Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

نشر جزيء واحد وتجميعها على أغشية الدهون المزدحمة بالبوليمر

Published: July 19, 2022 doi: 10.3791/64243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لإجراء وتحليل ربط وتنقل وتجميع جزيئات مفردة على أغشية دهنية مزدحمة اصطناعية باستخدام مجهر التألق الداخلي الكلي للانعكاس الداخلي (smTIRF) أحادي الجزيء.

Abstract

الأغشية الخلوية هي بيئات مزدحمة للغاية للتفاعلات الجزيئية الحيوية والإشارات. ومع ذلك ، فإن معظم التجارب في المختبر التي تسبر تفاعل البروتين مع الدهون تستخدم أغشية عارية ثنائية الطبقة. تفتقر هذه الأنظمة إلى تعقيدات الازدحام بالبروتينات والجليكان المدمجة في الغشاء وتستبعد تأثيرات الحجم المرتبطة بها التي تواجهها على أسطح الأغشية الخلوية. أيضا ، فإن السطح الزجاجي المشحون سلبا الذي تتشكل عليه الطبقات الثنائية للدهون يمنع الانتشار الحر للجزيئات الحيوية عبر الغشاء. هنا ، نقدم غشاء بوليمر دهني مميز جيدا كمحاكاة للأغشية الدهنية المزدحمة. يستخدم هذا البروتوكول الدهون المترافقة مع البولي إيثيلين جلايكول (PEG) كنهج عام لدمج الحشود في الطبقة الثنائية الدهنية المدعومة (SLB). أولا ، يتم تقديم إجراء تنظيف للشرائح المجهرية وأغطية الأغطية لإجراء تجارب جزيء واحد. بعد ذلك ، تتم مناقشة طرق توصيف PEG-SLBs وإجراء تجارب جزيء واحد لربط ونشر وتجميع الجزيئات الحيوية باستخدام تتبع جزيء واحد والتبييض الضوئي. وأخيرا، يوضح هذا البروتوكول كيفية مراقبة تجميع المسام النانوية للسم البكتيري المكون للمسام Cytolysin A (ClyA) على الأغشية الدهنية المزدحمة مع تحليل التبييض الضوئي أحادي الجزيء. يتم أيضا تضمين رموز MATLAB مع مجموعات بيانات المثال لإجراء بعض التحليلات الشائعة مثل تتبع الجسيمات واستخراج السلوك المنتشر وعد الوحدات الفرعية.

Introduction

الأغشية الخلوية هي أنظمة مزدحمة للغاية ومعقدة1. يمكن أن يكون للازدحام الجزيئي تأثير كبير على انتشار الكيانات المرتبطة بالغشاء مثل البروتين والدهون2،3،4. وبالمثل ، تتأثر التفاعلات ثنائية الجزيئات على الأغشية الدهنية مثل dimerization المستقبلات أو oligomerization من مجمعات الأغشية بالازدحام5،6،7. يمكن أن تحكم طبيعة وتكوين وتركيز الحشود ربط الغشاء والانتشار والتفاعل بين البروتين والبروتين بعدة طرق 8,9. نظرا لأن التحكم في ازدحام الأغشية على الأغشية الخلوية وتفسير تأثيرها على الجزيئات الحيوية المدمجة يمثل تحديا ، فقد حاول الباحثون إنشاء أنظمة بديلة في المختبر 10.

هناك نهج شائع للأغشية الاصطناعية المزدحمة وهو تخدير الأغشية ثنائية الطبقة بالبوليمر (مثل البولي إيثيلين جلايكول ، PEG) - الدهون المطعمة11,12. أثناء تصور ديناميكيات البروتين والدهون على الطبقات الثنائية للدهون المدعومة (SLBs) ، تحمي هذه البوليمرات بالإضافة إلى ذلك المكونات المضمنة في الغشاء من الركيزة سالبة الشحنة الأساسية (مثل الزجاج) عن طريق رفع الطبقة الثنائية بشكل فعال بعيدا عن الدعم الأساسي. من خلال تغيير حجم وتركيز البوليمر ، يمكن للمرء التحكم في مدى الازدحام الجزيئي ، وكذلك فصله عن الدعم الصلب الأساسي13,14. من الواضح أن هذه ميزة على الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة على ركائز صلبة بدون وسائد بوليمر15,16 ، حيث يمكن أن تفقد الجزيئات الحيوية عبر الغشاء نشاطها17,18,19. الأهم من ذلك ، أنه يسمح لنا بتلخيص البيئة المزدحمة لغشاء الخلية في المختبر ، وهو أمر بالغ الأهمية للعديد من عمليات الغشاء.

تخضع البوليمرات المطعمة على السطح على الأغشية أيضا لتغييرات في تكوينها اعتمادا على كثافة التطعيم12. في تركيزات منخفضة ، تبقى في تكوين ملفوف بشكل انتروبي ، يعرف باسم الفطر ، فوق سطح الغشاء. مع زيادة التركيز ، فإنها تبدأ في التفاعل وتميل إلى فك لفائف وتمتد ، مما يؤدي في النهاية إلى تكوين كثيف يشبه الفرشاة على الغشاء21. نظرا لأن الانتقال من الفطر إلى نظام الفرشاة غير متجانس للغاية ويتجلى في ظروف سيئة التمييز للبوليمر ، فمن المهم استخدام ظروف مميزة جيدا للازدحام على الأغشية المطعمة بالبوليمر. بالمقارنة مع دراسة حديثة20 ، فإننا نحدد ونبلغ عن تركيبات الأغشية المزدحمة التي تحافظ على النقل والنشاط المنتشرين للجزيئات الحيوية عبر الغشاء.

في هذا البروتوكول ، نناقش كيفية توليد أغشية دهنية PEGylated ونقدم توصيات لكثافات PEG التي تحاكي الازدحام في نظامين مختلفين من تكوين البوليمر (وهما الفطر والفرشاة). يصف البروتوكول أيضا ربط جزيء واحد ، وتتبع الجسيمات ، والحصول على بيانات التبييض الضوئي وتحليلها للجزيئات المضمنة في هذه الأغشية المزدحمة. أولا ، نصف خطوات التنظيف الشاملة ، وتجميع غرفة التصوير ، وتوليد PEG-SLBs. ثانيا ، نقدم تفاصيل عن ربط جزيء واحد ، وتتبع الجسيمات ، وتجارب التبييض الضوئي. ثالثا ، نناقش i) استخراج تقاربات الارتباط النسبية ، ii) توصيف الانتشار الجزيئي ، و iii) عد الوحدات الفرعية في تجميع البروتين من أفلام جزيئات واحدة على الغشاء.

في حين أننا ميزنا هذا النظام بالتصوير بجزيء واحد ، فإن البروتوكول مفيد لجميع علماء الفيزياء الحيوية في الأغشية المهتمين بفهم تأثير الازدحام على التفاعلات الجزيئية الحيوية على الأغشية الدهنية. بشكل عام ، نقدم خط أنابيب قوي لصنع طبقات ثنائية دهنية مزدحمة ومدعومة ، إلى جانب العديد من اختبارات الجزيء الواحد التي أجريت عليها وإجراءات التحليل المقابلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تنظيف الشريحة والغطاء للتجارب أحادية الجزيء

  1. قبل تجميع غرفة التصوير ، قم بتنظيف وإعداد كل من الأغطية والشرائح. قم بحفر أزواج متعددة من الثقوب على الشرائح الزجاجية باستخدام آلة حفر مزودة بتات حفر مغلفة بالماس (قطرها 0.5-1 مم). إذا تم استخدام صفائح الأكريليك ، فاستخدم قاطع ليزر لعمل ثقوب دقيقة (0.5 مم) ، كما هو موضح في الشكل 1.
    ملاحظة: سيكون كل زوج من الثقوب بمثابة مدخل ومخرج لتبادل التدفق لغرفة الموائع الدقيقة الفردية. يتوفر ملف CAD تمثيلي للثقوب في شريحة أكريليك في ملف الترميز التكميلي 1. عادة ما ينتهي الأمر بالثقوب المحفورة على الشرائح الزجاجية إلى أن تكون أكبر بمقدار 1.5 × 2 مرة من حجم مثقاب الحفر.
  2. نظف الشرائح والأغطية بالمنظفات. شطفها جيدا بالماء منزوع الأيونات. ضع الشرائح وأغطية الشرائح في جرة منفصلة ملطخة بالشرائح (كوبلين) بالماء وسونيكات في سونيكتور الحمام لمدة 30 دقيقة. بالنسبة لجميع خطوات الصوتنة، استخدم إعداد طاقة بقدرة 70 واط.
  3. قم بإزالة الماء واملأ جرة كوبلن التي تحتوي على الشرائح الزجاجية والأغطية بالأسيتون حتى الحافة (50-100 مل حسب حجم الجرة). في حالة صفائح الأكريليك ، استخدم نفس الحجم من محلول الأسيتون الممزوج مسبقا بنسبة 50٪ (v / v) وإلا ستصبح الشرائح فاترة. رج جرة كوبلن لضمان غمر جميع الشرائح والأغطية بالكامل في المحلول وسونيكات في سونيكتور الحمام لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بإزالة الأسيتون والتخلص منه في حاوية نفايات ، صب الميثانول في جرار كوبلن (50٪ ، v / v لشرائح الأكريليك) ، وسونيكات لمدة 30 دقيقة. يستخدم كل من الأسيتون والميثانول لإزالة الجسيمات العضوية على الشرائح.
  5. شطف الشرائح وأغطية مع كميات وفيرة من الماء من النوع 1 ووضعها في جرة كوبلن زجاجية. صب محلول 1 M KOH في الجرة والسونيكات لمدة 1 ساعة. بالنسبة لشرائح الأكريليك ، استخدم 0.5 متر من KOH.
  6. تخلص من KOH في حاوية نفايات غير عضوية. شطف الجرة مع الكثير من الماء ووضع الجرار كوبلن في غطاء الدخان لعلاج أسماك البيرانا. لا تقم بإجراء علاج البيرانا لشرائح الأكريليك. انتقل مباشرة إلى الخطوة 1.9.
    تحذير: يجب أن يتم علاج أسماك البيرانا في غطاء الدخان مع قفازات مناسبة ونظارات أمان ومئزر للتعامل مع الأحماض. محلول البيرانا هو عامل مؤكسد قوي ، ويزيل أي جزيئات عضوية متبقية من الشرائح والأغطية.
  7. لإعداد محلول البيرانا ، صب بلطف 2/3 حجم من حمض الكبريتيك (98 ٪ ، v / v) في كوب زجاجي واملأ الباقي ببيروكسيد الهيدروجين (30 ٪ ، v / v). امزج المحلول بعناية بقضيب زجاجي ، واسكبه في جرة كوبلن ، واترك جرة كوبلن في غطاء الدخان لمدة 1 ساعة على الأقل.
  8. قم بصب محلول البيرانا من جرة كوبلن في حاوية مهملة للنفايات الحمضية المحفوظة داخل غطاء الدخان. شطف جرة كوبلن مع كمية وفيرة من الماء من النوع 1.
  9. جفف الشرائح والأغطية في تيار لطيف من غاز النيتروجين وضعها في جرة كوبلن نظيفة. الشرائح المجففة والأغطية جاهزة الآن للمعالجة بالبلازما. خذ زوجا من الشرائح وأغطية الغطاء وضعها في آلة البلازما.
  10. خلق فراغ في الغرفة. أدر المقبض إلى تردد الراديو MHz 8-12 لتوليد البلازما في الغرفة. سيشير التوهج الأرجواني داخل الغرفة إلى تكوين بلازما في الغرفة.
  11. إجراء العلاج بالبلازما لمدة 8-10 دقائق. حرر الفراغ بلطف بعد إيقاف تشغيل البلازما وانتقل إلى الخطوة 2 لتجميع غرفة التصوير الموائع الدقيقة.

2. تجميع غرفة الموائع الدقيقة

ملاحظة: يتم إنشاء غرفة التصوير عن طريق وضع شريط على الوجهين بين غطاء تم تنظيفه مسبقا وانزلاق من الخطوة السابقة كما هو موضح أدناه.

  1. قم بتجميع الشرائح والغطاء بعد معالجة البلازما كما هو موضح في الشكل 1. ضع الشريحة الزجاجية على ورق مناديل نظيفة. قم بقص الشريط على الوجهين إلى شرائح بعرض ~ 2-3 مم وضعها على كل جانب من زوج من الثقوب على الشريحة الزجاجية. استخدم طرف ماصة لتسطيح الشريط أو سيؤدي إلى تسرب من قناة إلى أخرى.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، قم بقص الشريط الخاص بالشريحة بأكملها باستخدام قاطع ليزر أو راسمة آلي (الشكل 1).
  2. ضع الغطاء المعالج بالبلازما على الشريحة المسجلة لإغلاق الغرفة. استخدم طرف ماصة للضغط برفق على الغطاء على المناطق المسجلة لجعل القناة مانعة للماء.
  3. إذا كنت تستخدم شرائح زجاجية ، فقم بإغلاق الحواف باستخدام راتنجات الإيبوكسي. وأخيرا، فإن كل غرفة تصوير مصنوعة من شريحة وغطاء لها بعد 10 مم × 2 مم × 0.1 مم (الطول × العرض × العمق). قم بتخزين غرف التصوير الموائع الدقيقة المعدة لمدة 1-2 أسابيع في ظروف مجففة (يفضل أن تكون بين 10-25 درجة مئوية).
    ملاحظة: بالنسبة للأشرطة المقطوعة بالليزر المستخدمة مع شرائح الأكريليك ، ليس من الضروري استخدام الإيبوكسي لأن حواف الشريط تشكل ختما مقاوما للتسرب.

3. جعل الطبقات المزدوجة المدعومة على الركيزة الزجاجية عن طريق الانصهار الحويصلة

ملاحظة: يتم إنشاء طبقات ثنائية الدهون المدعومة المزدحمة على جدران غرفة التصوير عن طريق دمج الحويصلات الدهنية المحضرة بدهون PEG المنشطة.

  1. خذ قارورة زجاجية نظيفة ، ويفضل تنظيفها مسبقا باستخدام محلول البيرانا. أضف محلول الكلوروفورم من 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوكولين (POPC) و 1,2-ديولويل-sn-glycero-3-فوسفويثانولامين-N-[أمينو (بولي إيثيلين جليكول)-2000] (DOPE-PEG2000) عند جزء الخلد المطلوب من دهون PEG2000 بحيث يكون التركيز النهائي بعد إضافة المخزن المؤقت 3 mM من الدهون في الخطوة 3.4. إعداد تركيبات غشاء أخرى من الدهون بالمثل.
  2. جفف الكلوروفورم من القارورة باستخدام تيار لطيف من النيتروجين مع دوامة صغيرة بحيث يتم طلاء الدهون المجففة بشكل موحد على سطح القارورة. ضع القارورة في مجفف فراغ لمدة 1 ساعة. سيؤدي ذلك إلى إزالة أي كلوروفورم متبقي في القارورة الزجاجية. أضف 1 مل من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) واحتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  3. قم بإعداد حويصلات أحادية الصفيحة الصغيرة (SUVs) كما هو موضح أدناه.
    1. دوامة بلطف لمدة 1-2 دقيقة بعد الحضانة بين عشية وضحاها حتى يتحول المحلول عكر وحليبي.
    2. خذ 100 ميكرولتر من هذا المحلول في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 500 ميكرولتر وسونيكات لمدة 1 ساعة تقريبا في سونيكتور الحمام (مضبوط على إعداد طاقة 70 واط). وسيصبح الحل واضحا. إذا لم يكن الأمر كذلك ، ثم سونيك لمدة 30 دقيقة إضافية. ستولد هذه الخطوة سيارات الدفع الرباعي التي يتراوح قطرها بين 50 و 100 نانومتر.
      ملاحظة: في حالة التحضير لأول مرة، قم بتوصيف سيارات الدفع الرباعي باستخدام تشتت الضوء الديناميكي22,23 (DLS) أو طريقة مكافئة.
  4. أضف كلوريد الكالسيوم (مخزون CaCl2 ، 3 M) إلى الحويصلات الصوتية بحيث يكون تركيزه النهائي 30 mM في محلول الدهون.
  5. قم بقص طرف ماصة دقيقة لحقن محلول العينة بحيث يتناسب بإحكام مع الحفرة. امزج محلول الدهون وحقنه من خلال أحد الثقوب الموجودة في غرفة التصوير المصنوعة في الخطوة 2. امسح المحلول الزائد الذي يخرج من الغرفة من المخرج بمنديل نظيف لمنع تلوث القنوات المجاورة.
  6. اترك هذه الجمعية في غرفة رطبة لمدة 90 دقيقة. قم بإعداد غرفة ترطيب عن طريق وضع نسيج مبلل في نهاية أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. ضع الشريحة جانبيا داخل الأنبوب مع إغلاق أغطية الأنبوب. سوف تندمج الحويصلات وتولد طبقة ثنائية موحدة على السطح الزجاجي.
  7. اغسل الغرفة جيدا بكمية وفيرة من المخزن المؤقت PBS (حوالي 5 أضعاف حجم غرفة التصوير). منع دخول فقاعات الهواء إلى الغرفة أثناء الغسيل لأن هذا يمكن أن يولد عيوبا في الغشاء.

4. إعداد المجهر وقياسات التصوير بجسيم واحد

ملاحظة: يتم إجراء تجارب الجزيء الواحد على إعداد مجهر الانعكاس الداخلي الكلي القائم على الهدف 24،25،26 (TIRF) (الشكل 2). يوفر التصوير TIRF نسبة إشارة إلى ضوضاء أفضل للتصوير بجزيء واحد ، على الرغم من أنه يمكن أيضا استخدام المجاهر فوق الفلورية في ظل ظروف معينة (خاصة عندما يمكن إزالة الجزيئات الحيوية الفلورية من المحلول السائب عن طريق الغسيل). يمكن استخدام TIRF من نوع المنشور ولكن النوع الموضوعي هو الأفضل لسهولة إعداد الموائع الدقيقة27. بالنسبة ل TIRF من النوع الموضوعي، يوصى باستخدام هدف فتحة عددية عالية (تكبير 100x، وعادة ما يكون متاحا تجاريا كهدف TIRF).

  1. قبل إجراء أي تجربة على التنقل والتجميع ، قم بمحاذاة مجهر TIRF لضمان نسبة إشارة إلى ضوضاء مثالية بسبب الإضاءة بواسطة حقل الانحراف. أثناء المحاذاة ، حافظ على طاقة الليزر منخفضة ، بين 100 ميكروواط و 1 ميجاوات.
    تنبيه: يجب استخدام نظارات السلامة بالليزر أثناء محاذاة شعاع الليزر.
    1. لمحاذاة المجهر ، قم بإعداد عينة من حبة الفلورسنت عن طريق إضافتها إلى قناة الموائع الدقيقة بتركيزات منخفضة (عند ~ 100 PM) بحيث لا تتداخل بقع الفلورسنت من الخرز الفردي في الصور.
    2. أولا ، تصور الخرز في وضع epifluorescence. أثناء وجود الإضاءة في وضع التألق ، حرك مرحلة ترجمة مرآة M5 (المرآة التي تعكس الليزر إلى الديكرويك) بحيث ينحني الشعاع الخارج من الهدف حتى يصبح في النهاية في تكوين انعكاس داخلي كامل.
    3. تحقق مما إذا كانت إضاءة النقل البري الدولي (التير) قد تحققت. عندما يضيء حقل TIR المتفادي عينة الخرز، تحقق من أن الخرز الموجود على السطح فقط مرئي ولا يتم ملاحظة الخرز العائم الحر بعيدا عن السطح.
  2. في بداية التجربة ، اضبط طاقة الليزر على المستوى البؤري الخلفي الموضوعي على 5-10 ميجاوات لمنع التدمير الضوئي (التبييض الضوئي) للفلوروفورات.
  3. حافظ على الشريحة على مرحلة المجهر وركز على الغشاء العاري (بدون أي فلوروفورات) أولا. عادة ما تكون الآثار الصغيرة للشوائب في الأغشية الدهنية كافية للقيام بذلك. اختياري: قم بدمج عدد صغير من حبات الفلورسنت أو النقاط الكمومية (نطاق البيكومولار الفرعي) خلال الخطوة 3.1 ، بحيث لا يوجد سوى جزيئين إلى خمسة جسيمات فلورية في مجال الرؤية لتسهيل تحديد التركيز الصحيح.
  4. حقن العينة (بروتينات الغشاء ، وما إلى ذلك) باستخدام ماصة دقيقة في غرفة التصوير المطلية ب PEG-SLB المصنوعة في الخطوة 3.7.
  5. لقياس حركيات ربط الجزيء الواحد ، استخدم مضخة حقنة لتدفق الجزيئات الحيوية المصنفة من خلال ثقوب المدخل إلى غرفة الموائع الدقيقة (الشكل 3). استخدم معدل تدفق 50-500 ميكرولتر / دقيقة.
    1. ابدأ في الحصول على الفيلم قبل إضافة الحل إلى غرفة التصوير. احصل على >5000 إطار بمعدل إطارات يتراوح بين 25 و 50 إطارا / ثانية تحت التدفق المستمر حتى لا تكون هناك زيادة أخرى في ظهور بقع جديدة على سطح الغشاء (فيديو 1). لتحليل حركيات الربط ، اتبع الخطوات من 6.1.
  6. لتتبع الجسيمات المفردة، أضف الجزيئات الحيوية المسماة بتركيزات منخفضة (مقارنة بثابت الربط) إلى القناة باستخدام ماصة دقيقة. قم بتحسين التركيز إلى كثافة <0.1 جسيمات/ميكرومتر 2 بحيث نادرا ما تتقاطع الجسيمات الفردية مع المسارات (فيديو 2). وهذا يضمن الدقة العالية للمسارات المستردة من مجموعات البيانات. احتضان إذا لزم الأمر (في حالة ضعف ربط الغشاء بواسطة الجزيئات الحيوية ، ~ 10 دقائق) في بيئة رطبة وغسل الغرفة مع العازل.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى الغسيل في حالة ضعف الارتباط على الغشاء وتبقى معظم جزيئات الفلورسنت في المحلول. خلاف ذلك ، قد يتداخل هذا مع التصوير ويؤدي إلى ضعف نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
  7. لتحليل مسار الجسيمات المفردة، احصل على 200-500 إطار عند 10-100 إطار/ثانية. حافظ على العدسة الموضوعية التي تركز على المستوى ثنائي الطبقة مع الحد الأدنى من انحراف المرحلة خلال فترة الاستحواذ.

5. الحصول على صورة لحساب الوحدات الفرعية في تجميع البروتين

ملاحظة: يتطلب الحصول على الصور لتقدير قياس الفلور التبييض المستمر للفلوروفورات والكشف عن عدد الخطوات حتى لا تنبعث المزيد من الفلوروفورات من التألق.

  1. لقياس الوحدات الفرعية، يضاف التركيز ذي الصلة للجزيئات الحيوية المصنفة (على سبيل المثال: انظر النتائج؛ تمت إضافة ClyA بتركيز 25 نانومتر) إلى غرفة التصوير الموائع الدقيقة واحتضانها (غسلها إذا لزم الأمر). احتضان الشريحة في غرفة ترطيب عند درجة الحرارة المطلوبة للفترة الزمنية المطلوبة (على سبيل المثال: 37 درجة مئوية و 60 دقيقة لتجميع ClyA).
  2. قم بإجراء الحصول على الصور للتبييض الضوئي أحادي الجزيء كما هو موضح أدناه.
    1. اغسل غرفة التصوير بمخزن مؤقت قبل التصوير (إذا لزم الأمر). ضع الشريحة على المجهر واضبط التركيز البؤري لتصور الجزيئات الموسومة.
    2. اضبط طاقة الليزر على مستوى يحدث فيه تبييض الفلوروفور تدريجيا (~ 1-5 دقائق). من الناحية المثالية ، لكل جزيء حيوي تم تجميعه ، حافظ على معدل خطوة التبييض الضوئي >10-20 إطارا للتصوير. احصل على الصور حتى يتم تبييض جميع الجزيئات بالكامل (فيديو 3).
      ملاحظة: لتحديد المدة الإجمالية لمسار التبييض الضوئي المطلوب، ارسم متوسط كثافة البقع الفردية بعدد إطارات التصوير وحدد ثابت الوقت عن طريق تركيب دالة الاضمحلال الأسي. يمكن ضبط المدة الإجمالية للاستحواذ على 5-10 أضعاف ثابت الوقت.
  3. قم بإجراء قياس تجميع يعتمد على الوقت من خلال بدء الحصول على الفيلم بمجرد إدخال العينة إلى الغرفة والحصول على أفلام تبييض ضوئي جديدة على فترات زمنية ثابتة بعد ربط الغشاء من أجزاء مختلفة من PEG-SLB.

6. تحليل الصور والبيانات

  1. قم بإجراء ربط وتتبع جسيم واحد كما هو موضح أدناه.
    1. استخراج مسارات الجسيمات المفردة من الأفلام التي تم الحصول عليها أعلاه، كما هو موضح في الشكل 4. للكشف عن الجسيمات الفردية وتتبعها ، استخدم حزمة MATLAB ، u-track28 ، أو Trackmate29 ، وهو مكون إضافي في ImageJ ، والذي يوفر أيضا خوارزمية قوية لتتبع الجسيمات المفردة. اتبع الخطوات لإعداد تحليل u-track كما هو موضح في الملف التكميلي 1.
      ملاحظة: المعلمات الحرجة لتتبع الجسيمات المفردة هي الانحراف المعياري لحجم الجسيمات (بالبكسل) وطول سد الفجوة. استخدم 1 و 0 ، على التوالي ، لهذه المعلمات كأكثر المعايير صرامة للتتبع.
    2. لحساب ثوابت معدل الربط، قم أولا بتقدير عدد الجسيمات المرتبطة بسطح الغشاء بمرور الوقت. استخدم ملف MATLAB binding_SPT (ملف الترميز التكميلي 2) مع مجلد الإخراج u-track لتحديد ورسم عدد الجسيمات التي تظهر على الغشاء الذي تم الحصول عليه من الخطوة 6.1. ملاءمة الحركيات المرصودة للنماذج الحركية المناسبة (على سبيل المثال: الملاءمة الأسية المفردة لتحديد ثابت الزمن، والتي يمكن تعيين عكسها إلى ثابت المعدل الظاهر)30 لاستخراج ثوابت المعدل (انظر النتائج، الشكل 5).
    3. تشير الإزاحة المتوسطة المربعة (MSD) للجسيمات المنتشرة (مثل مقتفي الحمض النووي في PEG-SLBs ، الشكل 6) إلى طبيعة الانتشار. استخدم حزمة MATLAB MSD_ISD (ملف الترميز التكميلي 2) مع مجلد الإخراج u-track للحصول على مخطط MSD كدالة لوقت التأخير (الشكل 6B).
    4. لتحديد الأنواع المنتشرة غير المتجانسة، احسب توزيعات الإزاحة التربيعية الفورية (ISD) كما هو موضح في الشكل 6C. ISD2 ، الذي يعرف بأنه (X t + τ - X t)2 + (Y t+ τ− Y t)2 ، حيث يفضل وقت التأخر ، τ = 2 ، لأنه يقلل من الضوضاء. قم بتصفية المسارات القصيرة بأقل من ثلاثة إطارات لتقليل الضوضاء.
    5. استخدم ISD_analyzer (ملف الترميز التكميلي 2) في MATLAB مع مخرجات المسار U لرسم ISDs للجسيمات المتعقبة (الشكل 6C).
  2. قم بإجراء تحليل التبييض الضوئي أحادي الجزيء كما هو موضح أدناه.
    1. لتقدير قياس ستويشيومتري لمجمعات الأغشية ، قم بإجراء تحليل التبييض الضوئي على الكثافة المعتمدة على الوقت لمجمعات الفلورسنت (فيديو 3). لهذا ، قم بتطبيق خوارزمية تصحيح الانجراف (drift_correct_images ، ملف الترميز التكميلي 2) استنادا إلى الارتباط التلقائي لإطارات الأفلام لاستخراج انحراف الترجمة. هذا يفترض أن الهياكل المجمعة غير متحركة إلى حد كبير أثناء الحصول على الصورة. قم بتشغيل حزمة MATLAB Extract_traces_1C (ملف الترميز التكميلي 2) للكشف عن آثار وقت كثافة الجسيمات من الأفلام.
    2. استخدم التعليمات البرمجية MATLAB Stepcount_immobile (ملف الترميز التكميلي 2) لإجراء الكشف عن الخطوة لتتبع وقت الكثافة. في حال لم تكن الجسيمات غير متحركة ، استخدم حزمة u-track لاستخراج موقع الجسيمات المتحركة. يمكن تعيين هذه المجموعة من إحداثيات xy إلى الأفلام الخام لاستخراج قيم كثافة الجسيم المتحرك أثناء انتشاره أفقيا على الغشاء. استخدم حزمة MATLAB utrack_Int (ملف الترميز التكميلي 2) مع الإخراج من تحليل المسار u-track لهذا الخيار.
    3. قم بإجراء تصحيح لوضع العلامات غير المكتملة على الجزيئات الحيوية باستخدام علامات الفلوروفور لتقدير قياس ستويشيومتري مركب البروتين الصحيح. تحديد كفاءة وضع العلامات باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية UV-VIS عن طريق قياس امتصاص الصبغة والبروتين لتقدير التركيز. احسب كفاءة وضع العلامات كنسبة مولية للصبغة إلى البروتين.
      ملاحظة: تمتص بعض الأصباغ أيضا بأطوال موجية قريبة من 280 نانومتر، وبالتالي، ينبغي حساب مساهمة الامتصاص هذه من قبل الصبغة أثناء حساب التركيز.
    4. قم بإجراء تصحيح ذو حدين لحساب كفاءة وضع العلامات غير المكتملة للفلوروفور بالطريقة التالية باستخدام رمز MATLAB Step_correction (ملف الترميز التكميلي 2) مع البيانات التي تم الحصول عليها من عد الخطوات في الخطوة 6.2.2. على سبيل المثال ، بالنسبة للسم المكون للمسام مثل Cytolysin A ، والذي يشكل بنية تشبه حلقة دوديكاميريك ، قم بتطبيق تصحيح ذو حدين باستخدام الصيغة التالية:
      نكEquation 1
      حيث Equation 2 = كفاءة وضع العلامات ، n = عدد خطوات التبييض الضوئي ، و s = الأعداد الفعلية. استخدم Stepcount_immobile الروتينية MATLAB لاستعادة الأنواع قليلة القلة المصححة. تحويل تواتر الأوليغومرات (si) إلى كسور الكتلة (الشكل 7C; ملف الترميز التكميلي 2).
      ملاحظة: يتم تضمين مجموعة من الملفات التي تم تحليلها في ملف الترميز التكميلي 3. يمكن تشغيل رموز MATLAB في ملف الترميز التكميلي 2 باستخدام مجموعات البيانات هذه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مراقبة ارتباط بروتين ClyA على أغشية PEGylated
بعد الخطوة 4.5 ، يتم تقدير حركية الربط عن طريق رسم عدد الجسيمات المرتبطة بسطح الغشاء بمرور الوقت (فيديو 1). عندما يرتبط بروتين ClyA بغشاء يحتوي على 5٪ من دهون PEG2000 مول ، تزداد كثافة الجسيمات وتصل إلى التشبع (الشكل 5). يعطي الاضمحلال الأسي المناسب للجسيمات المرتبطة (الدوائر السماوية) ثابت الوقت (τb) لربط الغشاء (على وجه الخصوص ، نقاط الوقت الأولية [الدوائر الحمراء] غير مناسبة في هذه الحالة).

تنقل مقتفي الحمض النووي على الأغشية المزدحمة
عادة ما نستخدم مقتفيات الحمض النووي (الحمض النووي المرتكز على الغشاء باستخدام توكوفيرول) أو أصباغ التتبع المحبة للدهون (على سبيل المثال ، DiI) ، أو بروتينات الغشاء (على سبيل المثال ، ClyA) لتوصيف الغشاء تحت الازدحام بوساطة PEG. يمكن مراقبة الانتشار الجانبي لجزيئات التتبع المصنفة (25-100 pM) عن طريق تصوير الغشاء عند ربط الجسيمات. في حالة عدم وجود أي بوليمر PEG في الغشاء ، فإن معظم المقتفيات (خاصة تلك التي تمتد خارج الطبقة الثنائية) تعرض انتشارا مقيدا على SLBs (الشكل 6A). مع مستويات صغيرة من PEG2000 في الغشاء (0.5-2 مول) ، ترفع الطبقة الثنائية بعيدا عن السطح الأساسي ، ويمكن أن تنتشر جزيئات التتبع دون قيود. من ناحية أخرى ، لوحظ الحبس الشديد عند تركيز عال من PEG (20 mol٪) ، حيث تكون جزيئات PEG في نظام فرشاة كثيف ، مع مجموعة متنوعة من السلوكيات المعروضة بينهما. ويبين الشكل 6 باء مخططات MSD لهذه الشروط الثلاثة. استنادا إلى توصيفنا لأغشية الطبقة الثنائية POPC / DOPE-PEG2000 ، نوصي بجزء 1-3 mol٪ DOPE-PEG2000 الذي يحفز الازدحام في نظام الفطر. فوق 7.5 مول ٪ PEG2000-lipid ، نلاحظ بداية نظام الفرشاة ، ويمكن استخدام التراكيب حتى 25 مول ٪ PEG2000-lipid للحث على الازدحام والحبس. إن الظروف الدهنية المتداخلة بنسبة 4-7٪ من PEG2000 المقابلة للانتقال بين النظامين سيئة الوصف وينبغي تجنبها.

تجميع ClyA على الأغشية المزدحمة
تعرض مسارات كثافة البقع الفردية المحدودة الحيود من بروتين ClyA بعد الحضانة على الغشاء المزدحم (الشكل 7A ، B) عددا كبيرا من خطوات التبييض الضوئي المميزة ، مما يشير إلى تكوين وسيطات تجميع مختلفة31. ClyA ، كونه بروتينا عبر الغشاء ، يتفاعل مع السطح الزجاجي سالب الشحنة في غياب PEG وسوف يتجمع بشكل سيئ للغاية. عند 7.5 مول ٪ من الدهون PEG2000 ، تم قياس المجمعات المجمعة ويتم رسمها في الشكل 7C. بعد تصحيح كفاءة وضع العلامات (0.9 في هذه الحالة) ، يعرض التوزيع النهائي ل oligomers أنواع ClyA dodecameric كبنية مهيمنة ، بما يتفق مع البيانات الهيكلية32.

Figure 1
الشكل 1: مخطط لخطوات التنظيف وتجميع غرفة الموائع الدقيقة. (أ) يتم تنظيف الشرائح الزجاجية وزلات الغطاء بصوتنة متسلسلة في محلول المنظفات والأسيتون والميثانول و KOH والبيرانا ، مع شطف متعدد بواسطة الماء فائق النقاء من النوع 1 بين كل خطوة. ثم يتم تجفيف الشرائح والأغطية بغاز النيتروجين قبل معالجة البلازما. (ب) ثم يتم تجميع غرفة التصوير الموائع الدقيقة باستخدام شريط لاصق على الوجهين مقطوع مسبقا يربط الشريحة بالغطاء الزجاجي. * لا يتم التعامل مع شرائح الأكريليك بمحلول البيرانا ، ويتم استخدام الأسيتون والميثانول و KOH بتركيز 50٪ (v / v) من ذلك المستخدم لتنظيف الغطاء . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد مجهر TIRF. يتم عرض إعداد مجهر TIRF نموذجي من النوع الموضوعي تم تكييفه على مجهر مقلوب مع تسليط الضوء على البصريات الأساسية. M1–M5 هي مرايا لتوجيه شعاع الليزر. تستخدم العدسات L1 و L2 لتوسيع شعاع الليزر ، وتركز عدسة L3 شعاع الليزر على المستوى البؤري الخلفي للعدسة الموضوعية. I1 و I2 هما غشاء القزحية المستخدم لمحاذاة شعاع الليزر. يتم استخدام مصراع للتحكم في إضاءة شعاع الليزر ، وهو أمر بالغ الأهمية لمنع التبييض الضوئي غير الضروري لجزيئات التألق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إعداد تدفق حركيات ربط الغشاء. لإجراء تجربة الربط ، يتم استخدام أنبوب PTFE رفيع (0.022 في ID x 0.042 في OD) لتدفق العينة بمساعدة مضخة حقنة (الصورة ليست على نطاق واسع). يتم توصيل نهاية الأنابيب بمخرج غرفة التصوير بمساعدة طرف ماصة دقيقة. يتم جمع المهملات في خزان microtip صغير متصل بالمخرج ، ويكون الحجم الذي يتم إدخاله دائما أكبر من 10 أضعاف حجم غرفة التصوير. شكل داخلي يوضح المقطع العرضي لغرفة التصوير. (الصورة ليست على نطاق واسع) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: خط أنابيب للتحليل من مسارات الجسيمات المفردة وأفلام التبييض الضوئي. (أ) تم تحليل الأفلام المكتسبة باستخدام مسار u في MATLAB للحصول على المسارات ك (x ، y) وكثافة (i) لكل جسيم ، إطار تلو الآخر. ثم استخدمت هذه المسارات لحساب الإزاحة المربعة الفورية (ISD) و ISD1 و ISD2. يمكن بعد ذلك رسم ISDs كرسوم بيانية لتحديد الأنواع المتنقلة. بدلا من ذلك ، توضح مخططات الإزاحة المربعة المتوسطة (MSD) ما إذا كانت الحركة غاوسية أو محصورة أو فائقة الانتشار33,34. يمكن استخدام تحليل ماركوف المخفية نموذج35 (HMM) للتمييز بين الحالات المنتشرة المختلفة لجسيم واحد. (ب) بالنسبة لتحليل التبييض الضوئي ، تم تصحيح الأفلام أولا للانحراف في النظام (إذا لزم الأمر) ، تليها اكتشاف الجسيمات أو تتبعها باستخدام مسار u. بصرف النظر عن تقدير توزيع الكثافة23 (وميزات الجسيمات الأخرى) ، يمكن تحليل مسارات الكثافة لعدد خطوات التبييض الضوئي باستخدام خوارزميات إيجاد الخطوات36,37,38. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: ربط ClyA بالأغشية الدهنية المدعومة بنسبة 5٪ mol DOPE-PEG2000. يتم الحصول على منحنى ربط نموذجي بعد حساب عدد الجسيمات في كل إطار يتم تحديده بواسطة مسار u. يبدأ التصوير قبل تدفق بروتين ClyA المرتبط بالغشاء. تستخدم دالة الاضمحلال الأسي (الخط الأسود) المناسبة لأرقام الجسيمات (الدوائر السماوية) لاستعادة ثابت الوقت لربط ClyA بالغشاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تنقل الحمض النووي المحب للدهون على أغشية الطبقة الثنائية من PEG-lipid. (A) يظهر مخطط لمقتفي الحمض النووي المحب للدهون في غشاء POPC / DOPE-PEG2000. (ب) يظهر متوسط الإزاحة التربيعية المحسوبة من تتبع الجسيمات المفردة لمختلف PEG-SLBs. في 2 mol٪ DOPE-PEG2000 ، يعرض متتبع الحمض النووي السلوك البراوني النقي مقارنة بالحركة المعوقة في غياب البوليمر (يتم تضمين الخط المتقطع كمرجع). من ناحية أخرى ، ينحرف نفس مقتفي الحمض النووي بعيدا عن الانتشار البراوني النقي ، مما يشير إلى حركة شبه منتشرة مع انخفاض الحركة في وجود 20 مول ٪ DOPE-PEG2000. (ج) تتم مقارنة توزيع ISD2 لنشر مقتفي الحمض النووي المحب للدهون في اثنين من أغشية الدهون PEG2000 المختلفة ب SLBs العارية.

Figure 7
الشكل 7: آثار التبييض الضوئي وتجميع ClyA على أغشية الدهون ثنائية الطبقة. (A ، B) تظهر آثار الوقت التمثيلي خطوات التبييض الضوئي لمركب ClyA nanopore المكتشف في الخطوة 6.2.1. لمجمع ClyA مجمع مجمع مع 7 و 5 خطوات ، على التوالي. (ج) توزيع خطوة التبييض الضوئي (رمادي) ل ClyA (25 نانومتر) المحتضن على 64.7٪ POPC: 27.8٪ الكوليسترول: 7.5٪ غشاء DOPE-PEG2000 لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد تصحيح كفاءة وضع العلامات غير المكتملة ، يتم عرض الجزء الكتلي المقدر لمختلف الأنواع قليلة القلة (أرجواني). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: ربط ClyA على الغشاء. مراقبة ارتباط بروتين ClyA المسمى Cy3 بغشاء SLB الذي يحتوي على 5 مول٪ DOPE-PEG2000. يتم الكشف عن الجسيمات المرتبطة (الدوائر السماوية) بواسطة مسار u، ويتم رسم المسارات لخمسة مواقع لاحقة في مسارها. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو 2: انتشار مقتفي الحمض النووي على غشاء PEG 2 mol٪. فيلم للحمض النووي المسمى Cy3 مثبت على الغشاء الدهني عبر توكوفيرول في غشاء 2 mol٪ PEG2000. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 3: فيلم التبييض الضوئي. فيلم من oligomers المجمعة من جزيئات ClyA التي تحمل علامة Cy3 على الغشاء الذي يحتوي على 7.5 mol٪ DOPE-PEG2000. تتجلى المجمعات الأكبر حجما من الكثافة الأعلى عدة أضعاف مقارنة ببروتين واحد ، وكذلك من خطوات التبييض الضوئي المتعددة عند ملاحظة شدة الجسيمات بمرور الوقت تحت الإضاءة المستمرة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الملف التكميلي 1: معلومات حول كيفية استخدام u-track ورموز MATLAB المختلفة في الخطوة 6. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 1: ملف تصميم تمثيلي بمساعدة الكمبيوتر (CAD) لعمل ثقوب في شريحة الأكريليك وشريط قطع للشريحة بأكملها. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملفات الترميز التكميلية 2: مجلد مضغوط يحتوي على رموز MATLAB المرتبطة اللازمة لتحليل الصور والبيانات في الخطوة 6. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملفات الترميز التكميلية 3: عينة من البيانات لتحليل الصور والبيانات في الخطوة 6. رموز MATLAB متاحة أيضا في https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، نعرض تجارب جزيء واحد على الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) التي تظهر بيئة مزدحمة للجزيئات الحيوية المضمنة في الغشاء. تولد البيئة المزدحمة تأثير حجم مستبعد ، مما يؤدي إلى تعزيز التفاعلات الجزيئية الحيوية1،2،39،40. بالنسبة لنظام PEG-lipid ، حيث يحتل البوليمر في المقام الأول الحجم خارج الطبقة الثنائية ، يكون هذا التأثير واضحا بشكل خاص للأنواع الجزيئية ذات المجالات الخارجية الكبيرة. لذلك ، بالمقارنة مع الأصباغ المحبة للدهون ، يمكن تقليل انتشار جزيء كبير محب للماء مدمج في الغشاء ، مثل المستقبلات والبروتينات السكرية والجليكوليبيد بشكل كبير. باستخدام الحمض النووي الفلوري المقتفي المثبتة على الغشاء عبر توكوفيرول (الشكل 5) ، يمكننا تحديد آثار الازدحام هذه.

بشكل منفصل ، فإن وجود PEG في النشرة السفلية يرفع أيضا SLB ويقلل من تفاعل الجزيئات الحيوية مع الركيزة الداعمة14,41. عادة ما يعيق السطح السالب الشحنة لسطح زجاج التصوير الحركة والتفاعلات الجزيئية. لذلك ، فإن استخدام دهون PEG لرفع الغشاء بعيدا عن الزجاج مفيد حتى عندما لا يكون لغرض الازدحام. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر لتحديد أنظمة التركيز التي لا تظهر الازدحام الجزيئي في تلك الحالات. بالنسبة للبروتينات التي تمتد نطاقات أكبر خارج الطبقة الثنائية ، قد يكون من الضروري استخدام دهون PEG-lipid ذات وزن جزيئي أعلى مثل PEG500042.

بعض النقاط الرئيسية حاسمة للتصوير أحادي الجزيء على أنظمة SLB. يعد التنظيف الدقيق للشرائح وزلات الغطاء أمرا بالغ الأهمية في تجارب الجزيء الواحد (الخطوة 1). سيؤدي تصوير سطح به شوائب إلى عيوب في الغشاء الدهني. هذا يمكن أن يؤدي إلى بقع من الجزيئات الحيوية الموسومة بالفلورسنت على سطح الغشاء. يمكن التحقق من تغطية وتوحيد SLB المتشكل في إعداد منفصل عن طريق تخدير الطبقة الثنائية بصبغة دهنية (DiI أو Lissamine Rhodamine DOPE) وتصويرها تحت المجهر الفلوري. يمكن استخدام تحليل FRAP لقياس السلوك المنتشر وكذلك43,44.

بالنسبة لتجارب ربط الغشاء (الخطوة 4) ، يجب إعداد إعداد التدفق باستخدام الأنبوب باستخدام المخزن المؤقت لمنع دخول فقاعات الهواء إلى الغرفة. معدلات تدفق أعلى أو وجود فقاعات الهواء سوف تمزق الغشاء ، وسوف ترتبط الجزيئات بالغطاء مباشرة. يجب أن يبدأ الحصول على الصور قبل أن يبدأ التدفق حيث تنتشر بعض الجزيئات من الأنابيب وترتبط بالغشاء. يمكن تسهيل تركيز الهدف على الطبقة الثنائية أثناء التصوير عن طريق منشطات الطبقة الثنائية بتركيز منخفض باستخدام جسيمات الذهب النانوية أو النقاط الكمومية أو حبات الفلورسنت.

بالنسبة لتجارب تتبع الجسيمات المفردة ، يجب التحكم في عدد الجسيمات الموجودة على الغشاء لتجنب سيناريو يكون فيه التتبع صعبا بسبب التداخل المفرط لمسارات الجسيمات. عامل آخر مهم يجب مراعاته أثناء التصوير هو قوة الليزر. ستؤدي طاقة الليزر العالية إلى تبييض الفلوروفورات بسرعة ، في حين أن الكثافة المنخفضة ومعدلات الحصول على الصور البطيئة المقابلة ستتسبب في عدم الوضوح. يجب أن تسفر طاقة الليزر المثلى عن طول مسار كبير (على الأقل >5 في المتوسط) مع الحفاظ على صور متناظرة وقريبة من صور الجسيمات المحدودة بالحيود . يمكن أيضا استخدام نظام كسح الأكسجين لإطالة التبييض الضوئي للفلوروفورات45. ينشأ حد من تحليل التبييض الضوئي المعروض هنا 37,46 في حالة التجمعات الجزيئية الكبيرة (~ أكبر من 20 وحدة فرعية) ، مثل مجمع المسام النووية47. في مثل هذه الحالات ، يمكن استخدام نهج قائم على بايزي لاستنتاج عدد سكان الوحدات الفرعية48،49،50.

وضع العلامات على الجزيئات الحيوية مع الفلوروفورات في معظم الحالات ليست كاملة51. وهذا يشكل تحديا في عد الوحدات الفرعية في مجموعة ذات أنواع غير موسومة. عادة ما يكون التصحيح ذو الحدين لكفاءة وضع العلامات دون المستوى تقريب معقول عندما يتم إصلاح قياس stoichiometry للأنواع الجزيئية. في كثير من الحالات ، يمكن أن تكون الأنواع قليلة القلة غير متجانسة أو متغيرة ديناميكيا ، كما هو الحال في عملية احتكار القلة ، مما يتطلب تطوير أدوات جديدة لاستخراج التوزيعات الأساسية من بيانات التبييض الضوئي.

بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول خط أنابيب لتوليد PEG-SLBs ، مع توصيات لظروف استخدام وتنفيذ وتحليل ربط الجزيء الواحد ، وتتبع وإجراء تحليل التبييض الضوئي للجزيئات الحيوية الغشائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يعترف المؤلفون بالبروفيسور بنيامين شولر لمشاركة تعبير البلازميد لبروتين ClyA. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج علوم الحدود البشرية (RGP0047-2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 - 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 185 ،
نشر جزيء واحد وتجميعها على أغشية الدهون المزدحمة بالبوليمر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., … More

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter