Summary
ATAC-seq es un método de secuenciación de ADN que utiliza la transposasa mutante hiperactiva, Tn5, para mapear los cambios en la accesibilidad de la cromatina mediada por factores de transcripción. ATAC-seq permite el descubrimiento de los mecanismos moleculares subyacentes a las alteraciones fenotípicas en las células cancerosas. Este protocolo describe los procedimientos de optimización para ATAC-seq en tipos de células epiteliales, incluidas las células cancerosas.
Abstract
El ensayo para la cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) sondea la accesibilidad del ácido desoxirribonucleico (ADN) utilizando la transposasa Tn5 hiperactiva. Tn5 corta y liga adaptadores para secuenciación de alto rendimiento dentro de regiones de cromatina accesibles. En las células eucariotas, el ADN genómico se empaqueta en cromatina, un complejo de ADN, histonas y otras proteínas, que actúa como una barrera física para la maquinaria transcripcional. En respuesta a las señales extrínsecas, los factores de transcripción reclutan complejos de remodelación de la cromatina para permitir el acceso a la maquinaria transcripcional para la activación génica. Por lo tanto, la identificación de regiones abiertas de cromatina es útil cuando se monitorean las actividades potenciadoras y promotoras de genes durante eventos biológicos como la progresión del cáncer. Dado que este protocolo es fácil de usar y tiene un bajo requerimiento de entrada celular, ATAC-seq ha sido ampliamente adoptado para definir regiones abiertas de cromatina en varios tipos de células, incluidas las células cancerosas. Para una adquisición de datos exitosa, se deben considerar varios parámetros al preparar bibliotecas ATAC-seq. Entre ellos, la elección del tampón de lisis celular, la titulación de la enzima Tn5 y el volumen inicial de células son cruciales para la preparación de la biblioteca ATAC-seq en células cancerosas. La optimización es esencial para generar datos de alta calidad. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de los métodos de optimización ATAC-seq para tipos de células epiteliales.
Introduction
La accesibilidad a la cromatina es un requisito clave para la regulación de la expresión génica a escala de todo el genoma1. Los cambios en la accesibilidad a la cromatina se asocian frecuentemente con varios estados de enfermedad, incluyendo el cáncer 2,3,4. A lo largo de los años, se han desarrollado numerosas técnicas para permitir a los investigadores sondear el paisaje de la cromatina mediante el mapeo de regiones de accesibilidad a la cromatina. Algunos de ellos incluyen DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, y el foco de este trabajo, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq mapea regiones accesibles empleando una característica clave de DNasa, a saber, la digestión preferencial de ADN desnudo libre de histonas y otras proteínas como los factores de transcripción5. FAIRE-seq, similar a ChIP-seq, utiliza reticulación y sonicación de formaldehído, excepto que no hay inmunoprecipitación involucrada, y las regiones libres de nucleosomas se aíslan por extracción de fenol-cloroformo6. El método MAPit utiliza una metiltransferasa GC para sondear la estructura de la cromatina a una resolución de molécula única7. ATAC-seq se basa en la transposasa hiperactiva, Tn58. La transposasa Tn5 se une preferentemente a regiones de cromatina abiertas e inserta adaptadores de secuenciación en regiones accesibles. Tn5 opera a través de un mecanismo de "cortar y pegar" mediado por ADN, mediante el cual la transposasa precargada con adaptadores se une a sitios abiertos de cromatina, corta el ADN y liga los adaptadores8. Las regiones unidas a Tn5 se recuperan mediante amplificación por PCR utilizando cebadores que se unen a estos adaptadores. FAIRE-seq y DNase-seq requieren una gran cantidad de material de partida (~ 100,000 celdas a 225,000 células) y un paso separado de preparación de la biblioteca antes de la secuenciación9. Por otro lado, el protocolo ATAC-seq es relativamente simple y requiere un pequeño número de celdas (<50.000 células)10. A diferencia de las técnicas FAIRE-seq y DNase-seq, la preparación de la biblioteca de secuenciación de ATAC-seq es relativamente fácil, ya que la muestra de ADN aislada ya está siendo etiquetada con los adaptadores de secuenciación por Tn5. Por lo tanto, solo se necesita el paso de amplificación por PCR con cebadores apropiados para completar la preparación de la biblioteca, y no es necesario realizar los pasos de procesamiento previos, como la reparación final y la ligadura del adaptador, ahorrando así tiempo11. En segundo lugar, ATAC-seq evita la necesidad de conversión, clonación y amplificación de bisulfito con cebadores específicos de la región requeridos para MAPit7. Debido a estas ventajas, ATAC-seq se ha convertido en un método muy popular para definir regiones de cromatina abierta. Aunque el método ATAC-seq es simple, varios pasos requieren optimización para obtener datos de alta calidad y reproducibles. Este manuscrito discute los procedimientos de optimización para la preparación estándar de la biblioteca ATAC-seq, destacando especialmente tres parámetros: (1) composición del tampón de lisis, (2) concentración de transposasa Tn5 y (3) número de células. Además, este documento proporciona datos de ejemplo de las condiciones de optimización utilizando células epiteliales adherentes cancerosas y no cancerosas.
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Protocol
1. Preparativos antes de comenzar el experimento
- Preparar la reserva reguladora de lisis.
NOTA: El tampón de aislamiento nuclear óptimo puede ser diferente para cada tipo de célula. Recomendamos probar tanto el tampón hipotónico utilizado en el artículo original8 como un tampón CSK12,13 para cada tipo de célula utilizando tinción de azul de tripano.- Para preparar tampón hipotónico (tampón de hoja verde), mezclar 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 y 0.1% NP-40.
- Para preparar tampón CSK, mezcle 10 mM PIPES pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM sacarosa, 3 mM MgCl2 y 0.1% Triton X-100.
- Asegurar que las condiciones de cultivo celular sean óptimas; Examine las células bajo un microscopio óptico para asegurarse de que no haya niveles elevados de apoptosis.
- Encienda la centrífuga para que alcance los 4 °C.
2. Recolección de células
- Aspirar medios de un cultivo de células a <80% de confluencia. Las células se cultivan típicamente en un plato de 35 mm o 60 mm, según el número de células necesarias, tratamientos, etc.
- Lave las células con 1 ml o 3 ml de PBS.
- Añadir 0,5 ml o 1 ml de tripsina e incubar durante 2-3 min (dependiendo de los tipos de células). Use cuidadosamente una pipeta de 1 ml para mezclar bien.
- Agregue 1 ml o 2 ml de medios al plato y mezcle bien. Transfiera a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células en un tubo de 15 ml durante 3 min a 300 x g.
NOTA: Se recomienda un rotor de cangilón oscilante para minimizar la pérdida de celda. - Aspirar el medio y resuspender las células en 1 mL o 2 mL de medio.
NOTA: Es fundamental preparar una solución monocelular homogénea. Para los tejidos, se puede usar un homogeneizador Dounce para homogeneizar tejidos y minimizar grupos o agregados de células grandes. Algunos tejidos requieren filtración (por ejemplo, filtros celulares) y/o clasificación celular FACS para aislar células viables y obtener una solución de una sola célula. - Cuente las celdas con un contador de celdas.
NOTA: En este estudio, se utilizó un contador celular automatizado (Tabla de Materiales). - Centrifugar el volumen celular requerido (por ejemplo, un volumen que contenga 1 x 106 células basado en el recuento de células) a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente (RT).
- Resuspender el pellet celular que contiene 1 x 106 células en 1 ml de PBS frío.
NOTA: Si el número de células es inferior a 1 x 10 6 células, disminuya el volumen de PBS frío para preparar la solución celular a la misma concentración (1 x 106 células/ml).
3. Lisis celular
- Transfiera 25 μL (= 2,5 x 104 células) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C y desechar con cuidado el sobrenadante
NOTA: Se recomienda un rotor de cangilón oscilante para minimizar la pérdida de celda. Deje aproximadamente 3 μL de sobrenadante para asegurarse de que las células no se descarten. - Añadir 25 μL de tampón de lisis y resuspender las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar en hielo durante 5 min
- Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C y desechar con cuidado el sobrenadante.
NOTA: Se recomienda un rotor de cangilón oscilante para minimizar la pérdida de celda. Deje aproximadamente 3 μL de sobrenadante para asegurarse de que las células no se descarten.
4. Etiquetado Tn5
- Resuspender inmediatamente el pellet en 25 μL de mezcla de reacción Tn5. La mezcla de reacción Tn5 es la siguiente: 12,5 μL de 2x tampón de ADN de etiquetado (tampón TD), 1,25-5 μL de transposasa Tn5 y 11,25-7,5 μL de agua libre de nucleasa.
NOTA: La concentración estándar de Tn5 es de 2,5 μL para 2,5 x 104 células. - Incubar durante 30 min a 37 °C.
NOTA: Mezcle la solución cada 10 min.
5. Purificación del ADN
NOTA: Se requiere purificación antes de la amplificación. La purificación del ADN se realiza utilizando el kit de purificación MinElute PCR (Tabla de materiales).
- Añadir 5 μL de acetato de sodio 3 M (pH 5.2).
- Añadir inmediatamente 125 μL de Buffer PB y mezclar bien.
- Siga el protocolo del kit de purificación de PCR a partir del paso 2.
- Coloque la columna de centrifugado en un tubo de recolección de 2 ml.
- Aplicar la muestra a la columna de centrifugado y centrifugar durante 1 min a 17.900 x g a RT.
- Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna de centrifugado en el mismo tubo de recolección.
- Agregue 750 μL de PE tampón a la columna de centrifugado y centrífugo durante 1 min a 17,900 x g a RT.
- Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna de centrifugado en el mismo tubo de recolección.
- Centrifugar la columna de centrifugado durante 5 minutos para secar completamente la membrana.
- Deseche el flujo y coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
- Eluya los fragmentos de ADN con 10 μL de tampón EB.
- Deje que la columna repose durante 1 minuto en RT.
- Centrifugar durante 1 min a 17.900 x g a RT para eluyir el ADN.
6. Amplificación por PCR
NOTA: La amplificación por PCR de los ADN transpuestos (etiquetados) es necesaria para la secuenciación. En este ejemplo se utilizaron adaptadores de kit Nextera (Tabla de materiales). Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1.
- Configure la siguiente reacción de PCR en tubos de PCR de 200 μL (50 μL para cada muestra). La mezcla de reacción de PCR es la siguiente: 10 μL de ADN eluyido (paso 5.), 2,5 μL de 25 mM Adaptador 1, 2,5 μL de 25 mM Adaptador 2, 25 μL de 2x mezcla maestra de PCR y 10 μL de agua libre de nucleasa
- Realizar el programa de amplificación por PCR parte 1 (Tabla 2).
NOTA: Para la amplificación inicial, se utilizan las mismas condiciones para todas las muestras que utilizan un termociclador estándar. - QPCR en tiempo real (total de 14,5 μL por muestra)
- Utilizando 5 μL del producto de la parte 1 de la amplificación por PCR (paso 6.2.), configure la siguiente reacción, esta vez incluyendo oro SYBR y detección en una máquina de PCR en tiempo real.
- Prepare la mezcla de reacción de PCR de la siguiente manera: 5 μL de producto de PCR del paso 6.2., 0,75 μL de oro SYBR (1000x diluido), 5 μL de 2x mezcla maestra de PCR y 3,75 μL de agua libre de nucleasa.
NOTA: Los números de ciclo precisos para la amplificación de la biblioteca antes de alcanzar la saturación para cada muestra se determinan mediante qPCR (Tabla 3) para reducir el GC y el sesgo de tamaño en la PCR10. SYBR Gold se diluyó con agua libre de nucleasas. Para hacer la solución diluida, se agregó 1 μL de SYBR Gold (concentración madre 10,000x) a 999 μL de agua libre de nucleasa. El tiempo de ejecución de la RT-qPCR mencionada en la Tabla 3 es de aproximadamente 60 min.
- Determine el número requerido de ciclos de PCR adicionales utilizando los parámetros de ejecución del paso 6.3.
- Número de ciclos = 1/4 de intensidad de fluorescencia máxima (saturada) (típicamente 3 o 4 ciclos de PCR)
- Programa de amplificación por PCR parte 2 (volumen = 45 μL; Tabla 4): Una vez que determine el número de ciclo, configure PCR con ciclos adicionales calculados en el paso 6.4.1. Por ejemplo, si el número de ciclo calculado es 3, configure 3 ciclos en el programa siguiente. El total de ciclos sería 8 (5 en el paso 6.2., más 3 ciclos adicionales en el paso 6.5).
7. Purificación de perlas
NOTA: Aquí se utilizaron cuentas AMPure XP (Tabla de materiales).
- A los productos de PCR amplificados en el paso anterior, agregue 150 μL de perlas en RT.
NOTA: Las perlas caserasAMPure 14 se pueden utilizar en este proceso. - Incubar durante 15 min en RT.
- Coloque los tubos en un soporte magnético durante 5 minutos.
- Retire con cuidado el sobrenadante.
- Lave las perlas con 200 μL de etanol al 80%.
NOTA: El etanol al 80% debe prepararse fresco. - Repita el paso 7.4.
- Retire el etanol por completo.
- Seque al aire las muestras durante 10 minutos en RT.
- Resuspender con 50 μL de tampón de elución (10 mM Tris-HCL pH 8.0).
- Repita la purificación de las perlas (pasos 7.1.-7.9.) para minimizar aún más la contaminación de la imprimación.
8. Concentración de ADN y control de calidad
- Mida la concentración de ADN utilizando un kit de cuantificación de ácidos nucleicos (Tabla de materiales).
- Verifique los fragmentos de ADN amplificados mediante electroforesis en gel utilizando SYBR Gold (0.5x TBE, gel de agarosa al 1.5%) o un sistema de electroforesis automatizado (por ejemplo, TapeStation, bioanalizador).
9. Secuenciación
- Realizar secuenciación de alto rendimiento utilizando las muestras de ADN amplificadas12,13.
NOTA: Las muestras de ADN amplificadas están listas para la secuenciación de alto rendimiento. Para retener la información del fragmento de ADN nucleosomal, se recomienda la secuenciación de extremo pareado sobre la secuenciación de un solo extremo. Ambos extremos de los fragmentos de ADN indican dónde se une la transposasa. Para mapear regiones de cromatina abierta, 30 millones de lecturas/muestra suelen ser suficientes.
10. Análisis de datos
- Filtrado de datos basado en la calidad de llamada base: establezca la puntuación de calidad base promedio mínima en 20 (99% de precisión).
- Recorte del adaptador: extraiga las secuencias del adaptador con una herramienta adecuada.
NOTA: La herramienta Trim Galore wrapper (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) se utilizó para quitar secuencias de adaptadores. Para las bibliotecas ATAC-seq preparadas por Illumina Tn5, se utiliza la siguiente secuencia como secuencia adaptadora: CTGTCTCTTATACACATCT. La longitud mínima de secuencia para reconocer la contaminación del adaptador se establece en 5. - Mapeo del genoma: Asigne las lecturas al genoma apropiado con Bowtie usando los siguientes parámetros "-I 0 -X 2000 -m 1"15. A continuación se muestra un ejemplo de mapeo de la calidad de las células basales de cáncer de mama MDA-MB-231:
Lecturas con al menos una alineación reportada: 52.79%
Lecturas que no se alinearon: 13.10%
Lecturas con alineaciones suprimidas debido a -m: 34.11% - Deduplicación: Marque los duplicados de PCR con las herramientas Picard16.
- Generación de un archivo de cobertura del genoma para la visualización de datos: convierta las lecturas de extremo emparejado deduplicadas en fragmentos de lectura de un solo extremo. Las pistas de cobertura del genoma se obtienen utilizando genomeCoverageBed de bedtools17.
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Representative Results
Para obtener datos ATAC-seq exitosos y de alta calidad, es importante optimizar las condiciones experimentales. La preparación de la biblioteca ATAC-seq se puede separar en los cinco pasos principales (Figura 1), a saber, lisis celular, etiquetado (fragmentación e inserción del adaptador por Tn5), purificación genómica del ADN, amplificación por PCR y análisis de datos. Como proceso inicial, el tampón de lisis celular (aislamiento nuclear) debe optimizarse primero para cada tipo de célula. Se utilizó el tampón hipotónico descrito en el documento original ATAC-seq8 o el tampón CSK12,13 para lisar las células de cáncer de mama. La tinción con azul de tripano puede utilizarse para confirmar el aislamiento de los núcleos18. Para la preparación de la biblioteca ATAC-seq en líneas celulares de cáncer humano como MDA-MB-231, T47D, MCF7 y A375, múltiples grupos han utilizado tampón CSK 12,13,19,20. El tampón CSK también se utilizó para la preparación de la biblioteca ATAC-seq en otros tipos de células, como las células madre embrionarias 21,22 y las células S2 de Drosophila 23. Para la optimización del tampón de lisis, la tinción con azul de tripano es útil para evaluar la eficiencia de la lisis celular. Cuando NMuMG, células epiteliales de glándula mamaria de ratón no cancerosas, fueron tratadas con el tampón hipotónico8 (ver paso 1) y tampón CSK, se observó una mayor eficiencia de lisis celular en las células tratadas con CSK (Figura 2). Para tejidos congelados, se ha demostrado que Omni-ATAC mejora las señales ATAC-seq24. En el Omni-ATAC, se utiliza un tampón que contiene 0,1% de NP40, 0,1% de Tween-20 y 0,01% de digitonina para la lisis celular. Aunque se sabe que el tampón basado en digitonina disminuye la fracción de ADN mitocondrial, las relaciones señal-ruido y los recuentos de lectura de TSS de ATAC-seq con tampón CSK demostraron ser mejores que los de Omni-ATAC en células de cáncer de mama12. Por lo tanto, el resto de este manuscrito se centra principalmente en los resultados de los datos ATAC-seq con búfer CSK.
Tras la determinación de las mejores condiciones de tampón de lisis celular (aislamiento nuclear), es importante optimizar las relaciones entre el número de células de entrada y la concentración de transposasa Tn512,25. Típicamente, la concentración de Tn5 se puede valorar variando el volumen de Tn5 de 1.25 μL, 2.5 μL, a 5 μL en un volumen total de mezcla de reacción de 25 μL. Alternativamente, se puede cambiar el número de células de entrada (por ejemplo, de 10.000 a 100.000), mientras se mantiene la enzima Tn5 sin cambios en 2,5 μL para optimizar la reacción de etiquetado de Tn5. Para evaluar la calidad de las bibliotecas ATAC-seq y la eficiencia de la digestión de la cromatina inducida por Tn5, los productos de PCR de la biblioteca se pueden analizar mediante electroforesis en gel de agarosa. La figura 3 muestra ejemplos de bibliotecas ATAC-seq exitosas. Típicamente, la amplificación por PCR de 8 o 9 ciclos (ciclos totales de PCR incluyendo PCR inicial) da como resultado una concentración de 3-6 ng/μL en la biblioteca ATAC-seq. Como Tn5 "ataca" preferentemente las regiones libres de nucleosomas en la cromatina abierta (Figura 1), las escaleras de nucleosomas deberían ser obvias en la imagen del gel (Figura 3). El bromuro de etidio o SYBR Gold se puede usar para detectar ADN amplificado en el gel de agarosa.
A continuación, se puede utilizar el análisis de qPCR utilizando bibliotecas ATAC-seq para verificar brevemente la calidad de las bibliotecas y el enriquecimiento de fragmentos en regiones de cromatina abiertas, como promotores de genes activos (Figura 4). Los cebadores pueden diseñarse para generar amplicones de <80 pb utilizando promotores de genes activos conocidos como controles positivos y regiones de cromatina "cerradas" (inactivas) conocidas como controles negativos (Figura 4A). Entre las condiciones probadas, se observó un mayor enriquecimiento en las bibliotecas T47D ATAC-seq con tampón CSK (Figura 4B). Como era de esperar, encontramos más enriquecimiento utilizando cebadores K y L en la región promotora del gen Estrogen Receptor alpha (ESR1) en relación con una región cerrada aguas arriba de ESR1 con cebador C (Figura 4B)26. La Figura 5 muestra ejemplos de datos ATAC-seq con diferentes concentraciones de Tn5 (se utilizaron 25.000 células). En este caso, se detectó un mayor ruido de fondo en la condición Tn5 más baja (1,25 μL de Tn5) (Figura 5, barras verticales). Los datos de ATAC-seq de 2,5 μL o 5 μL de Tn5 mostraron niveles similares de señales ATAC-seq en regiones de cromatina abierta con señales de fondo más bajas. Teniendo en cuenta la posible sobredigestión por Tn5 a la concentración más alta, se puede concluir que 2,5 μL de Tn5 es adecuado para este tipo de célula.
También realizamos el ATAC-seq utilizando diferentes números celulares en células NMuMG, frecuentemente utilizadas para estudiar la transición epitelio-mesenquimal (Figura 6). Para optimizar el volumen inicial, se utilizaron cuatro números de celda diferentes (25.000, 50.000, 75.000 y 100.000) para la optimización de la biblioteca ATAC-seq. Las células se lisaron con tampón CSK y los núcleos se incubaron con 2,5 μL de Tn5 transposasa en 25 μL de la mezcla de reacción. Para explorar la eficacia de la digestión de Tn5 y las escaleras nucleosómicas, se analizó bioindustrialmente la distribución de tamaño de los ADN insertados (Figura 6A). Cuando se utilizaron números celulares más bajos, los fragmentos de ADN libre de nucleosomas (<100 pb) se enriquecieron más en los datos de secuenciación. Por otro lado, la fracción de fragmentos de ADN mononucleosómico (175-225 pb) fue menor en las muestras de baja entrada celular (25.000 células y 50.000 células) en comparación con las condiciones de entrada celular más altas (75.000 células y 100.000 células). Aunque se observaron patrones diferenciales de fragmentos de ADN entre las muestras, el número de células de entrada parece tener un impacto mínimo en el enriquecimiento de las señales ATAC-seq en los promotores y otras regiones de cromatina abierta (Figura 6B). Para investigar más a fondo el impacto de los números de celdas de entrada en el análisis posterior, se definieron los picos ATAC-seq. Los picos ATAC-seq fueron determinados por el programa de llamadas de picos PeaKDEck27 utilizando los siguientes parámetros: -sig 0.0001 -bin 300 -back 3,000 -npBack 2,500,000. De ~ 4.9 millones de lecturas mapeadas de forma única, se observaron 38,878, 43,832, 41,509 y 45,530 picos en datos ATAC-seq de 25,000, 50,000, 75,000 y 100,000 entradas de celdas, respectivamente. La condición de entrada de 100.000 celdas mostró el mayor número de picos. Dado que la puntuación de enriquecimiento del sitio de inicio de transcripción (TSS) se ha utilizado para evaluar la calidad de los datos ATAC-seq, la puntuación TSS de cada condición ATAC-seq se calculó utilizando el programa GitHub: Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28. Los puntajes TSS para las condiciones de entrada de celda 25,000, 50,000, 75,000 y 100,000 fueron 9.03, 9,02, 8.82 y 8.28, respectivamente (el puntaje de enriquecimiento TSS se considera ideal si es mayor que 728). Esto indicó una disminución gradual en la puntuación de enriquecimiento de TSS con el aumento del número de células. Mientras que el mayor número máximo se observó en la condición de entrada de 100,000 celdas, la condición de entrada de 25,000 celdas dio una mejor puntuación TSS. El análisis de anotación de picos realizado por Homero29 indicó que la mayoría de los picos aumentados se clasifican como picos distales promotores (Figura 6C). Sobre la base de estos resultados, se puede concluir que las entradas de mayor número de células pueden producir un mayor número de picos y detectar con mayor frecuencia picos no promotores en comparación con las entradas de menor número de células en esta condición.
Figura 1: Esquema del método ATAC-seq. (A) ATAC-seq mide la accesibilidad a la cromatina utilizando una transposasa Tn5 hiperactiva precargada con adaptadores directos e inversos. Los diversos pasos en el proceso incluyen (B) lisis celular (incluida la optimización de la composición del tampón de lisis, la titulación de Tn5 y el número de células utilizadas); (C) transposición (unión de Tn5 a cromatina abierta/accesible); (D) marcación de la cromatina; (E) purificación y amplificación de fragmentos de ADN de bibliotecas, y (F) secuenciación de bibliotecas y análisis de datos. El análisis de distribución de longitud de fragmento de las bibliotecas ATAC-seq muestra típicamente un pico inicial alrededor de ~ 50 pb (regiones libres de nucleosoma) y otro pico en ~ 200 pb (mononucleosoma). Por lo tanto, sin filtración de tamaño computacional o experimental, las señales ATAC-seq contienen regiones nucleosómicas y libres de nucleosomas en cromatina abierta. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comparación de la eficiencia de la lisis celular utilizando azul de tripano. (A) Las células NMuMG fueron tratadas con el tampón hipotónico8 y teñidas con azul de tripano. (B) Las células NMuMG se trataron con tampón CSK y se tiñeron con azul de tripano. Las barras de escala indican 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de fragmentos de ADN amplificados de bibliotecas ATAC-seq. Las bibliotecas ATAC-seq se prepararon a partir de células de cáncer de mama MDA-MB-231. (A) Después de la amplificación por PCR, los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1,5% TBE 0.5x antes y después de la purificación de perlas. Las imprimaciones se eliminan principalmente mediante la purificación inicial de las perlas. También están indicados patrones de bandas de ADN de (B) 1x TAE, electroforesis en gel de agarosa al 1% y (C) una electroforesis automatizada. SYBR Gold se utilizó para visualizar los fragmentos de ADN que se muestran en A y B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de enriquecimiento de bibliotecas ATAC-seq . (A) Seguimiento del navegador del genoma que muestra el locus ESR1. Se muestra la cobertura del genoma de los datos ATAC-seq en las células T47D20 . Se utilizaron cebadores de una publicación anterior26, y sus regiones objetivo están resaltadas en amarillo. (B) Gráfico de barras que representa el enriquecimiento del amplicón de cebador en bibliotecas ATAC-seq. Las bibliotecas ATAC-seq fueron preparadas por el tampón hipotónico o tampón CSK. También se utilizaron diferentes concentraciones de Tn5 para generar bibliotecas ATAC-seq. Se utilizó 1 ng de cada biblioteca para realizar qPCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Visualización del navegador del genoma para la optimización ATAC-seq. Se agregaron diferentes cantidades de transposasa Tn5 durante la preparación de la biblioteca. La condición de 1.25 μL de Tn5 muestra señales de fondo más altas (resaltadas en amarillo), mientras que las otras dos condiciones se ven similares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Distribución del tamaño del fragmento de ADN de las bibliotecas ATAC-seq. (A) Las bibliotecas ATAC-seq se prepararon utilizando los números de celda indicados. Los datos ATAC-seq de la condición de entrada de 25.000 células mostraron el mayor enriquecimiento de fragmentos libres de nucleosomas, mientras que la condición de entrada de 100.000 células presentó los ADN mononucleosómicos más altos. (B) Seguimiento del navegador del genoma que muestra datos ATAC-seq de diferentes números celulares. (C) Análisis de anotación del pico de Homero. Cada pico fue clasificado como un pico promotor-proximal o distal por Homero29. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Secuencia |
| ESR1 C hacia adelante | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C Invertir | CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC |
| ESR1 K Adelante | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K Marcha atrás | TGTCTCTCTCTGTGTGATTCCC |
| ESR1 L Adelante | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L Reverso | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
Tabla 1: Lista de cebadores utilizados en este estudio.
| Pasos | Temperatura | Hora | Ciclo |
| Rellenar huecos | 72 °C | 5 minutos | 1 |
| Desnaturalización inicial | 98 °C | 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 98 °C | 10 s | 5 |
| Recocido | 63 °C | 30 s | |
| Extensión | 72 °C | 1 minuto | |
| Sostener | 4 °C | para siempre |
Tabla 2: Programa de amplificación por PCR parte 1.
| Pasos | Temperatura | Ciclo |
| Desnaturalización inicial | 98 °C 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 98 °C 10 s | 20 |
| Recocido | 63 °C 30 s | |
| Extensión | 72 °C 1 mín | |
| Lectura de la placa |
Tabla 3: Configuración de qPCR.
| Pasos | Temperatura | Hora | Ciclo |
| Desnaturalización inicial | 98 °C | 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 98 °C | 10 s | Total de ciclos calculados en el paso 6.4 |
| Recocido | 63 °C | 30 s | |
| Extensión | 72 °C | 1 minuto | |
| Sostener | 4 °C | para siempre |
Tabla 4: Programa de amplificación por PCR parte 2.
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Discussion
ATAC-seq ha sido ampliamente utilizado para mapear regiones de cromatina abiertas y activas. La progresión de las células cancerosas es frecuentemente impulsada por alteraciones genéticas y reprogramación epigenética, lo que resulta en una alteración de la accesibilidad a la cromatina y la expresión génica. Un ejemplo de esta reprogramación se observa durante la transición epitelial-mesenquimal (EMT) y su proceso inverso, la transición mesenquimal a epitelial (MET), que se sabe que son procesos clave de reprogramación celular durante la metástasis tumoral30. Otro ejemplo es la adquisición de resistencia a los medicamentos contra las terapias hormonales que se observa a menudo en tumores luminales de mama31. ATAC-seq es útil para monitorizar tales alteraciones fenotípicas celulares a nivel de cromatina y puede ser utilizado para predecir una célula de origen y subtipos de cáncer4.
Para medir con precisión la remodelación de la cromatina por ATAC-seq, es necesario el establecimiento de un protocolo reproducible y consistente. En este manuscrito, se describe una estrategia estándar para la optimización de la biblioteca ATAC-seq. Los datos ATAC-seq de las líneas celulares MDA-MB-231 y NMuMG se utilizan como ejemplos de procesos de optimización. Las células NMuMG se han utilizado para estudiar EMT, y las células MDA-MB-231 se han utilizado para estudiar su proceso inverso, MET. Estos modelos celulares se han utilizado previamente para estudiar alteraciones epigenéticas durante EMT y MET13,32. El uso de un tampón apropiado para la lisis celular y la concentración de Tn5 es el componente clave de la preparación exitosa de la biblioteca ATAC-seq. Además de estos componentes, un alto porcentaje (>90%) de viabilidad celular, concentraciones apropiadas de detergente en el tampón de lisis y la preparación de la suspensión unicelular también son muy importantes. Cuando la eficiencia de digestión de Tn5 es significativamente diferente entre las muestras, es difícil corregir las variaciones de los datos. Esto se debe a la falta de controles internos y externos para evaluar cuantitativamente la eficiencia de la digestión. Las características o propiedades celulares también pueden ser diferentes entre las células del grupo de control frente a las células del grupo de prueba. Por lo tanto, es necesario considerar cuidadosamente las condiciones experimentales, incluida la elección del tampón de lisis, para obtener datos ATAC-seq de alta calidad de ambos grupos experimentales (Figura 5 y Figura 6).
Además del perfil abierto de cromatina, ATAC-seq se ha utilizado para identificar huellas de factores de transcripción y posicionamiento nucleosómico 8,33. Es importante tener en cuenta que dicha información se deriva principalmente de regiones de cromatina abierta (Figura 1F). Por lo tanto, los resultados estarían sesgados hacia las regiones de cromatina abierta. Sin embargo, ATAC-seq es una poderosa herramienta para estudiar la arquitectura de la cromatina. Esta herramienta revolucionaria se ha adoptado más recientemente para la genómica unicelular y continúa contribuyendo a mejorar nuestra comprensión de la regulación génica y la biología de la cromatina.
DISPONIBILIDAD DE DATOS:
Los datos presentados en este protocolo están disponibles en Gene Expression Omnibus bajo el número de acceso GSE202791. Los datos ATAC-seq de GSE72141 y GSE99479 también se utilizaron en el análisis.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros relevantes o materiales que se relacionen con la investigación descrita en este documento.
Acknowledgments
Agradecemos a la instalación UND Genomics Core por su excelente asistencia técnica.
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud [P20GM104360 a M.T., P20 GM104360 a A.D.] y los fondos iniciales proporcionados por la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad de Dakota del Norte, Departamento de Ciencias Biomédicas [a M.T.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
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