Summary
ATAC-seq היא שיטת ריצוף DNA המשתמשת בטרנספוזאז מוטנטי היפראקטיבי, Tn5, כדי למפות שינויים בנגישות הכרומטין המתווכים על ידי גורמי שעתוק. ATAC-seq מאפשר לגלות את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס שינויים פנוטיפיים בתאים סרטניים. פרוטוקול זה מתווה הליכי אופטימיזציה עבור ATAC-seq בסוגי תאי אפיתל, כולל תאים סרטניים.
Abstract
הבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (ATAC-seq) בודקת נגישות של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) באמצעות טרנספוזאז Tn5 היפראקטיבי. Tn5 חותך ומתיר מתאמי לריצוף בתפוקה גבוהה באזורי כרומטין נגישים. בתאים אאוקריוטים, הדנ"א הגנומי נארז בכרומטין, קומפלקס של דנ"א, היסטונים וחלבונים אחרים, המשמש כמחסום פיזי למנגנון השעתוק. בתגובה לאותות חיצוניים, גורמי שעתוק מגייסים קומפלקסים לעיצוב מחדש של כרומטין כדי לאפשר גישה למנגנוני השעתוק להפעלת גנים. לכן, זיהוי אזורי כרומטין פתוחים שימושי בעת ניטור פעילויות משפר ומקדם גנים במהלך אירועים ביולוגיים כגון התקדמות הסרטן. מכיוון שפרוטוקול זה קל לשימוש ויש לו דרישת קלט תאים נמוכה, ATAC-seq אומץ באופן נרחב כדי להגדיר אזורי כרומטין פתוחים בסוגי תאים שונים, כולל תאים סרטניים. לרכישת נתונים מוצלחת, יש לקחת בחשבון מספר פרמטרים בעת הכנת ספריות ATAC-seq. ביניהם, הבחירה של חיץ תזה תאים, טיטרציה של אנזים Tn5, ואת נפח ההתחלה של תאים חיוניים להכנת ספריית ATAC-seq בתאים סרטניים. אופטימיזציה חיונית ליצירת נתונים באיכות גבוהה. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של שיטות האופטימיזציה של ATAC-seq עבור סוגי תאי אפיתל.
Introduction
נגישות כרומטין היא דרישת מפתח לוויסות ביטוי גנים בקנה מידה גנומירחב 1. שינויים בנגישות הכרומטין קשורים לעתים קרובות למספר מצבי מחלה, כולל סרטן 2,3,4. במהלך השנים פותחו טכניקות רבות המאפשרות לחוקרים לחקור את נוף הכרומטין על ידי מיפוי אזורים של נגישות כרומטין. חלקם כוללים את DNase-seq (ריצוף אתרים רגישים ל-DNase I)5, FAIRE-seq (בידוד בסיוע פורמלדהיד של אלמנטים רגולטוריים)6, MAPit (פרוטוקול נגישות מתיל-טרנספראז לתבניות בודדות)7, והמוקד של מאמר זה, ATAC-seq (בדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז)8. DNase-seq ממפה אזורים נגישים על ידי שימוש בתכונה מרכזית של DNase, כלומר עיכול מועדף של דנ"א עירום ללא היסטונים וחלבונים אחרים כגון גורמי שעתוק5. FAIRE-seq, בדומה ל-ChIP-seq, משתמש בהצלבת פורמלדהיד ובסוניקציה, למעט העובדה שאין צורך במיצוי חיסוני, והאזורים נטולי הנוקלאוזומים מבודדים על ידי מיצוי פנול-כלורופורם6. שיטת MAPit משתמשת במתיל-טרנספראז GC כדי לחקור את מבנה הכרומטין ברזולוציה של מולקולה בודדת7. ATAC-seq מסתמך על הטרנספוזאז ההיפראקטיבי, Tn58. הטרנספוזאז Tn5 נקשר באופן מועדף לאזורי כרומטין פתוחים ומכניס מתאמי ריצוף לאזורים נגישים. Tn5 פועל באמצעות מנגנון "גזור והדבק" בתיווך DNA, לפיו הטרנספוזאז הטעון מראש במתאמים נקשר לאתרי כרומטין פתוחים, חותך דנ"א ומקפיץ את המתאמים8. אזורים מאוגדים Tn5 משוחזרים על ידי הגברת PCR באמצעות פריימרים המתאימים למתאמים אלה. FAIRE-seq ו- DNase-seq דורשים כמות גדולה של חומר מוצא (~ 100,000 תאים עד 225,000 תאים) ושלב הכנה נפרד של הספרייה לפני ריצוף9. מצד שני, פרוטוקול ATAC-seq הוא פשוט יחסית ודורש מספר קטן של תאים (<50,000 תאים)10. שלא כמו טכניקות FAIRE-seq ו- DNase-seq, הכנת ספריית הריצוף של ATAC-seq קלה יחסית, מכיוון שדגימת ה- DNA המבודדת כבר מתויגת עם מתאמי הריצוף על ידי Tn5. לכן, יש צורך רק בשלב ההגברה של ה-PCR עם פריימרים מתאימים כדי להשלים את הכנת הספרייה, ואין צורך לבצע את שלבי העיבוד הקודמים כגון תיקון קצה וקשירת מתאם, ובכך לחסוך זמן11. שנית, ATAC-seq מונע את הצורך בהמרה, שיבוט והגברה של ביסולפיטים עם פריימרים ספציפיים לאזור הנדרשים עבור MAPit7. בשל יתרונות אלה, ATAC-seq הפך לשיטה פופולרית מאוד להגדרת אזורי כרומטין פתוחים. למרות ששיטת ATAC-seq פשוטה, שלבים מרובים דורשים אופטימיזציה כדי להשיג נתונים באיכות גבוהה וניתנים לשחזור. כתב יד זה דן בהליכי אופטימיזציה להכנת ספריית ATAC-seq סטנדרטית, במיוחד תוך הדגשת שלושה פרמטרים: (1) הרכב חיץ תזה, (2) ריכוז טרנספוזאז Tn5, ו-(3) מספר תא. בנוסף, מאמר זה מספק נתונים לדוגמה מתנאי האופטימיזציה תוך שימוש הן בתאי אפיתל סרטניים והן בתאי אפיתל שאינם סרטניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנות לפני תחילת הניסוי
- הכינו מלאי מאגר תזה.
הערה: מאגר הבידוד הגרעיני האופטימלי יכול להיות שונה עבור כל סוג תא. אנו ממליצים לבדוק הן את המאגר ההיפוטוני ששימש בניירהמקורי 8 והן את מאגרCSK 12,13 עבור כל סוג תא באמצעות צביעה כחולה טריפאן.- כדי להכין חיץ היפוטוני (חיץ Greenleaf), יש לערבב 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, ו-0.1% NP-40.
- כדי להכין מאגר CSK, יש לערבב 10 mM PIPES pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM סוכרוז, 3 mM MgCl2, ו 0.1% Triton X-100.
- ודא שתנאי תרבית התאים הם אופטימליים; לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שאין רמות גבוהות של אפופטוזיס.
- הפעל את הצנטריפוגה כדי לאפשר לה להגיע ל -4 מעלות צלזיוס.
2. קציר תאים
- שאפו מדיה מתרבית תאים במפגש של <80%. תאים גדלים בדרך כלל בצלחת של 35 מ"מ או 60 מ"מ, בהתבסס על מספר התאים הדרושים, טיפולים וכו '.
- לשטוף את התאים עם 1 מ"ל או 3 מ"ל של PBS.
- מוסיפים 0.5 מ"ל או 1 מ"ל של טריפסין ודוגרים במשך 2-3 דקות (בהתאם לסוגי התאים). בזהירות להשתמש פיפטה 1 מ"ל לערבב היטב.
- מוסיפים 1 מ"ל או 2 מ"ל של מדיה לצלחת ומערבבים היטב. העברה לצינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה של התאים בצינור 15 מ"ל במשך 3 דקות ב 300 x גרם.
הערה: מומלץ להשתמש ברוטור דלי מתנדנד כדי למזער את אובדן התא. - לשאוף את התקשורת ולהשעות את התאים ב 1 מ"ל או 2 מ"ל של בינוני.
הערה: חיוני להכין תמיסה הומוגנית חד-תאית. עבור רקמות, ניתן להשתמש בהומוגנייזר של Dounce כדי ליצור הומוגניזציה של רקמות ולמזער גושים גדולים של תאים או אגרגטים. רקמות מסוימות דורשות סינון (למשל, מסננות תאים) ו/או מיון תאי FACS כדי לבודד תאים בני קיימא ולקבל פתרון של תא בודד. - ספירת התאים באמצעות מונה תאים.
הערה: במחקר זה נעשה שימוש במונה תאים אוטומטי (טבלת חומרים). - צנטריפוגה של נפח התא הנדרש (למשל, נפח המכיל 1 x 106 תאים בהתבסס על ספירת תאים) ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- יש להשעות את כדור התא המכיל 1 x 106 תאים ב-1 מ"ל של PBS קר.
הערה: אם מספרי התאים קטנים מ- 1 x 10 6 תאים, הקטן את נפח ה- PBS הקר כדי להכין את תמיסת התא באותו ריכוז (1 x 106 תאים / מ"ל).
3. תזה תאית
- העבר 25 μL (= 2.5 x 104 תאים ) לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.7 מ"ל. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך בזהירות את supernatant
הערה: מומלץ להשתמש ברוטור דלי מתנדנד כדי למזער את אובדן התא. השאירו כ-3 מיקרוגרם של סופר-נטנט כדי להבטיח שהתאים לא יושלכו. - הוסף 25 μL של חיץ ליזה והשהה את התאים על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה. דגירה על קרח במשך 5 דקות
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך בזהירות את supernatant.
הערה: מומלץ להשתמש ברוטור דלי מתנדנד כדי למזער את אובדן התא. השאירו כ-3 מיקרוגרם של סופר-נטנט כדי להבטיח שהתאים לא יושלכו.
4. תיוג Tn5
- מיד להחיות את הכדור ב 25 μL של תערובת תגובה Tn5. תערובת התגובה של Tn5 היא כדלקמן: 12.5 μL של 2x מאגר DNA תיוג (מאגר TD), 1.25-5 μL של טרנספוזאז Tn5, ו 11.25-7.5 μL של מים ללא נוקלאז.
הערה: הריכוז הסטנדרטי של Tn5 הוא 2.5 μL עבור 2.5 x 104 תאים . - דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: ערבבו את התמיסה כל 10 דקות.
5. טיהור DNA
הערה: טיהור נדרש לפני הגברה. טיהור הדנ"א נעשה באמצעות ערכת הטיהור MinElute PCR (טבלת חומרים).
- יש להוסיף 5 μL של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2).
- הוסיפו מיד 125 μL של Buffer PB וערבבו היטב.
- עקוב אחר פרוטוקול ערכת הטיהור PCR החל משלב 2.
- מניחים את עמוד הספין בצינור איסוף של 2 מ"ל.
- החל את הדגימה על עמודת הסיבוב והצנטריפוגה למשך דקה אחת ב- 17,900 x g ב- RT.
- השליכו את הזרימה והנחו את עמודת הסיבוב בחזרה באותו צינור איסוף.
- הוסף 750 μL של Buffer PE לעמוד הספין ולצנטריפוגה למשך דקה אחת ב- 17,900 x g ב- RT.
- השליכו את הזרימה והנחו את עמודת הסיבוב בחזרה באותו צינור איסוף.
- צנטריפוגה עמוד ספין במשך 5 דקות כדי לייבש את הממברנה לחלוטין.
- השליכו את הזרימה והנחו את עמודת הספין בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.7 מ"ל.
- שדרגו את מקטעי הדנ"א עם 10 μL של Buffer EB.
- תן לעמודה לעמוד במשך דקה אחת ב- RT.
- צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-17,900 x גרם ב-RT כדי לחדד את הדנ"א.
6. הגברת PCR
הערה: הגברת PCR של DNAs שעברו חילוף (תיוג) נחוצה לריצוף. מתאמי ערכת Nextera (טבלת חומרים) שימשו בדוגמה זו. הפריימרים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלה 1.
- הגדר את תגובת ה-PCR הבאה בצינורות PCR של 200 μL (50 μL עבור כל דגימה). תערובת תגובת ה- PCR היא כדלקמן: 10 μL של DNA eluted (שלב 5.), 2.5 μL של 25 mM מתאם 1, 2.5 μL של 25 mM מתאם 2, 25 μL של 2x PCR תערובת מאסטר, ו 10 μL של מים ללא נוקלאז
- ביצוע תוכנית הגברה PCR חלק 1 (טבלה 2).
הערה: עבור הגברה ראשונית, אותם תנאים משמשים עבור כל הדגימות באמצעות מחזור תרמי סטנדרטי. - qPCR בזמן אמת (סה"כ 14.5 μL לדגימה)
- באמצעות 5 μL של המוצר מהגברת PCR חלק 1 (שלב 6.2.), הגדר את התגובה הבאה, הפעם כולל זהב SYBR וזיהוי במכונת PCR בזמן אמת.
- הכן את תערובת תגובת ה- PCR באופן הבא: 5 μL של מוצר PCR משלב 6.2., 0.75 μL של זהב SYBR (1000x מדולל), 5 μL של 2x PCR תערובת מאסטר, ו 3.75 μL של מים ללא נוקלאזות.
הערה: מספרי המחזור המדויקים להגברת ספרייה לפני הגעה לרוויה עבור כל דגימה נקבעים על-ידי qPCR (טבלה 3) כדי להפחית את הטיית ה-GC והגודל ב-PCR10. SYBR Gold היה מדולל במים נטולי נוקלאז. כדי לייצר את התמיסה המדוללת, 1 μL של זהב SYBR (ריכוז מלאי 10,000x) נוספה 999 μL של מים ללא נוקלאזות. זמן הריצה של RT-qPCR המוזכר בטבלה 3 הוא כ-60 דקות.
- קבע את המספר הנדרש של מחזורי PCR נוספים באמצעות פרמטרי ההפעלה משלב 6.3.
- מספר מחזורים = 1/4 עוצמת פלואורסצנטיות מרבית (רוויה) (בדרך כלל 3 או 4 מחזורי PCR)
- תוכנית הגברה PCR חלק 2 (נפח = 45 μL; טבלה 4): לאחר שתקבע את מספר המחזור, הגדר PCR עם מחזורים נוספים המחושבים בשלב 6.4.1. לדוגמה, אם מספר המחזור המחושב הוא 3, הגדר 3 מחזורים בתוכנית שלהלן. סך המחזורים יהיה 8 (5 בשלב 6.2., ועוד 3 מחזורים נוספים בשלב 6.5.)
7. טיהור חרוזים
הערה: כאן, נעשה שימוש בחרוזי AMPure XP (טבלת חומרים).
- למוצרי ה-PCR שהוגברו בשלב הקודם, הוסיפו 150 מיקרון ליטר של חרוזים ב-RT.
הערה: ניתן להשתמש בחרוזי AMPure תוצרת בית14 בתהליך זה. - דגירה במשך 15 דקות ב- RT.
- הניחו את הצינורות על מעמד מגנטי למשך 5 דקות.
- הסר בזהירות את הסופרנטנט.
- לשטוף את החרוזים עם 200 μL של 80% אתנול.
הערה: 80% אתנול צריך להיות מוכן טרי. - חזור על שלב 7.4.
- הסר את האתנול לחלוטין.
- ייבשו את הדגימות באוויר למשך 10 דקות ב-RT.
- יש לחדש עם 50 μL של חיץ אלוציה (10 mM Tris-HCL pH 8.0).
- חזור על טיהור החרוזים (שלבים 7.1.-7.9.) כדי למזער עוד יותר את זיהום הפריימר.
8. ריכוז DNA ובדיקת איכות
- מדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ערכת כימות חומצות גרעין (טבלת חומרים).
- בדוק את מקטעי הדנ"א המוגברים על ידי אלקטרופורזה בג'ל באמצעות SYBR Gold (0.5x TBE, 1.5% ג'ל אגרוז) או מערכת אלקטרופורזה אוטומטית (למשל, TapeStation, bioanalyzer).
9. רצף
- בצע ריצוף בתפוקה גבוהה באמצעות דגימות הדנ"א המוגברות12,13.
הערה: דגימות דנ"א מוגברות מוכנות לריצוף בתפוקה גבוהה. כדי לשמור על מידע על מקטעי דנ"א נוקלאוזומליים, מומלץ לבצע ריצוף קצה מזווג על פני ריצוף חד-צדדי. שני הקצוות של מקטעי הדנ"א מציינים היכן נקשר הטרנספוזאז. למיפוי אזורי כרומטין פתוחים, 30 מיליון קריאות/דגימות מספיקות בדרך כלל.
10. ניתוח נתונים
- סינון נתונים המבוסס על איכות השיחה הבסיסית: הגדר את ציון האיכות הבסיסי הממוצע המינימלי ל-20 (דיוק של 99%).
- חיתוך מתאם: הסר את רצפי המתאמים באמצעות כלי מתאים.
הערה: כלי עטיפת Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) שימש להסרת רצפי מתאמים. עבור ספריות ATAC-seq שהוכנו על ידי Illumina Tn5, הרצף הבא משמש כרצף מתאם: CTGTCTTATACACATCT. אורך הרצף המינימלי לזיהוי זיהום מתאם מוגדר ל- 5. - מיפוי גנום: מפה את הקריאות לגנום המתאים עם Bowtie באמצעות הפרמטרים הבאים "-I 0 -X 2000 -m 1"15. להלן דוגמה למיפוי איכות מתאי סרטן שד בסיסיים מסוג MDA-MB-231:
קורא עם לפחות יישור מדווח אחד: 52.79%
קריאות שלא התיישרו: 13.10%
קריאות עם יישורים שהודחקו עקב -m: 34.11% - מניעת כפילויות: סמן את כפילויות ה-PCR על-ידי כלי פיקארד16.
- יצירת קובץ כיסוי גנומי להדמיית נתונים: המר את הקריאות הזוגיות ללא כפילויות למקטעי קריאה חד-צדדיים. מסלולי כיסוי גנום מתקבלים באמצעות genomeCoverageBed מ- bedtools17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להשיג נתוני ATAC-seq מוצלחים ואיכותיים, חשוב לייעל את תנאי הניסוי. ניתן להפריד את הכנת ספריית ATAC-seq לחמשת השלבים העיקריים (איור 1), כלומר תזה של תאים, תיוג (פיצול והכנסת מתאם על ידי Tn5), טיהור DNA גנומי, הגברה של PCR וניתוח נתונים. כתהליך ראשוני, יש למטב תחילה את מאגר התזה (בידוד גרעיני) עבור כל סוג תא. החיץ ההיפוטוני שתואר במאמר ATAC-seqהמקורי 8 או חיץCSK 12,13 שימש לליטוף תאי סרטן השד. ניתן להשתמש בכתמים כחולים של טריפאן כדי לאשר את בידוד הגרעינים18. להכנת ספריית ATAC-seq בקווי תאים סרטניים אנושיים כגון MDA-MB-231, T47D, MCF7 ותאי A375, מאגר CSK שימש מספר קבוצות12,13,19,20. חיץ CSK שימש גם להכנת ספריית ATAC-seq בסוגי תאים אחרים כגון תאי גזע עובריים 21,22 ותאי Drosophila S2 23. לאופטימיזציה של מאגר התזה, מכתים כחולים של טריפאן שימושיים להערכת יעילות התזה של התאים. כאשר NMuMG, תאי אפיתל של בלוטת החלב של עכברים שאינם סרטניים, טופלו במאגר ההיפוטוני8 (ראו שלב 1) ובמאגר CSK, נצפתה יעילות תזה גבוהה יותר בתאים שטופלו ב-CSK (איור 2). עבור רקמות קפואות, הוכח כי Omni-ATAC משפר את אותות ATAC-seq24. ב- Omni-ATAC, מאגר המכיל 0.1% NP40, 0.1% Tween-20 ו- 0.01% Digitonin משמש לתזה של תאים. למרות שידוע כי המאגר המבוסס על Digitonin מפחית את החלק של הדנ"א המיטוכונדריאלי, יחסי האות לרעש וספירות הקריאה של TSS מ-ATAC-seq עם חיץ CSK הוכחו כטובים יותר מאלו של Omni-ATAC בתאי סרטן השד12. לכן, שאר כתב היד הזה מתמקד בעיקר בתוצאות מנתוני ATAC-seq עם מאגר CSK.
בעקבות קביעת התנאים הטובים ביותר של חיץ תזה (בידוד גרעיני), חשוב למטב את היחסים בין מספר תא הקלט לבין ריכוז טרנספוזאז Tn512,25. בדרך כלל, ריכוז Tn5 יכול להיות titrated על ידי שינוי נפח של Tn5 מ 1.25 μL, 2.5 μL, ל 5 μL בנפח כולל של 25 μL תערובת תגובה. לחלופין, ניתן לשנות את מספרי תאי הקלט (לדוגמה, מ-10,000 ל-100,000), תוך שמירה על האנזים Tn5 ללא שינוי ב-2.5 μL כדי למטב את תגובת התיוג Tn5. כדי להעריך את האיכות של ספריות ATAC-seq ואת היעילות של עיכול כרומטין המושרה על ידי Tn5, ניתן לנתח את מוצרי ה- PCR של הספרייה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. איור 3 מציג דוגמאות לספריות ATAC-seq מוצלחות. בדרך כלל, הגברה PCR של 8 או 9 מחזורים (סה"כ מחזורי PCR כולל PCR ראשוני) מביאה לריכוז ספריית ATAC-seq של 3-6 ננוגרם/μL. מכיוון ש-Tn5 מעדיף "לתקוף" אזורים נטולי נוקלאוזומים בכרומטין פתוח (איור 1), סולמות הנוקלאוזום צריכים להיות ברורים בתמונת הג'ל (איור 3). ניתן להשתמש באתידיום ברומיד או ב-SYBR Gold כדי לזהות DNAs מוגברים על ג'ל האגרוז.
לאחר מכן, ניתוח qPCR באמצעות ספריות ATAC-seq יכול לשמש כדי לבדוק בקצרה את איכות הספריות ואת העשרת השברים באזורי כרומטין פתוחים כגון מקדמי גנים פעילים (איור 4). ניתן לתכנן פריימרים כדי ליצור אמפליקונים של <80 bp באמצעות מקדמים של גנים פעילים ידועים כבקרות חיוביות ואזורי כרומטין "סגורים" (לא פעילים) ידועים כבקרות שליליות (איור 4A). בין התנאים שנבדקו, העשרה גבוהה יותר נצפתה בספריות T47D ATAC-seq עם מאגר CSK (איור 4B). כצפוי, מצאנו יותר העשרה באמצעות פריימרים K ו-L באזור מקדם הגנים אלפא של קולטן אסטרוגן אלפא (ESR1) ביחס לאזור סגור במעלה הזרם של ESR1 עם פריימר C (איור 4B)26. איור 5 מציג דוגמאות לנתוני ATAC-seq עם ריכוזי Tn5 שונים (נעשה שימוש ב-25,000 תאים). במקרה זה, רעשי רקע גבוהים יותר זוהו במצב הנמוך ביותר (1.25 μL של Tn5) Tn5 (איור 5, פסים אנכיים). נתוני ATAC-seq מ-2.5 μL או 5 μL של Tn5 הראו רמות דומות של אותות ATAC-seq באזורי כרומטין פתוחים עם אותות רקע נמוכים יותר. בהתחשב בעיכול יתר פוטנציאלי על ידי Tn5 בריכוז גבוה יותר, ניתן להסיק כי 2.5 μL של Tn5 מתאים לסוג תא זה.
ביצענו גם את ה-ATAC-seq באמצעות מספרי תאים שונים בתאי NMuMG, המשמשים לעתים קרובות לחקר המעבר האפיתליאלי-מזנכימלי (איור 6). כדי למטב את אמצעי האחסון ההתחלתי, ארבעה מספרי תאים שונים (25,000, 50,000, 75,000 ו- 100,000) שימשו למיטוב ספריית ATAC-seq. התאים הודגמו עם חיץ CSK, וגרעינים דוגרו עם 2.5 μL של טרנספוזאז Tn5 ב 25 μL של תערובת התגובה. כדי לחקור את היעילות של עיכול Tn5 וסולמות נוקלאוזומליים, התפלגות הגודל של דנ"א שהוכנס נותחה באופן ביואינפורמטי (איור 6A). כאשר נעשה שימוש במספרי תאים נמוכים יותר, מקטעי דנ"א נטולי נוקלאוזומים (<100 bp) היו מועשרים יותר בנתוני הריצוף. מצד שני, החלק של מקטעי דנ"א מונו-נוקלאוזומליים (175-225 bp) היה פחות בדגימות קלט התאים הנמוכות (25,000 תאים ו-50,000 תאים) בהשוואה לתנאי קלט גבוהים יותר של תאים (75,000 תאים ו-100,000 תאים). אף על פי שנצפו תבניות מקטעי דנ"א דיפרנציאליים בין הדגימות, נראה כי למספר תאי הקלט הייתה השפעה מינימלית על העשרת אותות ATAC-seq במקדמים ובאזורי כרומטין פתוחים אחרים (איור 6B). כדי להמשיך ולחקור את ההשפעה של מספרי תאי קלט על ניתוח במורד הזרם, הוגדרו פסגות ATAC-seq. פסגות ATAC-seq נקבעו על ידי תוכנית קריאת השיא PeaKDEck27 באמצעות הפרמטרים הבאים: -sig 0.0001 -bin 300 -back 3,000 -npBack 2,500,000. מתוך ~4.9 מיליון קריאות ממופות באופן ייחודי, 38,878, 43,832, 41,509 ו-45,530 פסגות נצפו בנתוני ATAC-seq מ-25,000, 50,000, 75,000 ו-100,000 כניסות תאים, בהתאמה. מצב הקלט של 100,000 תאים הראה את המספר הגבוה ביותר של פסגות. מכיוון שציון ההעשרה של אתר התחלת התמלול (TSS) שימש להערכת האיכות של נתוני ATAC-seq, ציון ה- TSS של כל תנאי ATAC-seq חושב באמצעות תוכנית GitHub: Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28. ציוני ה-TSS עבור תנאי הקלט של 25,000, 50,000, 75,000 ו-100,000 תאים היו 9.03, 9,02, 8.82 ו-8.28, בהתאמה (ציון העשרת TSS נחשב לאידיאלי אם הוא גדול מ-7,28). זה הצביע על ירידה הדרגתית בציון ההעשרה של TSS עם עלייה במספר התאים. בעוד שמספר השיא הגדול ביותר נצפה בתנאי קלט של 100,000 תאים, מצב הקלט של 25,000 תאים נתן ציון TSS טוב יותר. ניתוח ביאור שיאים על ידי הומרוס29 הצביע על כך שרוב הפסגות המוגדלות מסווגות כפסגות דיסטליות מקדימות (איור 6C). בהתבסס על תוצאות אלה, ניתן להסיק כי קלט מספר התאים הגבוה יותר יכול לייצר מספר גבוה יותר של פסגות ולעתים קרובות יותר לזהות שיאים שאינם מקדמים בהשוואה לתשומות מספר התאים הנמוך יותר במצב זה.
איור 1: מתווה שיטת ATAC-seq. (A) ATAC-seq מודד את נגישות הכרומטין באמצעות טרנספוזאז Tn5 היפראקטיבי הטעון מראש במתאמים קדימה ואחורה. השלבים השונים בתהליך כוללים (B) תזה של תאים (כולל אופטימיזציה של הרכב מאגר התזה, טיטרציה של Tn5 ומספר התאים המשמשים); (C) טרנספוזיציה (קשירת Tn5 לכרומטין פתוח/נגיש); (D) תיוג של כרומטין; (E) טיהור מקטעי דנ"א והגברה של ספריות, ו-(ו) ריצוף ספריות וניתוח נתונים. ניתוח התפלגות אורך השבר של ספריות ATAC-seq מראה בדרך כלל שיא ראשוני סביב ~50 bp (אזורים נטולי נוקלאוזום) ושיא נוסף ב~200 bp (מונו-נוקלאוזום). לכן, ללא סינון בגודל חישובי או ניסיוני, אותות ATAC-seq מכילים גם אזורים נטולי נוקלאוזומים וגם אזורים נוקלאוזומליים בכרומטין פתוח. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: השוואה של יעילות תזה של תאים באמצעות כחול טריפאן. (A) תאי NMuMG טופלו בחיץ היפוטוני8 והוכתמו בכחול טריפאן. (B) תאי NMuMG טופלו במאגר CSK והוכתמו בכחול טריפאן. פסי קנה המידה מציינים 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניתוח מוגבר של מקטעי דנ"א של ספריות ATAC-seq. ספריות ATAC-seq הוכנו מתאי סרטן שד MDA-MB-231. (A) לאחר הגברה של PCR, מוצרי PCR נותחו על גבי TBE של 0.5x, ג'ל אגרוז של 1.5% לפני ואחרי טיהור חרוזים. פריימרים מוסרים בעיקר על ידי טיהור החרוזים הראשוני. כמו כן מסומנות תבניות פס דנ"א מ- (B) 1x TAE, אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1% ו- (C) אלקטרופורזה אוטומטית. SYBR Gold שימש להמחשת מקטעי הדנ"א המוצגים ב-A וב-B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניתוח העשרה של ספריות ATAC-seq . (A) מסלול דפדפן גנום המציג את מוקד ESR1. מוצג כיסוי הגנום של נתוני ATAC-seq בתאי T47D20 . פריימרים מפרסום קודם שימשו26, ואזורי היעד שלהם מודגשים בצהוב. (B) גרף עמודות המתאר העשרת אמפליקון פריימר בספריות ATAC-seq. ספריות ATAC-seq הוכנו על ידי המאגר ההיפוטוני או מאגר CSK. ריכוזים שונים של Tn5 שימשו גם ליצירת ספריות ATAC-seq. 1 ng של כל ספריה שימש לביצוע qPCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הדמיית דפדפן גנום למיטוב ATAC-seq. כמויות שונות של טרנספוזות Tn5 נוספו במהלך הכנת הספרייה. התנאי 1.25 μL של Tn5 מראה אותות רקע גבוהים יותר (מודגשים בצהוב), בעוד ששני התנאים האחרים נראים דומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: התפלגות גודל מקטעי דנ"א של ספריות ATAC-seq. (A) ספריות ATAC-seq הוכנו באמצעות מספרי התאים שצוינו. נתוני ATAC-seq ממצב הקלט של 25,000 תאים הראו את ההעשרה הגבוהה ביותר של שברים נטולי נוקלאוזומים, בעוד שתנאי הקלט של 100,000 תאים הציגו את הדנ"א החד-נוקלאוזומלי הגבוה ביותר. (B) מסלולי דפדפן גנום המציגים נתוני ATAC-seq ממספרי תאים שונים. (C) ניתוח ביאור שיא הומרוס. כל פסגה סווגה כפסגה מקדימה-פרוקסימלית או דיסטלית על ידי הומרוס29. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| שם | רצף |
| ESR1 C קדימה | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C הפוך | CTCCTCCGTTGAATGTCTCC |
| ESR1 K קדימה | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K הפוך | TGTCTCTCTTTCTGTTTGATTCCC |
| ESR1 L קדימה | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L הפוך | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC) |
טבלה 1: רשימת הפריימרים ששימשו במחקר זה.
| שלבים | טמפרטורה | זמן | מחזור |
| מילוי הפער | 72 °C | 5 דק' | 1 |
| דנטורציה ראשונית | 98 °C | 30 שניות | 1 |
| דנטורציה | 98 °C | 10 שניות | 5 |
| חישול | 63 °C | 30 שניות | |
| סיומת | 72 °C | 1 דקות | |
| אחז | 4 °C | לנצח |
טבלה 2: תוכנית הגברת PCR חלק 1.
| שלבים | טמפרטורה | מחזור |
| דנטורציה ראשונית | 98 °C 30 שניות | 1 |
| דנטורציה | 98 °C 10 שניות | 20 |
| חישול | 63 °C 30 שניות | |
| סיומת | 72 °C 1 דקות | |
| קריאת צלחת |
טבלה 3: הגדרות qPCR.
| שלבים | טמפרטורה | זמן | מחזור |
| דנטורציה ראשונית | 98 °C | 30 שניות | 1 |
| דנטורציה | 98 °C | 10 שניות | סה"כ מחזורים מחושבים בשלב 6.4 |
| חישול | 63 °C | 30 שניות | |
| סיומת | 72 °C | 1 דקות | |
| אחז | 4 °C | לנצח |
טבלה 4: תוכנית הגברה PCR חלק 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ATAC-seq נמצא בשימוש נרחב למיפוי אזורי כרומטין פתוחים ופעילים. התקדמות התאים הסרטניים מונעת לעתים קרובות על ידי שינויים גנטיים ותכנות מחדש אפיגנטי, וכתוצאה מכך משתנה נגישות הכרומטין וביטוי הגנים. דוגמה לתכנות מחדש זה נראית במהלך המעבר האפיתל למזנכימלי (EMT) והתהליך ההפוך שלו, מעבר מזנכימלי לאפיתליאלי (MET), הידועים כתהליכי תכנות מחדש תאיים מרכזיים במהלך גרורות גידול30. דוגמה נוספת היא רכישת עמידות לתרופות נגד טיפולים הורמונליים נצפית לעתים קרובות בגידולי שד לומינליים31. ATAC-seq שימושי לניטור שינויים פנוטיפיים כאלה בתאים ברמת הכרומטין וניתן להשתמש בו כדי לחזות תא מוצא ותת-סוגים של סרטן4.
כדי למדוד במדויק שיפוץ כרומטין על ידי ATAC-seq, יש צורך בהקמת פרוטוקול הניתן לשחזור ועקבי. בכתב יד זה מתוארת אסטרטגיה סטנדרטית לאופטימיזציה של ספריית ATAC-seq. נתוני ATAC-seq מקווי התאים MDA-MB-231 ו- NMuMG משמשים כדוגמאות לתהליכי אופטימיזציה. תאי NMuMG שימשו לחקר EMT, ותאי MDA-MB-231 שימשו לחקר התהליך ההפוך שלו, MET. מודלים תאיים אלה שימשו בעבר לחקר שינויים אפיגנטיים במהלך EMT ו- MET13,32. השימוש במאגר מתאים לתזה של תאים ולריכוז Tn5 הוא מרכיב המפתח בהכנה מוצלחת של ספריית ATAC-seq. בנוסף לרכיבים אלה, אחוז גבוה (>90%) של כדאיות התא, ריכוזים מתאימים של דטרגנט במאגר התזה, והכנת ההשעיה החד-תאית חשובים גם הם. כאשר יעילות העיכול של Tn5 שונה באופן משמעותי בין דגימות, קשה לתקן וריאציות נתונים. זאת בשל היעדר בקרות פנימיות וחיצוניות להערכה כמותית של יעילות העיכול. המאפיינים או המאפיינים התאיים עשויים גם להיות שונים בין התאים מקבוצת הביקורת לעומת התאים מקבוצת הבדיקה. לכן, יש צורך בשיקול דעת זהיר של תנאי הניסוי, כולל בחירת מאגר התזה, כדי לקבל נתוני ATAC-seq באיכות גבוהה משתי קבוצות הניסוי (איור 5 ואיור 6).
מלבד פרופיל כרומטין פתוח, ATAC-seq שימש לזיהוי עקבות של גורמי שעתוק ומיקום נוקלאוזום 8,33. חשוב לציין שמידע כזה נגזר בעיקר מאזורי כרומטין פתוחים (איור 1F). לכן, התוצאות יהיו מוטות לכיוון אזורי כרומטין פתוחים. עם זאת, ATAC-seq הוא כלי רב עוצמה לחקר ארכיטקטורת כרומטין. כלי מהפכני זה אומץ לאחרונה עבור גנומיקה חד-תאית וממשיך לתרום לשיפור הבנתנו את ויסות הגנים ואת הביולוגיה של הכרומטין.
זמינות נתונים:
הנתונים המוצגים בפרוטוקול זה זמינים באומניבוס ביטוי גנים תחת מספר גישה GSE202791. נתוני ATAC-seq מ- GSE72141 ו- GSE99479 שימשו גם בניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כספיים רלוונטיים או מהותיים המתייחסים למחקר המתואר במאמר זה.
Acknowledgments
אנו מודים למתקן הליבה הגנומית של UND על הסיוע הטכני יוצא הדופן.
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [P20GM104360 עד M.T., P20 GM104360 עד A.D.] וקרנות סטארט-אפ שסופקו על ידי בית הספר לרפואה ומדעי הבריאות של אוניברסיטת צפון דקוטה, המחלקה למדעים ביו-רפואיים [ל- M.T.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
