seq de 3 à 6 ng / μL. Comme Tn5 « attaque » préférentiellement les régions exemptes de nucléosomes à la chromatine ouverte (Figure 1), les échelles des nucléosomes doivent être évidentes sur l’image du gel (Figure 3). Le bromure d’éthidium ou SYBR Gold peut être utilisé pour détecter l’ADN amplifié sur le gel d’agarose.
Ensuite, l’analyse qPCR à l’aide de bibliothèques ATAC-seq peut être utilisée pour vérifier brièvement la qualité des bibliothèques et l’enrichissement des fragments dans les régions ouvertes de la chromatine telles que les promoteurs de gènes actifs (Figure 4). Les amorces peuvent être conçues pour générer des amplicons de <80 pb en utilisant des promoteurs de gènes actifs connus comme témoins positifs et des régions de chromatine « fermées » (inactives) connues comme témoins négatifs (Figure 4A). Parmi les conditions testées, un enrichissement plus élevé a été observé dans les bibliothèques ATAC-seq T47D avec tampon CSK (Figure 4B). Comme prévu, nous avons trouvé plus d’enrichissement en utilisant les amorces K et L dans la région promotrice du gène du récepteur alpha des œstrogènes (ESR1) par rapport à une région fermée en amont de l’ESR1 avec l’amorce C (Figure 4B)26. La figure 5 montre des exemples de données ATAC-seq avec différentes concentrations de Tn5 (25 000 cellules ont été utilisées). Dans ce cas, un bruit de fond plus élevé a été détecté dans la condition Tn5 la plus faible (1,25 μL de Tn5) (figure 5, barres verticales). Les données ATAC-seq de 2,5 μL ou 5 μL de Tn5 ont montré des niveaux similaires de signaux ATAC-seq dans les régions de chromatine ouvertes avec des signaux de fond plus faibles. Compte tenu de la surdigestion potentielle par Tn5 à la concentration la plus élevée, on peut conclure que 2,5 μL de Tn5 conviennent à ce type de cellule.
Nous avons également effectué l’ATAC-seq en utilisant différents nombres de cellules dans les cellules NMuMG, fréquemment utilisés pour étudier la transition épithéliale-mésenchymateuse (Figure 6). Pour optimiser le volume de départ, quatre numéros de cellule différents (25 000, 50 000, 75 000 et 100 000) ont été utilisés pour l’optimisation de la bibliothèque ATAC-seq. Les cellules ont été lysées avec un tampon CSK et les noyaux ont été incubés avec 2,5 μL de Tn5 transposase dans 25 μL du mélange réactionnel. Pour explorer l’efficacité de la digestion Tn5 et des échelles nucléomoles, la distribution granulométrique des ADN insérés a été analysée bio-informatique (Figure 6A). Lorsque des nombres de cellules plus faibles ont été utilisés, des fragments d’ADN sans nucléosomes (<100 pb) ont été enrichis dans les données de séquençage. D’autre part, la fraction de fragments d’ADN mononucléosomique (175-225 pb) était inférieure dans les échantillons d’entrée cellulaire faible (25 000 cellules et 50 000 cellules) par rapport aux conditions d’entrée cellulaire plus élevées (75 000 cellules et 100 000 cellules). Bien que des profils différentiels de fragments d’ADN aient été observés entre les échantillons, le nombre de cellules d’entrée semble avoir un impact minimal sur l’enrichissement des signaux ATAC-seq au niveau des promoteurs et d’autres régions ouvertes de la chromatine (Figure 6B). Pour étudier plus en détail l’impact du nombre de cellules d’entrée sur l’analyse en aval, des pics ATAC-seq ont été définis. Les pics ATAC-seq ont été déterminés par le programme d’appel de pointe PeaKDEck27 à l’aide des paramètres suivants: -sig 0,0001 -bin 300 -retour 3 000 -npBack 2 500 000. Sur ~4,9 millions de lectures mappées de manière unique, 38 878, 43 832, 41 509 et 45 530 pics ont été observés dans les données ATAC-seq à partir de 25 000, 50 000, 75 000 et 100 000 entrées de cellules, respectivement. La condition d’entrée de 100 000 cellules a montré le plus grand nombre de pics. Étant donné que le score d’enrichissement du site de début de transcription (TSS) a été utilisé pour évaluer la qualité des données ATAC-seq, le score TSS de chaque condition ATAC-seq a été calculé à l’aide du programme GitHub : Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28. Les scores TSS pour les conditions d’entrée de 25 000, 50 000, 75 000 et 100 000 cellules étaient respectivement de 9,03, 9,02, 8,82 et 8,28 (le score d’enrichissement TSS est considéré comme idéal s’il est supérieur à 728). Cela a indiqué une diminution progressive du score d’enrichissement du SCT avec l’augmentation du nombre de cellules. Alors que le plus grand nombre de pics a été observé dans la condition d’entrée de 100 000 cellules, la condition d’entrée de 25 000 cellules a donné un meilleur score TSS. L’analyse d’annotation des pics par Homer29 a indiqué que la majorité des pics accrus sont classés comme des pics distaux promoteurs (Figure 6C). Sur la base de ces résultats, on peut conclure que les entrées de nombre de cellules plus élevées peuvent produire un nombre plus élevé de pics et détecter plus fréquemment les pics non promoteurs par rapport aux entrées de nombre de cellules inférieures dans cette condition.
Figure 1 : Aperçu de la méthode ATAC-seq. (A) ATAC-seq mesure l’accessibilité de la chromatine à l’aide d’une transposase Tn5 hyperactive préchargée avec des adaptateurs avant et arrière. Les différentes étapes du processus comprennent (B) la lyse cellulaire (y compris l’optimisation de la composition tampon de la lyse, le titrage de Tn5 et le nombre de cellules utilisées); (C) transposition (liaison de Tn5 à la chromatine ouverte/accessible); D) marquage de la chromatine; (E) purification et amplification des fragments d’ADN des bibliothèques, et (F) séquençage des bibliothèques et analyse des données. L’analyse de la distribution de longueur des fragments des bibliothèques ATAC-seq montre généralement un pic initial autour de ~50 bp (régions exemptes de nucléosomes) et un autre pic à ~200 bp (mononucléosome). Par conséquent, sans filtration de taille computationnelle ou expérimentale, les signaux ATAC-seq contiennent à la fois des régions sans nucléosomes et des régions nucléosomales dans la chromatine ouverte. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Comparaison de l’efficacité de la lyse cellulaire à l’aide du bleu de trypan. (A) Les cellules NMuMG ont été traitées avec le tampon hypotonique8 et colorées avec du bleu de trypan. (B) Les cellules NMuMG ont été traitées avec un tampon CSK et colorées avec du bleu de trypan. Les barres d’échelle indiquent 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse amplifiée des fragments d’ADN des bibliothèques ATAC-seq. Les bibliothèques ATAC-seq ont été préparées à partir de cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231. (A) Après amplification par PCR, les produits PCR ont été analysés sur un gel d’agarose 0,5x TBE, 1,5% avant et après purification des billes. Les apprêts sont principalement éliminés par la purification initiale des perles. Les profils de bandes d’ADN de (B) 1x TAE, 1% d’électrophorèse sur gel d’agarose et (C) d’une électrophorèse automatisée sont également indiqués. SYBR Gold a été utilisé pour visualiser les fragments d’ADN montrés dans A et B. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse de l’enrichissement des bibliothèques ATAC-seq. (A) Piste du navigateur génomique montrant le locus ESR1. La couverture génomique des données ATAC-seq dans les cellules T47D20 est montrée. Les amorces d’une publication précédente ont été utilisées26, et leurs régions cibles sont surlignées en jaune. (B) Diagramme à barres illustrant l’enrichissement de l’amplicon de l’amorce dans les bibliothèques ATAC-seq. Les bibliothèques ATAC-seq ont été préparées par le tampon hypotonique ou tampon CSK. Différentes concentrations de Tn5 ont également été utilisées pour générer des bibliothèques ATAC-seq. 1 ng de chaque bibliothèque a été utilisé pour effectuer la qPCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Visualisation du navigateur génomique pour l’optimisation ATAC-seq. Différentes quantités de transsaxe Tn5 ont été ajoutées lors de la préparation de la bibliothèque. La condition de 1,25 μL de Tn5 montre des signaux de fond plus élevés (surlignés en jaune), tandis que les deux autres conditions semblent similaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Distribution de la taille des fragments d’ADN des bibliothèques ATAC-seq. (A) Les bibliothèques ATAC-seq ont été préparées en utilisant les numéros de cellules indiqués. Les données ATAC-seq de la condition d’entrée de 25 000 cellules ont montré l’enrichissement le plus élevé de fragments exempts de nucléosomes, tandis que la condition d’entrée de 100 000 cellules présentait les ADN mononucléosomaux les plus élevés. (B) Pistes du navigateur génomique montrant les données ATAC-seq de différents numéros de cellules. (C) Analyse de l’annotation du pic d’Homère. Chaque pic a été classé comme un pic proximal ou distal promoteur par Homère29. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom | Séquence |
| ESR1 C Forward | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C Inverse | CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC |
| ESR1 K Forward | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K Inverse | TGTCTCTCTTTCTGTGTGATTCCC |
| ESR1 L Forward | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L Inverse | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
Tableau 1 : Liste des amorces utilisées dans cette étude.
| Escalier | Température | Heure | Cycle |
| Combler les lacunes | 72 °C | 5 min | 1 |
| Dénaturation initiale | 98 °C | 30 s | 1 |
| Dénaturation | 98 °C | 10 s | 5 |
| Recuit | 63 °C | 30 s | |
| Extension | 72 °C | 1 min | |
| Tenir | 4 °C | pour toujours |
Tableau 2 : Programme d’amplification de la PCR, partie 1.
| Escalier | Température | Cycle |
| Dénaturation initiale | 98 °C 30 s | 1 |
| Dénaturation | 98 °C 10 s | 20 |
| Recuit | 63 °C 30 s | |
| Extension | 72 °C 1 min | |
| Plaque lue |
Tableau 3 : paramètres qPCR.
| Escalier | Température | Heure | Cycle |
| Dénaturation initiale | 98 °C | 30 s | 1 |
| Dénaturation | 98 °C | 10 s | Nombre total de cycles calculés à l’étape 6.4 |
| Recuit | 63 °C | 30 s | |
| Extension | 72 °C | 1 min | |
| Tenir | 4 °C | pour toujours |
Tableau 4 : Programme d’amplification de la PCR, partie 2.
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Discussion
ATAC-seq a été largement utilisé pour cartographier les régions de chromatine ouvertes et actives. La progression des cellules cancéreuses est souvent provoquée par des altérations génétiques et une reprogrammation épigénétique, ce qui entraîne une altération de l’accessibilité de la chromatine et de l’expression des gènes. Un exemple de cette reprogrammation est observé au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et de son processus inverse, la transition mésenchymateuse-épithéliale (MET), qui sont connus pour être des processus clés de reprogrammation cellulaire au cours des métastases tumorales30. Un autre exemple est l’acquisition d’une résistance aux médicaments contre les thérapies hormonales est souvent observée dans les tumeurs luminales du sein31. ATAC-seq est utile pour surveiller de telles altérations phénotypiques cellulaires au niveau de la chromatine et peut être utilisé pour prédire une cellule d’origine et des sous-types de cancer4.
Pour mesurer précisément le remodelage de la chromatine par ATAC-seq, l’établissement d’un protocole reproductible et cohérent est nécessaire. Dans ce manuscrit, une stratégie standard pour l’optimisation des bibliothèques ATAC-seq est décrite. Les données ATAC-seq des lignées cellulaires MDA-MB-231 et NMuMG sont utilisées comme exemples de processus d’optimisation. Les cellules NMuMG ont été utilisées pour étudier l’EMT, et les cellules MDA-MB-231 ont été utilisées pour étudier son processus inverse, MET. Ces modèles cellulaires ont déjà été utilisés pour étudier les altérations épigénétiques au cours de l’EMT et du MET13,32. L’utilisation d’un tampon approprié pour la lyse cellulaire et la concentration de Tn5 est l’élément clé d’une préparation réussie de la bibliothèque ATAC-seq. En plus de ces composants, un pourcentage élevé (>90%) de viabilité cellulaire, des concentrations appropriées de détergent dans le tampon de lyse et la préparation de la suspension unicellulaire sont également très importants. Lorsque l’efficacité de la digestion Tn5 est significativement différente d’un échantillon à l’autre, il est difficile de corriger les variations de données. Cela est dû à l’absence de contrôles internes et externes pour évaluer quantitativement l’efficacité de la digestion. Les caractéristiques ou propriétés cellulaires peuvent également être différentes entre les cellules du groupe témoin et les cellules du groupe test. Par conséquent, un examen attentif des conditions expérimentales, y compris le choix du tampon de lyse, est nécessaire pour obtenir des données ATAC-seq de haute qualité des deux groupes expérimentaux (Figure 5 et Figure 6).
Outre le profilage ouvert de la chromatine, ATAC-seq a été utilisé pour identifier les empreintes de facteurs de transcription et le positionnement des nucléosomes 8,33. Il est important de noter que ces informations proviennent principalement de régions ouvertes de chromatine (Figure 1F). Par conséquent, les résultats seraient biaisés en faveur des régions ouvertes de la chromatine. Néanmoins, ATAC-seq est un outil puissant pour étudier l’architecture de la chromatine. Cet outil révolutionnaire a été adopté plus récemment pour la génomique unicellulaire et continue de contribuer à améliorer notre compréhension de la régulation des gènes et de la biologie de la chromatine.
DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Les données présentées dans ce protocole sont disponibles à Gene Expression Omnibus sous le numéro d’acquisition GSE202791. Les données ATAC-seq de GSE72141 et GSE99479 ont également été utilisées dans l’analyse.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers pertinents ou matériels liés à la recherche décrite dans cet article.
Acknowledgments
Nous remercions l’installation UND Genomics Core pour son assistance technique exceptionnelle.
Ce travail a été financé par les National Institutes of Health [P20GM104360 à M.T., P20 GM104360 à A.D.] et des fonds de démarrage fournis par l’École de médecine et des sciences de la santé de l’Université du Dakota du Nord, Département des sciences biomédicales [à M.T.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
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