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Cancer Research

कैंसर एपिजेनेटिक्स अनुसंधान के लिए एटीएसी-सेक अनुकूलन

Published: June 30, 2022 doi: 10.3791/64242
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, 2Dana-Farber Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

एटीएसी-सेक एक डीएनए अनुक्रमण विधि है जो प्रतिलेखन कारकों द्वारा मध्यस्थता वाले क्रोमैटिन पहुंच में परिवर्तन को मैप करने के लिए हाइपरएक्टिव म्यूटेंट ट्रांसपोसेस, टीएन 5 का उपयोग करती है। एटीएसी-सेक कैंसर कोशिकाओं में फेनोटाइपिक परिवर्तनों को अंतर्निहित आणविक तंत्र की खोज को सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल कैंसर कोशिकाओं सहित उपकला कोशिका प्रकारों में एटीएसी-सेक के लिए अनुकूलन प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है।

Abstract

उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख हाइपरएक्टिव टीएन 5 ट्रांसपोसेस का उपयोग करके डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए) पहुंच की जांच करती है। टीएन 5 सुलभ क्रोमैटिन क्षेत्रों के भीतर उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए एडेप्टर को काटता है और लेगेट करता है। यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, जीनोमिक डीएनए को क्रोमैटिन में पैक किया जाता है, डीएनए, हिस्टोन और अन्य प्रोटीन का एक परिसर, जो ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी के लिए एक भौतिक बाधा के रूप में कार्य करता है। बाह्य संकेतों के जवाब में, प्रतिलेखन कारक जीन सक्रियण के लिए ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी तक पहुंच को सक्षम करने के लिए क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग कॉम्प्लेक्स की भर्ती करते हैं। इसलिए, कैंसर की प्रगति जैसी जैविक घटनाओं के दौरान एन्हांसर और जीन प्रमोटर गतिविधियों की निगरानी करते समय खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों की पहचान करना उपयोगी होता है। चूंकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना आसान है और इसमें कम सेल इनपुट आवश्यकता है, इसलिए कैंसर कोशिकाओं सहित विभिन्न सेल प्रकारों में खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए एटीएसी-सेक को व्यापक रूप से अपनाया गया है। सफल डेटा अधिग्रहण के लिए, एटीएसी-सेक पुस्तकालयों को तैयार करते समय कई मापदंडों पर विचार करने की आवश्यकता होती है। उनमें से, सेल लाइसिस बफर की पसंद, टीएन 5 एंजाइम का अनुमापन, और कोशिकाओं की शुरुआती मात्रा कैंसर कोशिकाओं में एटीएसी-सेक लाइब्रेरी की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है। उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करने के लिए अनुकूलन आवश्यक है। यहां, हम उपकला कोशिका प्रकारों के लिए एटीएसी-सेक अनुकूलन विधियों का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं।

Introduction

जीनोम-वाइड स्केल1 पर जीन अभिव्यक्ति के नियमन के लिए क्रोमैटिन पहुंच एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। क्रोमैटिन पहुंच में परिवर्तन अक्सर कई रोग अवस्थाओं से जुड़े होते हैं, जिनमें कैंसर 2,3,4 शामिल हैं। वर्षों से, शोधकर्ताओं को क्रोमैटिन पहुंच के क्षेत्रों के मानचित्रण द्वारा क्रोमैटिन परिदृश्य की जांच करने में सक्षम बनाने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है। उनमें से कुछ में DNase-seq (DNase I अतिसंवेदनशील साइट अनुक्रमण) 5, FAIRE-seq (नियामक तत्वों का फॉर्मलाडेहाइड-सहायता प्राप्त अलगाव) 6, MAPit (व्यक्तिगत टेम्पलेट्स के लिए मेथिलट्रांसफेरेज़ एक्सेसिबिलिटी प्रोटोकॉल) 7, और इस पेपर का फोकस, एटीएसी-सेक (ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख) 8 शामिल हैं। DNase-seq DNase की एक प्रमुख विशेषता को नियोजित करके सुलभ क्षेत्रों को मैप करता है, अर्थात् हिस्टोन और प्रतिलेखनकारकों जैसे अन्य प्रोटीनों से मुक्त नग्न डीएनए का अधिमान्य पाचन। एफआईईई-सेक, सीएचआईपी-सेक के समान, फॉर्मलाडेहाइड क्रॉसलिंकिंग और सोनिकेशन का उपयोग करता है, सिवाय इसके कि कोई इम्यूनोप्रेसिपेशन शामिल नहीं है, और न्यूक्लियोसोम-मुक्त क्षेत्रों को फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण 6 द्वारा अलगकिया जाता है। एमएपीआईटी विधि एकल-अणु संकल्प 7 पर क्रोमैटिन संरचना की जांच करने के लिए जीसी मेथिलट्रांसफेरेज़ का उपयोग करतीहै। एटीएसी-सेक हाइपरएक्टिव ट्रांसपोसेस, टीएन 5 8 पर निर्भर करताहै। टीएन 5 ट्रांसपोसेस अधिमानतः खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों को बांधता है और सुलभ क्षेत्रों में अनुक्रमण एडाप्टर डालता है। टीएन 5 एक डीएनए-मध्यस्थता "कट एंड पेस्ट" तंत्र के माध्यम से संचालित होता है, जिससे एडाप्टर के साथ प्रीलोडेड ट्रांसपोसेज खुले क्रोमैटिन साइटों को बांधता है, डीएनए को काटता है, और एडेप्टर8 को बंद करता है। टीएन 5 बाध्य क्षेत्रों को पीसीआर प्रवर्धन द्वारा प्राइमरों का उपयोग करके पुनर्प्राप्त किया जाता है जो इन एडाप्टर को नष्ट करते हैं। FAIRE-seq और DNase-seq को बड़ी मात्रा में प्रारंभिक सामग्री (~ 100,000 कोशिकाओं से 225,000 कोशिकाओं) और अनुक्रमण9 से पहले एक अलग पुस्तकालय तैयारी चरण की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है और इसके लिए कम संख्या में कोशिकाओं (<50,000 कोशिकाओं) 10 की आवश्यकता होती है। FAIRE-seq और DNase-seq तकनीकों के विपरीत, एटीएसी-सेक की अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी अपेक्षाकृत आसान है, क्योंकि पृथक डीएनए नमूने को पहले से ही Tn5 द्वारा अनुक्रमण एडाप्टर के साथ टैग किया जा रहा है। इसलिए, लाइब्रेरी की तैयारी को पूरा करने के लिए उपयुक्त प्राइमरों के साथ केवल पीसीआर प्रवर्धन चरण की आवश्यकता होती है, और पूर्व प्रसंस्करण चरणों जैसे कि एंड-रिपेयर और एडाप्टर लिगेशन को निष्पादित करने की आवश्यकता नहीं होती है, इस प्रकार समयकी बचत होती है। दूसरे, एटीएसी-सेक एमएपीआईटी 7 के लिए आवश्यक क्षेत्र-विशिष्ट प्राइमरों के साथ बाइसल्फाइट रूपांतरण, क्लोनिंग और प्रवर्धन की आवश्यकता से बचताहै। इन फायदों के कारण, एटीएसी-सेक खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए एक बेहद लोकप्रिय तरीका बन गया है। यद्यपि एटीएसी-सेक विधि सरल है, लेकिन उच्च गुणवत्ता और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए कई चरणों को अनुकूलन की आवश्यकता होती है। यह पांडुलिपि मानक एटीएसी-सेक लाइब्रेरी तैयार करने के लिए अनुकूलन प्रक्रियाओं पर चर्चा करती है, विशेष रूप से तीन मापदंडों पर प्रकाश डालती है: (1) लाइसिस बफर संरचना, (2) टीएन 5 ट्रांसपोसेस एकाग्रता, और (3) सेल नंबर। इसके अलावा, यह पेपर कैंसर और गैर-कैंसर वाले अनुयायी उपकला कोशिकाओं दोनों का उपयोग करके अनुकूलन स्थितियों से उदाहरण डेटा प्रदान करता है।

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Protocol

1. प्रयोग शुरू करने से पहले तैयारी

  1. लाइसिस बफर स्टॉक तैयार करें।
    नोट: इष्टतम परमाणु अलगाव बफर प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अलग हो सकता है। हम ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करके प्रत्येक सेल प्रकार के लिए मूल पेपर8 में उपयोग किए जाने वाले हाइपोटोनिक बफर और सीएसके बफर 12,13 दोनों का परीक्षण करने की सलाह देते हैं।
    1. हाइपोटोनिक बफर (ग्रीनलीफ बफर) तैयार करने के लिए, 10 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 7.4, 10 एमएम एनएसीएल, 3 एमएम एमजीसीएल2, और 0.1% एनपी -40 मिलाएं।
    2. सीएसके बफर तैयार करने के लिए, 10 एमएम पाइप पीएच 6.8, 100 एमएम एनएसीएल, 300 एमएम सुक्रोज, 3 एमएम एमजीसीएल2 और 0.1% ट्राइटन एक्स -100 मिलाएं।
  2. सुनिश्चित करें कि सेल संस्कृति की स्थिति इष्टतम है; यह सुनिश्चित करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें कि एपोप्टोसिस का कोई ऊंचा स्तर नहीं है।
  3. सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए चालू करें।

2. सेल की फसल

  1. कोशिकाओं की संस्कृति से एस्पिरेटेड मीडिया <80% स्थिरता पर। कोशिकाओं को आमतौर पर 35 मिमी या 60 मिमी डिश में उगाया जाता है, जो आवश्यक कोशिकाओं की संख्या, उपचार आदि पर आधारित होता है।
  2. कोशिकाओं को 1 एमएल या 3 एमएल पीबीएस से धोएं।
  3. ट्रिप्सिन के 0.5 एमएल या 1 एमएल जोड़ें और 2-3 मिनट (सेल प्रकारों के आधार पर) के लिए इनक्यूबेट करें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए सावधानीपूर्वक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें।
  4. प्लेट में 1 एमएल या 2 एमएल मीडिया डालें और अच्छी तरह मिलाएं। 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 300 x g पर 3 मिनट के लिए 15 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: सेल हानि को कम करने के लिए एक स्विंगिंग बकेट रोटर की सिफारिश की जाती है।
  5. मीडिया को उत्तेजित करें और कोशिकाओं को 1 एमएल या 2 एमएल माध्यम में पुन: निलंबित करें।
    नोट: एक समरूप एकल-कोशिका समाधान तैयार करना महत्वपूर्ण है। ऊतकों के लिए, एक डौंस होमोजेनाइज़र का उपयोग ऊतकों को समरूप बनाने और बड़े सेल क्लंप या समुच्चय को कम करने के लिए किया जा सकता है। कुछ ऊतकों को व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करने और एकल सेल समाधान प्राप्त करने के लिए निस्पंदन (जैसे, सेल स्ट्रेनर) और / या एफएसीएस सेल सॉर्टिंग की आवश्यकता होती है।
  6. सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: इस अध्ययन में, एक स्वचालित सेल काउंटर (सामग्री की तालिका) का उपयोग किया गया था।
  7. कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर आवश्यक सेल वॉल्यूम (उदाहरण के लिए, सेल काउंट के आधार पर 1 x 106 कोशिकाओं वाला वॉल्यूम) सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. ठंडे पीबीएस के 1 एमएल में 1 x 106 कोशिकाओं वाले सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
    नोट: यदि सेल संख्या 1 x 106 कोशिकाओं से कम है, तो उसी एकाग्रता (1 x 106 कोशिकाओं / एमएल) पर सेल समाधान तैयार करने के लिए ठंडे पीबीएस की मात्रा कम करें।

3. सेल लाइसिस

  1. एक नए 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 25 μL (= 2.5 x 104 कोशिकाएं) स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 500 x g 4 डिग्री सेल्सियस पर और सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक छोड़ दें
    नोट: सेल हानि को कम करने के लिए एक स्विंगिंग बकेट रोटर की सिफारिश की जाती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को छोड़ा नहीं जा रहा है, लगभग 3 μL सुपरनैटेंट छोड़ दें।
  2. लाइसिस बफर के 25 μL जोड़ें और कोमल पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें
  3. सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 500 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर और सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक छोड़ दें।
    नोट: सेल हानि को कम करने के लिए एक स्विंगिंग बकेट रोटर की सिफारिश की जाती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को छोड़ा नहीं जा रहा है, लगभग 3 μL सुपरनैटेंट छोड़ दें।

4. Tn5 टैगमेंटेशन

  1. तुरंत टीएन 5 प्रतिक्रिया मिश्रण के 25 μL में गोली को पुन: निलंबित करें। Tn5 प्रतिक्रिया मिश्रण निम्नानुसार है: 2x टैगमेंटेशन डीएनए बफर (TD बफर) का 12.5 μL, Tn5 ट्रांसपोसेस का 1.25-5 μL, और न्यूक्लियस-मुक्त पानी का 11.25-7.5 μL।
    नोट: Tn5 की मानक सांद्रता 2.5 x 104 कोशिकाओं के लिए 2.5 μL है।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: हर 10 मिनट में घोल मिलाएं।

5. डीएनए शुद्धिकरण

नोट: प्रवर्धन से पहले शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है। डीएनए शुद्धिकरण मिनएल्यूट पीसीआर शुद्धिकरण किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके किया जाता है।

  1. 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) का 5 μL जोड़ें।
  2. तुरंत बफर पीबी का 125 μL जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
  3. चरण 2 से शुरू होने वाले पीसीआर शुद्धिकरण किट प्रोटोकॉल का पालन करें।
    1. स्पिन कॉलम को 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें।
    2. नमूने को स्पिन कॉलम पर लागू करें और आरटी पर 17,900 x g पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. प्रवाह-माध्यम को छोड़ दें और स्पिन कॉलम को उसी संग्रह ट्यूब में वापस रखें।
    4. स्पिन कॉलम में 750 μL बफर पीई जोड़ें और RT पर 17,900 x g पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. प्रवाह-माध्यम को छोड़ दें और स्पिन कॉलम को उसी संग्रह ट्यूब में वापस रखें।
    6. झिल्ली को पूरी तरह से सूखने के लिए 5 मिनट के लिए स्पिन कॉलम को सेंट्रीफ्यूज करें।
    7. प्रवाह-माध्यम को छोड़ दें और स्पिन कॉलम को एक नए 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
    8. बफर ईबी के 10 μL के साथ डीएनए टुकड़ों का विश्लेषण करें।
    9. आरटी पर कॉलम को 1 मिनट के लिए खड़े रहने दें।
    10. डीएनए को अलग करने के लिए आरटी पर 1 मिनट के लिए 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।

6. पीसीआर प्रवर्धन

नोट: अनुक्रमण के लिए ट्रांसपोज़्ड (टैग किए गए) डीएनए का पीसीआर प्रवर्धन आवश्यक है। इस उदाहरण में नेक्स्टेरा किट एडाप्टर (सामग्री की तालिका) का उपयोग किया गया था। इस अध्ययन में उपयोग किए गए प्राइमर तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।

  1. 200 μL पीसीआर ट्यूबों (प्रत्येक नमूने के लिए 50 μL) में निम्नलिखित पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें। पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण निम्नानुसार है: 10 μL एल्यूटेड डीएनए (चरण 5.), 25 mM एडाप्टर 1 का 2.5 μL, 25 mM एडाप्टर का 2.5 μL, 2x PCR मास्टर मिक्स का 25 μL, और न्यूक्लियस-मुक्त पानी का 10 μL
  2. पीसीआर प्रवर्धन कार्यक्रम भाग 1 (तालिका 2) निष्पादित करें।
    नोट: प्रारंभिक प्रवर्धन के लिए, एक मानक थर्मल साइकिलर का उपयोग करके सभी नमूनों के लिए समान स्थितियों का उपयोग किया जाता है।
  3. रीयल-टाइम QPCR (प्रति नमूना कुल 14.5 μL)
    1. पीसीआर प्रवर्धन भाग 1 (चरण 6.2.) से उत्पाद के 5 μL का उपयोग करते हुए, निम्नलिखित प्रतिक्रिया सेट करें, जिसमें इस बार SYBR सोना और वास्तविक समय पीसीआर मशीन में पता लगाना शामिल है।
    2. पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण निम्नानुसार तैयार करें: चरण 6.2 से पीसीआर उत्पाद का 5 μL, SYBR सोने का 0.75 μL (1000x पतला), 2x PCR मास्टर मिश्रण का 5 μL, और न्यूक्लियस-मुक्त पानी का 3.75 μL।
      नोट: पीसीआर10 में जीसी और आकार पूर्वाग्रह को कम करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए संतृप्ति तक पहुंचने से पहले लाइब्रेरी प्रवर्धन के लिए सटीक चक्र संख्या क्यूपीसीआर (तालिका 3) द्वारा निर्धारित की जाती है। SYBR Gold को न्यूक्लियस मुक्त पानी से पतला किया गया था। पतला घोल बनाने के लिए, 1 μL SYBR Gold (स्टॉक एकाग्रता 10,000x) को न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 999 μL में जोड़ा गया था। तालिका 3 में उल्लिखित आरटी-क्यूपीसीआर का रन टाइम लगभग 60 मिनट है।
  4. चरण 6.3 से रन पैरामीटर का उपयोग करके अतिरिक्त पीसीआर चक्रों की आवश्यक संख्या निर्धारित करें।
    1. चक्रों की संख्या = 1/4 अधिकतम (संतृप्त) प्रतिदीप्ति तीव्रता (आमतौर पर 3 या 4 पीसीआर चक्र)
  5. पीसीआर प्रवर्धन कार्यक्रम भाग 2 (मात्रा = 45 μL; तालिका 4): एक बार जब आप चक्र संख्या निर्धारित करते हैं, तो चरण 6.4.1 पर गणना किए गए अतिरिक्त चक्रों के साथ पीसीआर सेट करें। उदाहरण के लिए, यदि गणना की गई चक्र संख्या 3 है, तो नीचे दिए गए प्रोग्राम में 3 चक्र सेट करें। कुल चक्र 8 होगा (चरण 6.2 में 5, साथ ही चरण 6.5 में 3 अतिरिक्त चक्र।

7. मोतियों का शुद्धिकरण

नोट: यहां, AMPure XP (सामग्री की तालिका) मोतियों का उपयोग किया गया था।

  1. पिछले चरण में प्रवर्धित पीसीआर उत्पादों में, आरटी पर 150 μL मोती जोड़ें।
    नोट: इस प्रक्रिया में घर का बना एएमप्योर मोती14 का उपयोग किया जा सकता है।
  2. आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. ट्यूबों को 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें।
  4. सुपरनैटेंट को सावधानी से हटा दें।
  5. मोतियों को 80% इथेनॉल के 200 μL के साथ धो लें।
    नोट: 80% इथेनॉल ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
  6. चरण 7.4 दोहराएँ।
  7. इथेनॉल को पूरी तरह से हटा दें।
  8. आरटी पर 10 मिनट के लिए नमूने को हवा में सुखाएं।
  9. 50 μL क्षालन बफर (10 mM Tris-HCL pH 8.0) के साथ पुन: निलंबित करें।
  10. प्राइमर संदूषण को और कम करने के लिए मोतियों की शुद्धि (चरण 7.1.-7.9.) को दोहराएं।

8. डीएनए एकाग्रता और गुणवत्ता की जांच

  1. न्यूक्लिक एसिड परिमाणीकरण किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता को मापें।
  2. एसवाईबीआर गोल्ड (0.5x TBE, 1.5% Agarose gel) या एक स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली (जैसे, टेपस्टेशन, बायोएनालाइज़र) का उपयोग करके जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रवर्धित डीएनए टुकड़ों की जांच करें।

9. अनुक्रमण

  1. प्रवर्धित डीएनए नमूने12,13 का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण करें।
    नोट: प्रवर्धित डीएनए नमूने उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए तैयार हैं। न्यूक्लियोसोमल डीएनए टुकड़े की जानकारी को बनाए रखने के लिए, एकल-अंत अनुक्रमण पर युग्मित-अंत अनुक्रमण की सिफारिश की जाती है। डीएनए टुकड़ों के दोनों छोर इंगित करते हैं कि ट्रांसपोसेस कहां बंधता है। खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों के मानचित्रण के लिए, 30 मिलियन रीड / नमूना आमतौर पर पर्याप्त है।

10. डेटा विश्लेषण

  1. बेस कॉल गुणवत्ता के आधार पर डेटा निस्पंदन: न्यूनतम औसत आधार गुणवत्ता स्कोर को 20 (99% सटीकता) पर सेट करें।
  2. एडाप्टर ट्रिमिंग: एक उपयुक्त उपकरण का उपयोग करके एडाप्टर अनुक्रमों को निकालें।
    नोट: ट्रिम गैलोर रैपर टूल (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) का उपयोग एडाप्टर अनुक्रमों को हटाने के लिए किया गया था। इलुमिना Tn5 द्वारा तैयार एटीएसी-सेक पुस्तकालयों के लिए, निम्नलिखित अनुक्रम का उपयोग एडाप्टर अनुक्रम के रूप में किया जाता है: CTGTCTTATACACT। एडाप्टर संदूषण को पहचानने के लिए न्यूनतम अनुक्रम लंबाई 5 पर सेट है।
  3. जीनोम मैपिंग: निम्नलिखित मापदंडों "-I 0-X 2000-m 1"15 का उपयोग करके बोटी के साथ उपयुक्त जीनोम में रीड को मैप करें। एमडीए-एमबी -231 बेसल स्तन कैंसर कोशिकाओं से मानचित्रण गुणवत्ता का एक उदाहरण नीचे दिया गया है:
    कम से कम एक रिपोर्ट किए गए संरेखण के साथ पढ़ें: 52.79%
    पढ़ता है कि संरेखित करने में विफल रहा: 13.10%
    -m के कारण संरेखण दबाए जाने के साथ पढ़ता है: 34.11%
  4. डीडुप्लिकेशन: पिकार्ड टूल्स16 द्वारा पीसीआर डुप्लिकेट को चिह्नित करें।
  5. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक जीनोम कवरेज फ़ाइल उत्पन्न करना: डिडुप्लिकेटेड पेयर-एंड रीड रीड को सिंगल-एंड रीड टुकड़ों में परिवर्तित करें। जीनोम कवरेज ट्रैक बेडटूल्स17 से जीनोम कवरेज बेड का उपयोग करके प्राप्त किए जाते हैं।

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Representative Results

सफल और उच्च गुणवत्ता वाले एटीएसी-सेक डेटा प्राप्त करने के लिए, प्रयोगात्मक स्थितियों को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। एटीएसी-सेक लाइब्रेरी की तैयारी को पांच प्रमुख चरणों (चित्रा 1) में विभाजित किया जा सकता है, अर्थात् सेल लाइसिस, टैगमेंटेशन (टीएन 5 द्वारा विखंडन और एडाप्टर सम्मिलन), जीनोमिक डीएनए शुद्धिकरण, पीसीआर प्रवर्धन और डेटा विश्लेषण। प्रारंभिक प्रक्रिया के रूप में, सेल लाइसिस (परमाणु अलगाव) बफर को पहले प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। या तो मूल एटीएसी-सेक पेपर8 में वर्णित हाइपोटोनिक बफर या सीएसके बफर12,13 का उपयोग स्तन कैंसर कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया था। ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग नाभिक अलगाव18 की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। मानव कैंसर सेल लाइनों जैसे एमडीए-एमबी -231, टी 47 डी, एमसीएफ 7 और ए 375 कोशिकाओं में एटीएसी-सेक लाइब्रेरी की तैयारी के लिए, सीएसके बफर का उपयोग कईसमूहों 12,13,19,20 द्वारा किया गया है। सीएसके बफर का उपयोग अन्य सेल प्रकारों जैसे भ्रूण स्टेम सेल21,22 और ड्रोसोफिला एस 2 कोशिकाओं 23 में एटीएसी-सेक लाइब्रेरी तैयारीके लिए भी किया गया था। लाइसिस बफर अनुकूलन के लिए, ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग सेल लाइसिस दक्षता का आकलन करने के लिए उपयोगी है। जब एनएमयूएमजी, गैर-कैंसर माउस स्तन ग्रंथि उपकला कोशिकाओं का इलाज हाइपोटोनिक बफर8 (चरण 1 देखें) और सीएसके बफर के साथ किया गया था, तो सीएसके-उपचारित कोशिकाओं में उच्च सेल लाइसिस दक्षता देखी गई थी (चित्रा 2)। जमे हुए ऊतकों के लिए, ओमनी-एटीएसी को एटीएसी-सेक सिग्नल24 में सुधार करने के लिए दिखाया गया है। ओमनी-एटीएसी में, सेल लाइसिस के लिए 0.1% एनपी 40, 0.1% ट्वीन -20 और 0.01% डिजिटोनिन युक्त एक बफर का उपयोग किया जाता है। यद्यपि डिजिटोनिन-आधारित बफर को माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के अंश को कम करने के लिए जाना जाता है, लेकिन सीएसके बफर के साथ एटीएसी-सेक से सिग्नल-टू-शोर अनुपात और टीएसएस रीड काउंट को स्तन कैंसर कोशिकाओं12 में ओमनी-एटीएसी की तुलना में बेहतर दिखाया गया था। इसलिए, इस पांडुलिपि का बाकी हिस्सा मुख्य रूप से सीएसके बफर के साथ एटीएसी-सेक डेटा के परिणामों पर केंद्रित है।

सर्वश्रेष्ठ सेल लाइसिस बफर (परमाणु अलगाव) स्थितियों के निर्धारण के बाद, इनपुट सेल नंबर और टीएन 5 ट्रांसपोसेस एकाग्रता12,25 के बीच अनुपात को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। आमतौर पर, Tn5 सांद्रता को Tn5 की मात्रा को 1.25 μL, 2.5 μL से 5 μL तक 25 μL प्रतिक्रिया मिश्रण की कुल मात्रा में बदलकर टाइट किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इनपुट सेल नंबर ों को बदला जा सकता है (उदाहरण के लिए, 10,000 से 100,000 तक), जबकि Tn5 टैगमेंटेशन प्रतिक्रिया को अनुकूलित करने के लिए Tn5 एंजाइम को 2.5 μL पर अपरिवर्तित बनाए रखा जा सकता है। एटीएसी-सेक पुस्तकालयों की गुणवत्ता और टीएन 5-प्रेरित क्रोमैटिन पाचन की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, लाइब्रेरी पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा किया जा सकता है। चित्रा 3 सफल एटीएसी-सेक पुस्तकालयों के उदाहरण दिखाता है। आमतौर पर, 8 या 9 चक्रों (प्रारंभिक पीसीआर सहित कुल पीसीआर चक्र) के पीसीआर प्रवर्धन के परिणामस्वरूप 3-6 एनजी / चूंकि टीएन 5 अधिमानतः खुले क्रोमैटिन (चित्रा 1) में न्यूक्लियोसोम-मुक्त क्षेत्रों पर "हमला" करता है, न्यूक्लियोसोम सीढ़ी जेल छवि (चित्रा 3) पर स्पष्ट होनी चाहिए। एथिडियम ब्रोमाइड या एसवाईबीआर गोल्ड का उपयोग एगारोस जेल पर प्रवर्धित डीएनए का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

इसके बाद, एटीएसी-सेक पुस्तकालयों का उपयोग करके क्यूपीसीआर विश्लेषण का उपयोग पुस्तकालयों की गुणवत्ता और सक्रिय जीन के प्रमोटरों जैसे खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों में टुकड़े संवर्धन की संक्षेप में जांच करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 4)। प्राइमरों को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में ज्ञात सक्रिय जीन के प्रमोटरों का उपयोग करके <80 बीपी एम्प्लिकॉन उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में "बंद" (निष्क्रिय) क्रोमैटिन क्षेत्रों को जाना जाता है (चित्रा 4 ए)। परीक्षण की गई स्थितियों में, सीएसके बफर (चित्रा 4 बी) के साथ टी 47 डी एटीएसी-सेक पुस्तकालयों में उच्च संवर्धन देखा गया था। जैसा कि अपेक्षित था, हमने प्राइमर सी (चित्रा 4 बी) 26 के साथ ईएसआर 1 के बंद क्षेत्र के सापेक्ष एस्ट्रोजेन रिसेप्टर अल्फा (ईएसआर 1) जीन प्रमोटर क्षेत्र में प्राइमर के और एल का उपयोग करके अधिक संवर्धन पाया। चित्रा 5 विभिन्न टीएन 5 सांद्रता के साथ एटीएसी-सेक डेटा के उदाहरण दिखाता है (25,000 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था)। इस मामले में, उच्च पृष्ठभूमि शोर का पता सबसे कम (Tn5 के 1.25 μL) Tn5 स्थिति (चित्रा 5, ऊर्ध्वाधर सलाखों) में लगाया गया था। टीएन 5 के 2.5 μL या 5 μL से एटीएसी-सेक डेटा ने कम पृष्ठभूमि संकेतों के साथ खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों में एटीएसी-सेक संकेतों के समान स्तर दिखाए। उच्च सांद्रता पर Tn5 द्वारा संभावित अति-पाचन को ध्यान में रखते हुए, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि Tn5 का 2.5 μL इस सेल प्रकार के लिए उपयुक्त है।

हमने एनएमयूएमजी कोशिकाओं में विभिन्न सेल संख्याओं का उपयोग करके एटीएसी-सेक का भी प्रदर्शन किया, जिसका उपयोग अक्सर उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (चित्रा 6) का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। शुरुआती मात्रा को अनुकूलित करने के लिए, एटीएसी-सेक लाइब्रेरी अनुकूलन के लिए चार अलग-अलग सेल नंबर (25,000, 50,000, 75,000 और 100,000) का उपयोग किया गया था। कोशिकाओं को सीएसके बफर के साथ जोड़ा गया था, और नाभिक को प्रतिक्रिया मिश्रण के 25 μL में Tn5 ट्रांसपोसेस के 2.5 μL के साथ इनक्यूबेट किया गया था। टीएन 5 पाचन और न्यूक्लियोसोमल सीढ़ी की प्रभावकारिता का पता लगाने के लिए, सम्मिलित डीएनए के आकार वितरण का जैव सूचना विज्ञान से विश्लेषण किया गया था (चित्रा 6 ए)। जब कम सेल संख्याओं का उपयोग किया गया था, तो न्यूक्लियोसोम-मुक्त डीएनए टुकड़े (<100 बीपी) अनुक्रमण डेटा में अधिक समृद्ध थे। दूसरी ओर, उच्च सेल इनपुट स्थितियों (75,000 कोशिकाओं और 100,000 कोशिकाओं) की तुलना में कम सेल इनपुट नमूनों (25,000 कोशिकाओं और 50,000 कोशिकाओं) में मोनो-न्यूक्लियोसोमल डीएनए टुकड़ों (175-225 बीपी) का अंश कम था। यद्यपि नमूनों के बीच अंतर डीएनए टुकड़ा पैटर्न देखा गया था, इनपुट सेल संख्या प्रमोटरों और अन्य खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों (चित्रा 6 बी) में एटीएसी-सेक संकेतों के संवर्धन पर न्यूनतम प्रभाव डालती है। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण पर इनपुट सेल नंबरों के प्रभाव की जांच करने के लिए, एटीएसी-सेक चोटियों को परिभाषित किया गया था। एटीएसी-सेक चोटियों को निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके PeaKDEck पीक कॉलिंग प्रोग्राम27 द्वारा निर्धारित किया गया था: -sig 0.0001 -bin 300 -back 3,000 -npBack 2,500,000। ~ 4.9 मिलियन विशिष्ट रूप से मैप किए गए रीड से, क्रमशः 25,000, 50,000, 75,000 और 100,000 सेल इनपुट से एटीएसी-सेक डेटा में 38,878, 43,832, 41,509 और 45,530 चोटियां देखी गईं। 100,000-सेल इनपुट स्थिति ने चोटियों की सबसे अधिक संख्या दिखाई। चूंकि ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट (टीएसएस) संवर्धन स्कोर का उपयोग एटीएसी-सेक डेटा की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए किया गया है, इसलिए प्रत्येक एटीएसी-सेक स्थिति के टीएसएस स्कोर की गणना गिटहब प्रोग्राम: जियानलिन / TSS_enrichment_score_calculation28 का उपयोग करके की गई थी। 25,000, 50,000, 75,000 और 100,000 सेल इनपुट स्थितियों के लिए टीएसएस स्कोर क्रमशः 9.03, 9,02, 8.82 और 8.28 थे (टीएसएस संवर्धन स्कोर को आदर्श माना जाता है यदि यह 728 से अधिक है)। इसने बढ़ती सेल संख्या के साथ टीएसएस संवर्धन स्कोर में क्रमिक कमी का संकेत दिया। जबकि 100,000 सेल इनपुट स्थिति में सबसे बड़ी पीक संख्या देखी गई थी, 25,000 सेल इनपुट स्थिति ने बेहतर टीएसएस स्कोर दिया। होमर29 द्वारा पीक एनोटेशन विश्लेषण ने संकेत दिया कि बढ़ी हुई चोटियों में से अधिकांश को प्रमोटर डिस्टल चोटियों (चित्रा 6 सी) के रूप में वर्गीकृत किया गया है। इन परिणामों के आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि उच्च सेल संख्या इनपुट अधिक संख्या में चोटियों का उत्पादन कर सकते हैं और इस स्थिति में कम सेल नंबर इनपुट की तुलना में अधिक बार गैर-प्रमोटर चोटियों का पता लगा सकते हैं।

Figure 1
(ए) एटीएसी-सेक फॉरवर्ड और रिवर्स एडेप्टर के साथ प्रीलोडेड हाइपरएक्टिव टीएन 5 ट्रांसपोसेस का उपयोग करके क्रोमैटिन पहुंच को मापता है। प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में (बी) सेल लाइसिस (लाइसिस बफर संरचना के अनुकूलन, टीएन 5 के अनुमापन और उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या सहित) शामिल हैं; (सी) ट्रांसपोज़िशन (टीएन 5 को खुले / सुलभ क्रोमैटिन से बांधना); (डी) क्रोमैटिन का टैगमेंटेशन; (ई) डीएनए टुकड़ा शुद्धिकरण और पुस्तकालयों का प्रवर्धन, और (एफ) पुस्तकालयों और डेटा विश्लेषण का अनुक्रमण। एटीएसी-सेक पुस्तकालयों के टुकड़े की लंबाई वितरण विश्लेषण आम तौर पर ~ 50 बीपी (न्यूक्लियोसोम-मुक्त क्षेत्रों) के आसपास एक प्रारंभिक शिखर और ~ 200 बीपी (मोनो-न्यूक्लियोसोम) पर एक और शिखर दिखाता है। इसलिए, कम्प्यूटेशनल या प्रयोगात्मक आकार निस्पंदन के बिना, एटीएसी-सेक संकेतों में खुले क्रोमैटिन में न्यूक्लियोसोम-मुक्त और न्यूक्लियोसोमल दोनों क्षेत्र होते हैं। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके सेल लाइसिस दक्षता की तुलना( ए) एनएमयूएमजी कोशिकाओं को हाइपोटोनिक बफर8 के साथ इलाज किया गया और ट्रिपैन ब्लू के साथ दाग दिया गया। (बी) एनएमयूएमजी कोशिकाओं को सीएसके बफर के साथ इलाज किया गया था और ट्रिपैन ब्लू के साथ दाग दिया गया था। स्केल पट्टियाँ 50 μm इंगित करती हैं. कृपया इस आरेख का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एटीएसी-सेक पुस्तकालयों का प्रवर्धित डीएनए टुकड़ा विश्लेषण। एटीएसी-सेक पुस्तकालयों को एमडीए-एमबी -231 स्तन कैंसर कोशिकाओं से तैयार किया गया था। (ए) पीसीआर प्रवर्धन के बाद, पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण 0.5x TBE पर किया गया था, मोतियों के शुद्धिकरण से पहले और बाद में 1.5% एगारोस जेल। प्राइमरों को ज्यादातर प्रारंभिक मोतियों के शुद्धिकरण द्वारा हटा दिया जाता है। (बी) 1 एक्स टीएई से डीएनए बैंड पैटर्न, 1% अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन और (सी) एक स्वचालित वैद्युतकणसंचलन भी इंगित किए जाते हैं। SYBR Gold का उपयोग A और B में दिखाए गए डीएनए टुकड़ों की कल्पना करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एटीएसी-सेक पुस्तकालयों का संवर्धन विश्लेषण। (ए) जीनोम ब्राउज़र ट्रैक ईएसआर 1 लोकस दिखाता है। टी 47 डी कोशिकाओं20 में एटीएसी-सेक डेटा का जीनोम कवरेज दिखाया गया है। पिछले प्रकाशन के प्राइमरों का उपयोग26 किया गया था, और उनके लक्षित क्षेत्रों को पीले रंग में हाइलाइट किया गया है। (बी) एटीएसी-सेक पुस्तकालयों में प्राइमर एम्प्लिकॉन संवर्धन को दर्शाने वाला बार ग्राफ। एटीएसी-सेक पुस्तकालयों को हाइपोटोनिक बफर या सीएसके बफर द्वारा तैयार किया गया था। एटीएसी-सेक पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए टीएन 5 की विभिन्न सांद्रता का भी उपयोग किया गया था। QPCR करने के लिए प्रत्येक पुस्तकालय के 1 ng का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एटीएसी-सेक अनुकूलन के लिए जीनोम ब्राउज़र विज़ुअलाइज़ेशन। पुस्तकालय की तैयारी के दौरान टीएन 5 ट्रांसपोसेस की विभिन्न मात्राओं को जोड़ा गया था। Tn5 स्थिति का 1.25 μL उच्च पृष्ठभूमि संकेत दिखाता है (पीले रंग में हाइलाइट किया गया है), जबकि अन्य दो स्थितियां समान दिखती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: एटीएसी-सेक पुस्तकालयों के डीएनए टुकड़े आकार का वितरण। (A) एटीएसी-सेक पुस्तकालयों को संकेतित सेल संख्याओं का उपयोग करके तैयार किया गया था। 25,000 सेल इनपुट स्थिति से एटीएसी-सेक डेटा ने न्यूक्लियोसोम-मुक्त टुकड़ों का उच्चतम संवर्धन दिखाया, जबकि 100,000 सेल इनपुट स्थिति ने उच्चतम मोनो-न्यूक्लियोसोमल डीएनए प्रस्तुत किया। (बी) जीनोम ब्राउज़र ट्रैक विभिन्न सेल नंबरों से एटीएसी-सेक डेटा दिखाते हैं। (सी) होमर पीक एनोटेशन विश्लेषण। प्रत्येक चोटी को होमर29 द्वारा प्रमोटर-समीपस्थ या डिस्टल पीक के रूप में वर्गीकृत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नाम अनुक्रम
ईएसआर 1 सी फॉरवर्ड TGGTGACTCATATTGACAAGCC
ईएसआर 1 सी रिवर्स CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC
ईएसआर 1 के फॉरवर्ड TGTGGCTGGCTGCGTATG
ईएसआर 1 के रिवर्स TGTCTCTCTCTCTTTGTTTTCCC
ईएसआर 1 एल फॉरवर्ड TGTGCCTGGGTGATTAAG
ईएसआर 1 एल रिवर्स CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC

तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों की सूची।

सीढ़ी तापमान समय चक्र
अंतराल भरना 72 °C 5 मिनट 1
प्रारंभिक विकृतीकरण 98 °C 30 s 1
विकृतीकरण 98 °C 10 s 5
एनीलिंग 63 °C 30 s
विस्तार 72 °C 1 मिनट
पकड 4 °C सदैव

तालिका 2: पीसीआर प्रवर्धन कार्यक्रम भाग 1।

सीढ़ी तापमान चक्र
प्रारंभिक विकृतीकरण 98 °C 30 s 1
विकृतीकरण 98 °C 10 s 20
एनीलिंग 63 °C 30 s
विस्तार 72 °C 1 मिनट
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तालिका 3: qPCR सेटिंग्स।

सीढ़ी तापमान समय चक्र
प्रारंभिक विकृतीकरण 98 °C 30 s 1
विकृतीकरण 98 °C 10 s चरण 6.4 पर गणना किए गए कुल चक्र
एनीलिंग 63 °C 30 s
विस्तार 72 °C 1 मिनट
पकड 4 °C सदैव

तालिका 4: पीसीआर प्रवर्धन कार्यक्रम भाग 2।

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Discussion

एटीएसी-सेक का व्यापक रूप से खुले और सक्रिय क्रोमैटिन क्षेत्रों के मानचित्रण के लिए उपयोग किया गया है। कैंसर सेल की प्रगति अक्सर आनुवंशिक परिवर्तन और एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग द्वारा संचालित होती है, जिसके परिणामस्वरूप क्रोमैटिन पहुंच और जीन अभिव्यक्ति में बदलाव होता है। इस रीप्रोग्रामिंग का एक उदाहरण उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) और इसकी रिवर्स प्रक्रिया, मेसेनकाइमल-टू-एपिथेलियल संक्रमण (एमईटी) के दौरान देखा जाता है, जिसे ट्यूमर मेटास्टेसिस30 के दौरान प्रमुख सेलुलर रीप्रोग्रामिंग प्रक्रियाओं के रूप में जाना जाता है। एक और उदाहरण हार्मोन थेरेपी के खिलाफ दवा प्रतिरोध का अधिग्रहण अक्सर ल्यूमिनल स्तन ट्यूमर31 में देखा जाता है। एटीएसी-सेक क्रोमैटिन स्तर पर ऐसे सेल फेनोटाइपिक परिवर्तनों की निगरानी के लिए उपयोगी है और इसका उपयोग मूल और कैंसरउपप्रकारों की कोशिका की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है।

एटीएसी-सेक द्वारा क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग को ठीक से मापने के लिए, एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुसंगत प्रोटोकॉल की स्थापना आवश्यक है। इस पांडुलिपि में, एटीएसी-सेक लाइब्रेरी अनुकूलन के लिए एक मानक रणनीति का वर्णन किया गया है। एमडीए-एमबी -231 और एनएमयूएमजी सेल लाइनों से एटीएसी-सेक डेटा का उपयोग अनुकूलन प्रक्रियाओं के उदाहरण के रूप में किया जाता है। एनएमयूएमजी कोशिकाओं का उपयोग ईएमटी का अध्ययन करने के लिए किया गया है, और एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं का उपयोग इसकी रिवर्स प्रक्रिया, एमईटी का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इन सेलुलर मॉडलों का उपयोग पहले ईएमटी और एमईटी13,32 के दौरान एपिजेनेटिक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। सेल लाइसिस और टीएन 5 एकाग्रता के लिए एक उपयुक्त बफर का उपयोग सफल एटीएसी-सेक लाइब्रेरी तैयारी का प्रमुख घटक है। इन घटकों के अलावा, सेल व्यवहार्यता का एक उच्च प्रतिशत (>90%), लाइसिस बफर में डिटर्जेंट की उचित सांद्रता, और एकल-सेल निलंबन की तैयारी भी बहुत महत्वपूर्ण है। जब टीएन 5 पाचन दक्षता नमूनों में काफी भिन्न होती है, तो डेटा भिन्नताओं को सही करना चुनौतीपूर्ण होता है। यह पाचन दक्षता का मात्रात्मक आकलन करने के लिए आंतरिक और बाहरी नियंत्रण की कमी के कारण है। सेलुलर विशेषताएं या गुण नियंत्रण समूह से कोशिकाओं बनाम परीक्षण समूह की कोशिकाओं के बीच भी भिन्न हो सकते हैं। इसलिए, दोनों प्रयोगात्मक समूहों (चित्रा 5 और चित्रा 6) से उच्च गुणवत्ता वाले एटीएसी-सेक डेटा प्राप्त करने के लिए लाइसिस बफर की पसंद सहित प्रयोगात्मक स्थितियों का सावधानीपूर्वक विचार आवश्यक है।

ओपन क्रोमैटिन प्रोफाइलिंग के अलावा, एटीएसी-सेक का उपयोग प्रतिलेखन कारक पदचिह्नों और न्यूक्लियोसोम पोजिशनिंग 8,33 की पहचान करने के लिए किया गया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ऐसी जानकारी ज्यादातर खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों (चित्रा 1 एफ) से ली गई है। इसलिए, परिणाम खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों के प्रति पक्षपाती होंगे। फिर भी, एटीएसी-सेक क्रोमैटिन वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस क्रांतिकारी उपकरण को हाल ही में एकल-कोशिका जीनोमिक्स के लिए अपनाया गया है और जीन विनियमन और क्रोमैटिन जीव विज्ञान की हमारी समझ में सुधार करने में योगदान देना जारी है।

डेटा उपलब्धता:
इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत डेटा परिग्रहण संख्या जीएसई 202791 के तहत जीन अभिव्यक्ति ओमनीबस में उपलब्ध हैं। विश्लेषण में जीएसई 72141 और जीएसई 99479 से एटीएसी-सेक डेटा का भी उपयोग किया गया था।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि इस पेपर में वर्णित शोध से संबंधित कोई प्रासंगिक या भौतिक वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए यूएनडी जीनोमिक्स कोर सुविधा को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं।

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ [पी 20 जीएम 104360 से एमटी, पी 20 जीएम 104360 से एडी] और नॉर्थ डकोटा स्कूल ऑफ मेडिसिन एंड हेल्थ साइंसेज विश्वविद्यालय, बायोमेडिकल साइंसेज विभाग [एमटी को] द्वारा प्रदान किए गए स्टार्ट-अप फंड द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500 Natural
10 µL XL TipOne tips USA Scientific 1120-3810 Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tips USA Scientific 1182-1830 Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tips USA Scientific 1120-1840 Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352096
20 µL TipOne RPT tips USA Scientific 1183-1810 Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tips USA Scientific 1180-8810 Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge Tubes Fisherbrand 06-443-19
Agarose ThermoFisher Scientific YBP136010 Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCC ATCC
Allegra X-30R Centrifuge Beckman Coulter 364658 SX2415
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 Bead purification kit
CellDrop Cell Counter DeNovix CellDrop FL Cell counter
EDTA MilliporeSigma EDS BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTA MilliporeSigma E3889
Ethanol 100% ThermoFisher Scientific AC615100020 Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET Tested R&D Systems S10350 Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1x ThermoFisher Scientific 11965092 [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1x ThermoFisher Scientific 10010023 pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1x ThermoFisher Scientific 25200056 (0.25%), phenol red
Glycerol IBI Scientific 56-81-5
Glycine MilliporeSigma G8898
HCl MilliporeSigma H1758
HEPES MilliporeSigma H3375
Invitrogen Qubit Fluorometer ThermoFisher Scientific Q32857
MgCl2 MilliporeSigma M3634
MinElute PCR Purification kit Qiagen 28004 DNA purification kit
NaCl IBI Scientific 7647-14-5
NaOH MilliporeSigma S8045 BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541
Nextera DNA Sample Preparation Kit Illumina FC-121-1030 2x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630) MilliporeSigma I8896 for molecular biology
PCR Detection System BioRad 1855484 CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPES MilliporeSigma P1851 BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kit ThermoFisher Scientific Q32854 Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay Tubes ThermoFisher Scientific Q32856 Invitrogen
SDS MilliporeSigma L3771
Sodium Acetate Homemade - pH 5.2
Sucrose IBI Scientific 57-50-1
SYBR Gold ThermoFisher Scientific S11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mL BioRad 1708882
T100 Thermal Cycler BioRad 1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips USA Scientific 1402-4700 Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATE USA Scientific 1438-4700 Single notch. Natural polypropylene
Tris Base MilliporeSigma 648311 ULTROL Grade
Triton x-100 IBI Scientific 9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit Illumina PE-121-1003 paired-end
Trypan Blue Stain ThermoFisher Scientific Q32851
Tween-20 MilliporeSigma P7949 BioXtra, viscous liquid
Water MilliporeSigma W3500 sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture

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References

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Cooper, M., Ray, A., Bhattacharya, A., Dhasarathy, A., Takaku, M. ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research. J. Vis. Exp. (184), e64242, doi:10.3791/64242 (2022).

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