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Biochemistry

Diffusion et assemblage d’une molécule unique sur des membranes lipidiques encombrées de polymères

Published: July 19, 2022 doi: 10.3791/64243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

Summary

Ici, un protocole pour effectuer et analyser la liaison, la mobilité et l’assemblage de molécules uniques sur des membranes lipidiques artificielles encombrées à l’aide de la microscopie à fluorescence interne totale à molécule unique (smTIRF) est présenté.

Abstract

Les membranes cellulaires sont des environnements très encombrés pour les réactions biomoléculaires et la signalisation. Pourtant, la plupart des expériences in vitro sondant l’interaction des protéines avec les lipides utilisent des membranes bicouches nues. De tels systèmes n’ont pas les complexités de l’encombrement par les protéines et les glycanes intégrés dans la membrane et excluent les effets de volume associés rencontrés sur les surfaces de la membrane cellulaire. En outre, la surface de verre chargée négativement sur laquelle les bicouches lipidiques sont formées empêche la libre diffusion des biomolécules transmembranaires. Ici, nous présentons une membrane polymère-lipide bien caractérisée comme imitateur pour les membranes lipidiques encombrées. Ce protocole utilise des lipides conjugués au polyéthylène glycol (PEG) comme approche généralisée pour incorporer des encombrements dans la bicouche lipidique supportée (SLB). Tout d’abord, une procédure de nettoyage des lames microscopiques et des lamelles de recouvrement pour effectuer des expériences sur une seule molécule est présentée. Ensuite, les méthodes de caractérisation des PEG-SLB et la réalisation d’expériences sur une seule molécule de liaison, de diffusion et d’assemblage de biomolécules à l’aide du suivi d’une seule molécule et du photoblanchiment sont discutées. Enfin, ce protocole montre comment surveiller l’assemblage nanoporeux de la toxine bactérienne formant des pores Cytolysine A (ClyA) sur des membranes lipidiques encombrées avec une analyse de photoblanchiment à molécule unique. Les codes MATLAB avec des exemples de jeux de données sont également inclus pour effectuer certaines des analyses courantes telles que le suivi des particules, l’extraction du comportement diffusif et le comptage des sous-unités.

Introduction

Les membranes cellulaires sont des systèmes complexes et très encombrés1. L’encombrement moléculaire peut avoir un impact considérable sur la diffusion d’entités liées à la membrane comme les protéines et les lipides 2,3,4. De même, les réactions bimoléculaires sur les membranes lipidiques comme la dimérisation des récepteurs ou l’oligomérisation des complexes membranaires sont influencées par l’encombrement 5,6,7. La nature, la configuration et la concentration des crowders peuvent régir la liaison membranaire, la diffusivité et l’interaction protéine-protéine de plusieurs façons 8,9. Étant donné qu’il est difficile de contrôler l’encombrement des membranes cellulaires et d’interpréter son influence sur les biomolécules intégrées, les chercheurs ont tenté d’établir d’autres systèmes in vitro 10.

Une approche populaire pour les membranes artificielles encombrées consiste à doper les membranes bicouches avec des lipides greffés de polymère (tels que le polyéthylène glycol, PEG)11,12. Au cours de la visualisation de la dynamique des protéines et des lipides sur les bicouches lipidiques soutenues (SLB), ces polymères protègent en outre les composants intégrés à la membrane du substrat sous-jacent chargé négativement (tel que le verre) en soulevant efficacement la bicouche loin du support sous-jacent. En faisant varier la taille et la concentration du polymère, on peut contrôler l’étendue de l’encombrement moléculaire, ainsi que sa séparation du support solide sous-jacent13,14. C’est clairement un avantage par rapport aux bicouches lipidiques supportées sur des substrats solides sans coussins polymères15,16, où les biomolécules transmembranaires peuvent perdre leur activité17,18,19. Plus important encore, cela nous permet de récapituler l’environnement encombré de la membrane cellulaire in vitro, ce qui est essentiel pour de nombreux processus membranaires.

Les polymères greffés en surface sur membranes subissent également des modifications de leur configuration en fonction de leur densité de greffage12. À de faibles concentrations, ils restent dans une configuration enroulée enroulée, connue sous le nom de champignon, au-dessus de la surface de la membrane. Avec l’augmentation de la concentration, ils commencent à interagir et ont tendance à se dérouler et à s’étendre, donnant finalement une formation dense en forme de brosse sur la membrane21. Étant donné que la transition du champignon au régime en brosse est très hétérogène et se manifeste dans des conditions mal caractérisées du polymère, il est important d’utiliser des conditions bien caractérisées pour l’encombrement sur les membranes greffées en polymère. Par rapport à une étude récente20, nous identifions et rapportons des compositions membranaires encombrées qui maintiennent le transport diffusif et l’activité des biomolécules transmembranaires.

Dans ce protocole, nous discutons de la façon de générer des membranes lipidiques PEGylées et fournissons des recommandations pour les densités de PEG qui imitent l’encombrement dans deux régimes différents de configuration de polymère (à savoir, champignon et brosse). Le protocole décrit également la liaison à une seule molécule, le suivi des particules et l’acquisition et l’analyse de données de photoblanchiment pour les molécules intégrées dans ces membranes encombrées. Tout d’abord, nous décrivons les étapes de nettoyage en profondeur, l’assemblage de la chambre d’imagerie et la génération de PEG-SLB. Deuxièmement, nous fournissons des détails pour les expériences de liaison à une seule molécule, de suivi des particules et de photoblanchiment. Troisièmement, nous discutons i) de l’extraction des affinités de liaison relatives, ii) de la caractérisation de la diffusion moléculaire et iii) du comptage des sous-unités dans un assemblage protéique à partir de films de molécules uniques sur la membrane.

Bien que nous ayons caractérisé ce système avec l’imagerie à molécule unique, le protocole est utile pour tous les biophysiciens membranaires intéressés à comprendre l’effet de l’encombrement sur les réactions biomoléculaires sur les membranes lipidiques. Dans l’ensemble, nous présentons un pipeline robuste pour la fabrication de bicouches lipidiques encombrées et soutenues, ainsi que divers tests à molécule unique menés sur eux et les routines d’analyse correspondantes.

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Protocol

1. Nettoyage de la lame et de la lamelle de couverture pour les expériences sur une seule molécule

  1. Avant l’assemblage de la chambre d’imagerie, nettoyez et préparez les lames de couverture et les lames. Percez plusieurs paires de trous sur les lames de verre à l’aide d’une perceuse avec des forets revêtus de diamant (0,5 à 1 mm de diamètre). Si des feuilles d’acrylique sont utilisées, utilisez une découpeuse laser pour faire des trous précis (0,5 mm), comme illustré à la figure 1.
    REMARQUE: Chaque paire de trous agira comme une entrée et une sortie pour l’échange d’écoulement pour une chambre microfluidique individuelle. Un fichier CAO représentatif pour les trous dans une lame acrylique est disponible dans le fichier de codage supplémentaire 1. Les trous percés sur les lames de verre finissent généralement par être 1,5 à 2 fois plus grands que la taille du foret.
  2. Nettoyez les lames et les lamelles de couverture avec du détergent. Rincez-les abondamment à l’eau désionisée. Placez les lames et les lames de couverture dans un pot séparé de coloration de glissière (Coplin) avec de l’eau et soniquez dans un sonicateur de bain pendant 30 min. Pour toutes les étapes de sonication, utilisez un réglage de puissance de 70 W.
  3. Retirez l’eau et remplissez le pot Coplin contenant les lames de verre et les lamelles de couverture avec de l’acétone à ras bord (50-100 ml selon le volume du pot). Dans le cas des feuilles d’acrylique, utilisez le même volume de solution d’acétone prémélangée à 50% (v/v), sinon les lames deviendront givrées. Secouez le pot Coplin pour vous assurer que toutes les lames et les lames de couverture sont complètement immergées dans la solution et sonicate dans un sonicateur de bain pendant 30 min.
  4. Retirez l’acétone et jetez-la dans un récipient à déchets, versez le méthanol dans les pots Coplin (50%, v/v pour les lames acryliques) et soniquez pendant 30 min. L’acétone et le méthanol sont utilisés pour éliminer les particules organiques sur les lames.
  5. Rincez les lames et les lames de couverture avec de grandes quantités d’eau de type 1 et placez-les dans un pot Coplin en verre. Verser 1 M de solution KOH dans le pot et soniquer pendant 1 h. Pour les lames acryliques, utilisez 0,5 M de KOH.
  6. Jetez le KOH dans un conteneur à déchets inorganiques. Rincez le pot avec beaucoup d’eau et placez les pots Coplin dans une hotte pour le traitement du piranha. Ne pas effectuer de traitement piranha pour les lames acryliques; Passez directement à l’étape 1.9.
    ATTENTION: Le traitement Piranha doit être effectué dans une hotte avec des gants appropriés, des lunettes de sécurité et un tablier pour la manipulation des acides. La solution de piranha est un agent oxydant puissant, et elle élimine toutes les particules organiques restantes des lames et des lames de couverture.
  7. Pour préparer la solution de piranha, versez délicatement 2/3 de volume d’acide sulfurique (98%, v/v) dans un bécher en verre et remplissez le reste de peroxyde d’hydrogène (30%, v/v). Mélangez soigneusement la solution avec une tige de verre, versez-la dans le pot Coplin et laissez le pot Coplin dans la hotte pendant au moins 1 h.
  8. Décanter la solution de piranha du pot Coplin dans un récipient jeté pour les déchets acides conservés à l’intérieur de la hotte. Rincez le pot Coplin avec une grande quantité d’eau de type 1.
  9. Sécher les lames et les lames de couverture dans un léger jet d’azote gazeux et les placer dans un pot Coplin propre. Les lames séchées et les lames de couverture sont maintenant prêtes pour le traitement au plasma. Prenez une paire de lames et de lamelles et placez-les dans la machine plasma.
  10. Créez un vide dans la chambre. Tournez le bouton sur la fréquence radio de 8-12 MHz pour générer du plasma dans la chambre. Une lueur violette à l’intérieur de la chambre indiquera la formation d’un plasma dans la chambre.
  11. Effectuer le traitement au plasma pendant 8-10 min. Relâchez doucement le vide après avoir éteint le plasma et passez à l’étape 2 pour assembler la chambre d’imagerie microfluidique.

2. Assemblage de la chambre microfluidique

REMARQUE: La chambre d’imagerie est créée en prenant en sandwich du ruban adhésif double face entre une lamelle de couverture pré-nettoyée et une lame de l’étape précédente, comme décrit ci-dessous.

  1. Assembler les lames et la lamelle de couverture après le traitement au plasma comme illustré à la figure 1. Placez la lame de verre sur un papier de soie propre. Coupez le ruban adhésif double face en bandes de ~2-3 mm de large et placez-les de chaque côté d’une paire de trous sur la lame de verre. Utilisez un embout de pipette pour aplatir la bande ou cela provoquera une fuite d’un canal à l’autre.
    REMARQUE : vous pouvez également couper la bande pour toute la diapositive à l’aide d’un découpeur laser ou automatique (Figure 1).
  2. Placez la lamelle de couverture traitée au plasma sur la lame scotchée pour fermer la chambre. Utilisez un embout de pipette pour appuyer doucement sur la lamelle de couverture sur les zones collées afin de rendre le canal étanche.
  3. Si vous utilisez des lames de verre, scellez les bords à l’aide de résine époxy. Enfin, chaque chambre d’imagerie réalisée à partir d’une lame et d’une lamelle de couverture a une dimension de 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (longueur x largeur x profondeur). Conservez les chambres d’imagerie microfluidique préparées pendant 1 à 2 semaines dans des conditions desséchées (de préférence entre 10 et 25 °C).
    REMARQUE: Pour les rubans découpés au laser utilisés avec des lames acryliques, il n’est pas nécessaire d’utiliser de l’époxy car les bords du ruban forment un joint étanche étanche.

3. Fabrication de bicouches supportées sur substrat de verre par fusion de vésicules

REMARQUE: Des bicouches lipidiques supportées sont générées sur les parois de la chambre d’imagerie par la fusion de vésicules lipidiques préparées avec des lipides PEG dopés.

  1. Prenez un flacon en verre propre, de préférence pré-nettoyé à l’aide d’une solution de piranha. Ajouter une solution de chloroforme de 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC) et de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[amino(polyéthylèneglycol)-2000] (DOPE-PEG2000) à la fraction molaire souhaitée des lipides PEG2000 de telle sorte que la concentration finale après ajout du tampon soit de 3 mM de lipides à l’étape 3.4. Préparer d’autres compositions membranaires de lipides de la même manière.
  2. Sécher le chloroforme du flacon à l’aide d’un léger jet d’azote avec un petit tourbillon afin que les lipides séchés soient uniformément enrobés à la surface du flacon. Mettez le flacon dans un dessiccateur sous vide pendant 1 h. Cela éliminera tout chloroforme résiduel dans le flacon en verre. Ajouter 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et incuber pendant une nuit à 37 °C.
  3. Préparez de petites vésicules unilamellaires (VUS) comme décrit ci-dessous.
    1. Tourbillonner doucement pendant 1-2 minutes après l’incubation pendant la nuit jusqu’à ce que la solution devienne trouble et laiteuse.
    2. Prendre 100 μL de cette solution dans un petit tube à centrifuger de 500 μL et sonifier pendant environ 1 h dans un sonicateur de bain (réglé à une puissance de 70 W). La solution deviendra claire; Sinon, soniquez pendant 30 minutes supplémentaires. Cette étape générera des VUS de 50 à 100 nm de diamètre.
      NOTE: Si vous vous préparez pour la première fois, caractériser les VUS en utilisant la diffusion dynamique de la lumière22,23 (DLS) ou une méthode équivalente.
  4. Ajouter du chlorure de calcium (CaCl2, 3 M stock) aux vésicules soniquées de telle sorte que sa concentration finale soit de 30 mM dans la solution lipidique.
  5. Coupez une pointe de micropipette pour injecter la solution d’échantillon de manière à ce qu’elle s’insère bien dans le trou. Mélanger la solution lipidique et injecter par l’un des trous de la chambre d’imagerie réalisés à l’étape 2. Essuyez l’excès de solution qui sort de la chambre de la sortie avec un tissu propre pour éviter la contamination des canaux adjacents.
  6. Laissez cet ensemble dans une chambre humidifiée pendant 90 min. Préparer une chambre d’humidification en plaçant un mouchoir humide à l’extrémité d’un tube à centrifuger de 50 mL. Placez la glissière latéralement à l’intérieur du tube avec les bouchons de tube fermés. Les vésicules fusionneront et généreront une bicouche uniforme sur la surface du verre.
  7. Lavez soigneusement la chambre avec une quantité abondante de tampon PBS (environ 5 fois le volume de la chambre d’imagerie). Empêcher l’entrée de bulles d’air dans la chambre pendant le lavage, car cela peut générer des défauts dans la membrane.

4. Configuration du microscope et mesures d’imagerie monoparticulaire

REMARQUE : Des expériences sur une seule molécule sont réalisées sur un microscope à fluorescence interne totale24,25,26 (TIRF) basé sur des objectifs (Figure 2). L’imagerie TIRF fournit un meilleur rapport signal/bruit pour l’imagerie à molécule unique, bien que les microscopes à épifluorescence puissent également être utilisés dans certaines conditions (en particulier lorsque les biomolécules fluorescentes peuvent être éliminées de la solution en vrac par lavage). Le type prisme TIRF peut être utilisé mais le type objectif est préférable pour la facilité de mise en place de la microfluidique27. Pour les TIRF de type objectif, un objectif à grande ouverture numérique (grossissement de 100x, habituellement disponible dans le commerce en tant qu’objectif TIRF) est recommandé.

  1. Avant de mener toute expérience sur la mobilité et l’assemblage, aligner le microscope TIRF pour assurer un rapport signal sur bruit optimal en raison de l’éclairage par le champ évanescent. Pendant l’alignement, maintenez la puissance laser faible, entre 100 μW et 1 mW.
    ATTENTION : Des lunettes de sécurité laser doivent être utilisées lors de l’alignement du faisceau laser.
    1. Pour aligner le microscope, préparez un échantillon de billes fluorescentes en les ajoutant dans le canal microfluidique à de faibles concentrations (à ~100 pM) de sorte que les taches fluorescentes provenant de billes simples ne se chevauchent pas dans les images.
    2. Tout d’abord, visualisez les billes en mode épifluorescence. Lorsque l’éclairage est en mode épifluorescence, déplacez l’étage de translation du miroir M5 (le miroir qui réfléchit le laser vers le dichroïque) de sorte que le faisceau sortant de l’objectif se plie jusqu’à ce qu’il soit finalement dans une configuration de réflexion interne totale.
    3. Vérifier si l’éclairage TIR a été obtenu. Lorsque le champ d’évanescence TIR éclaire l’échantillon de billes, vérifier que seules les perles à la surface sont visibles et que les perles flottant librement loin de la surface ne sont pas observées.
  2. Au début de l’expérience, régler la puissance laser au niveau du plan focal arrière de l’objectif sur 5-10 mW pour empêcher la photodestruction (photoblanchiment) des fluorophores.
  3. Gardez la lame sur la scène du microscope et concentrez-vous d’abord sur la membrane nue (sans fluorophores). Habituellement, de petites traces d’impuretés dans les membranes lipidiques sont suffisantes pour ce faire. Facultatif : Incorporez un petit nombre de billes fluorescentes ou de points quantiques (plage sous-picomolaire) à l’étape 3.1, de sorte que seulement deux à cinq particules fluorescentes soient présentes dans le champ de vision pour faciliter l’identification de la mise au point correcte.
  4. Injecter l’échantillon (protéines membranaires, etc.) à l’aide d’une micropipette dans la chambre d’imagerie revêtue de PEG-SLB réalisée à l’étape 3.7.
  5. Pour mesurer la cinétique de liaison d’une seule molécule, utilisez une pompe à seringue pour faire circuler les biomolécules marquées à travers les trous d’entrée dans la chambre microfluidique (Figure 3). Utilisez un débit de 50 à 500 μL/min.
    1. Commencez l’acquisition du film avant d’ajouter la solution dans la chambre d’imagerie. Acquérir > 5 000 images à une fréquence d’images de 25 à 50 images/s en flux continu jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’augmentation de l’apparition de nouvelles taches sur la surface de la membrane (vidéo 1). Pour l’analyse de la cinétique de liaison, suivez les étapes de 6.1.
  6. Pour le suivi d’une seule particule, ajoutez les biomolécules marquées à de faibles concentrations (par rapport à la constante de liaison) au canal à l’aide d’une micropipette. Optimiser la concentration à une densité de <0,1 particules/μm 2 afin que les particules individuelles se croisent rarement (vidéo 2). Cela garantit la haute fidélité des pistes récupérées à partir des jeux de données. Incuber si nécessaire (en cas de mauvaise fixation de la membrane par des biomolécules, ~10 min) dans un environnement humidificateur et laver la chambre avec le tampon.
    REMARQUE: Un lavage est nécessaire au cas où la liaison est mauvaise sur la membrane et que la plupart des molécules fluorescentes restent dans la solution. Sinon, cela peut interférer avec l’imagerie et entraîner un mauvais rapport signal sur bruit.
  7. Pour l’analyse de trajectoire monoparticulaire, acquérir 200-500 images à 10-100 images/s. Maintenez la lentille de l’objectif focalisée sur le plan bicouche avec une dérive minimale de l’étage pendant l’intervalle d’acquisition.

5. Acquisition d’images pour compter les sous-unités dans un assemblage protéique

REMARQUE: L’acquisition d’images pour estimer la stœchiométrie nécessite un blanchiment continu des fluorophores et la détection du nombre d’étapes jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de fluorophores émettant de fluorescence.

  1. Pour mesurer les sous-unités, ajouter la concentration pertinente de biomolécules marquées (exemple: voir résultats; ClyA a été ajouté à une concentration de 25 nM) dans la chambre d’imagerie microfluidique et incuber (laver si nécessaire). Incuber la lame dans une chambre d’humidification à la température souhaitée pendant le temps requis (exemple : 37 °C et 60 min pour l’assemblage de ClyA).
  2. Effectuer l’acquisition d’images pour le photoblanchiment à molécule unique comme décrit ci-dessous.
    1. Lavez la chambre d’imagerie avec un tampon avant l’imagerie (si nécessaire). Placez la lame sur le microscope et ajustez la mise au point pour visualiser les molécules marquées.
    2. Réglez la puissance laser à un niveau auquel le blanchiment du fluorophore se produit progressivement (~1-5 min). Idéalement, pour chaque biomolécule assemblée, gardez le taux de pas de photoblanchiment >10-20 images d’imagerie. Acquérir les images jusqu’à ce que toutes les molécules soient complètement photoblanchies (Vidéo 3).
      REMARQUE: Pour déterminer la durée totale de la trajectoire de photoblanchiment requise, tracez l’intensité moyenne des taches individuelles avec le nombre d’images d’imagerie et déterminez la constante de temps en ajustant une fonction de décroissance exponentielle. La durée totale de l’acquisition peut être fixée à 5-10 fois la constante de temps.
  3. Effectuez une mesure d’assemblage dépendante du temps en commençant l’acquisition de films dès que l’échantillon est introduit dans la chambre et en acquérant de nouveaux films de photoblanchiment à intervalles de temps fixes après la fixation de la membrane à partir de différents segments du PEG-SLB.

6. Analyse des images et des données

  1. Effectuez la liaison et le suivi d’une seule particule comme décrit ci-dessous.
    1. Extraire les trajectoires monoparticules des films acquis ci-dessus, comme illustré à la figure 4. Pour détecter des particules uniques et les suivre, utilisez le package MATLAB, u-track28, ou le plug-in Trackmate29, dans ImageJ, qui fournit également un algorithme robuste de suivi à une seule particule. Suivez les étapes de configuration de l’analyse u-track comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1.
      REMARQUE: Les paramètres critiques pour le suivi d’une seule particule sont l’écart type de la taille des particules (en pixels) et la longueur de fermeture de l’espace. Utilisez 1 et 0, respectivement, pour ces paramètres comme critères les plus stricts pour le suivi.
    2. Pour calculer les constantes de vitesse de liaison, estimez d’abord le nombre de particules se liant à la surface de la membrane au fil du temps. Utilisez le fichier MATLAB binding_SPT (Supplementary Coding File 2) avec le dossier de sortie u-track pour identifier et tracer le nombre de particules apparaissant sur la membrane obtenue à partir de l’étape 6.1. Ajuster la cinétique observée aux modèles cinétiques appropriés (exemple : ajustement exponentiel unique pour déterminer la constante de temps, dont l’inverse peut être attribué à la constante de vitesse apparente)30 pour extraire les constantes de vitesse (voir les résultats, Figure 5).
    3. Le déplacement quadratique moyen (TMS) des particules diffusantes (comme le traceur d’ADN dans les PEG-SLB, Figure 6) indique la nature de la diffusion. Utilisez le package MATLAB MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) avec le dossier de sortie u-track pour obtenir le tracé MSD en fonction du temps de latence (Figure 6B).
    4. Pour identifier les espèces diffusantes hétérogènes, calculez les distributions de déplacement au carré instantané (DSI) comme illustré à la figure 6C. ISD2, défini comme (X t+τ - X t)2 + (Yt+τ− Y t)2, où le temps de latence, τ = 2, est préféré car il réduit le bruit. Filtrez les trajectoires courtes avec moins de trois images pour réduire le bruit.
    5. Utilisez ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) dans MATLAB avec la sortie u-track pour tracer les ISD des particules suivies (Figure 6C).
  2. Effectuer l’analyse du photoblanchiment à molécule unique comme décrit ci-dessous.
    1. Pour estimer la stœchiométrie des complexes membranaires, effectuer une analyse de photoblanchiment sur les intensités temporelles des complexes fluorescents (vidéo 3). Pour cela, appliquez un algorithme de correction de dérive (drift_correct_images, Fichier de codage supplémentaire 2) basé sur l’autocorrélation des images vidéo pour extraire la dérive de traduction. Cela suppose que les structures assemblées sont en grande partie immobiles lors de l’acquisition d’images. Exécutez le package MATLAB Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) pour détecter les traces temporelles d’intensité des particules à partir des films.
    2. Utilisez le code MATLAB Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2) pour effectuer la détection d’étape pour les traces de temps d’intensité. Dans le cas où les particules ne sont pas immobiles, utilisez le package u-track pour extraire l’emplacement des particules en mouvement. Cet ensemble de coordonnées xy peut être mappé aux films bruts pour extraire les valeurs d’intensité de la particule en mouvement lorsqu’elle diffuse latéralement sur la membrane. Utilisez le package MATLAB utrack_Int (Supplementary Coding File 2) avec la sortie de l’analyse u-track pour cette option.
    3. Effectuer une correction pour le marquage incomplet des biomolécules avec des marqueurs fluorophores afin d’estimer la stœchiométrie correcte du complexe protéique. Déterminer l’efficacité du marquage avec un spectrophotomètre UV-VIS en mesurant l’absorption du colorant et des protéines pour estimer la concentration. Calculez l’efficacité du marquage comme le rapport molaire du colorant à la protéine.
      REMARQUE : Certains colorants absorbent également à des longueurs d’onde proches de 280 nm et, par conséquent, cette contribution à l’absorption par le colorant doit être prise en compte lors du calcul de la concentration.
    4. Effectuez une correction binomiale pour tenir compte de l’efficacité de marquage incomplète du fluorophore de la manière suivante en utilisant le code MATLAB Step_correction (Supplementary Coding File 2) avec les données obtenues à partir du comptage des pas à l’étape 6.2.2. Par exemple, pour une toxine formant des pores comme la cytolysine A, qui forme une structure dodécamérique en forme d’anneau, appliquez une correction binomiale en utilisant la formule suivante:
      nkEquation 1
      où Equation 2 = efficacité de l’étiquetage, n = nombre d’étapes de photoblanchiment et s = nombre réel. Utilisez la routine MATLAB Stepcount_immobile pour récupérer les espèces oligomères corrigées. Convertir la fréquence des oligomères (si) en fractions massiques (Figure 7C ; Fichier de codage supplémentaire 2).
      REMARQUE : Un ensemble de fichiers analysés que vous suivez sont inclus dans le fichier de codage supplémentaire 3. Les codes MATLAB du fichier de codage supplémentaire 2 peuvent être exécutés avec ces ensembles de données.

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Representative Results

Surveillance de la liaison de la protéine ClyA sur les membranes PEGylées
Après l’étape 4.5, la cinétique de liaison est estimée en traçant le nombre de particules se liant à la surface de la membrane au fil du temps (vidéo 1). Lorsque la protéine ClyA se lie à une membrane contenant 5 mol% de lipides PEG2000, la densité des particules augmente et atteint la saturation (Figure 5). Une décroissance exponentielle adaptée aux particules liées (cercles cyan) donne la constante de temps (τb) pour la liaison de la membrane (notamment, les points temporels initiaux [cercles rouges] ne sont pas adaptés dans ce cas).

Mobilité du traceur d’ADN sur des membranes encombrées
Nous utilisons couramment des traceurs d’ADN (ADN ancré à la membrane avec un tocophérol), des colorants traceurs lipophiles (par exemple, DiI) ou des protéines membranaires (par exemple, ClyA) pour caractériser la membrane sous encombrement médié par PEG. La diffusion latérale des molécules traceuses marquées (25-100 pM) peut être surveillée en imageant la membrane lors de la liaison des particules. En l’absence de polymère PEG dans la membrane, la plupart des traceurs (en particulier ceux qui s’étendent à l’extérieur de la bicouche) présentent une diffusion restreinte sur les SLB (Figure 6A). Avec de faibles niveaux de PEG2000 dans la membrane (0,5–2 mol%), la bicouche s’éloigne de la surface sous-jacente et les molécules traceuses peuvent diffuser sans contraintes. D’autre part, un confinement extrême est observé à une concentration élevée de PEG (20 mol%), où les molécules de PEG sont dans un régime de brosse dense, avec une variété de comportements affichés entre les deux. Les diagrammes TMS pour ces trois conditions sont présentés à la figure 6B. Sur la base de notre caractérisation des membranes bicouches POPC/DOPE-PEG2000, nous recommandons une fraction DOPE-PEG2000 de 1 à 3 % molaire qui induit un encombrement dans le régime des champignons. Au-dessus de 7,5% mol% PEG2000-lipide, on observe le début du régime de brosse, et des compositions jusqu’à 25 mol% de PEG2000-lipides peuvent être utilisées pour induire l’encombrement et le confinement. Les conditions intermédiaires de 4 à 7% de lipides PEG2000 correspondant à la transition entre les deux régimes sont mal caractérisées et doivent être évitées.

Assemblage de ClyA sur membranes encombrées
Les trajectoires d’intensité des taches individuelles de protéine ClyA limitées par diffraction après incubation sur la membrane encombrée (Figure 7A,B) montrent un grand nombre d’étapes de photoblanchiment distinctes, suggérant la formation de divers intermédiaires d’assemblage31. ClyA, étant une protéine transmembranaire, interagit avec la surface du verre chargée négativement en l’absence de PEG et s’assemblera très mal. À 7,5 mol% de lipides PEG2000, les complexes assemblés ont été mesurés et sont représentés à la figure 7C. Après correction de l’efficacité du marquage (0,9 dans ce cas), la distribution finale des oligomères affiche l’espèce dodécamérique ClyA comme structure dominante, ce qui correspond aux données structurelles32.

Figure 1
Figure 1 : Schéma des étapes de nettoyage et de l’assemblage de la chambre microfluidique. (A) Les lames de verre et les lamelles de couverture sont nettoyées avec une sonication séquentielle dans une solution de détergent, d’acétone, de méthanol, de KOH et de piranha, avec un rinçage multiple à l’eau ultrapure de type 1 entre chaque étape. Les lames et les lames de recouvrement sont ensuite séchées à l’azote gazeux avant traitement au plasma. (B) La chambre d’imagerie microfluidique est ensuite assemblée à l’aide d’un ruban adhésif double face prédécoupé qui lie la lame au couvercle. *Les lames acryliques ne sont pas traitées avec une solution de piranha, et l’acétone, le méthanol et le KOH sont utilisés à une concentration de 50 % (v/v) de celle utilisée pour le nettoyage des lames de couverture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Configuration du microscope TIRF. Une configuration typique de microscope TIRF de type objectif adaptée sur un microscope inversé est montrée avec l’optique essentielle mise en évidence. M1-M5 sont des miroirs pour diriger le faisceau laser. Les lentilles L1 et L2 sont utilisées pour étendre le faisceau laser, et la lentille L3 concentre le faisceau laser sur le plan focal arrière de la lentille de l’objectif. I1 et I2 sont les diaphragmes d’iris utilisés pour aligner le faisceau laser. Un obturateur est utilisé pour contrôler l’éclairage du faisceau laser, essentiel pour éviter le photoblanchiment inutile des molécules de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Configuration de l’écoulement cinétique de liaison à la membrane. Pour mener l’expérience de liaison, un tube mince en PTFE (0,022 en ID x 0,042 en OD) est utilisé pour faire circuler l’échantillon à l’aide d’une pompe à seringue (image non à l’échelle). L’extrémité du tube est connectée à la sortie de la chambre d’imagerie à l’aide d’une pointe de micropipette. La décharge est recueillie dans un petit réservoir microtip branché dans la prise, et le volume introduit est toujours supérieur à 10 fois le volume de la chambre d’imagerie. Figure en médaillon montrant la coupe transversale de la chambre d’imagerie. (image non à l’échelle) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Pipeline pour l’analyse à partir de trajectoires de particules uniques et de films de photoblanchiment. (A) Les films acquis ont été analysés à l’aide de la piste en u dans MATLAB pour obtenir les trajectoires (x, y) et les intensités (i) de chaque particule, image par image. Ces trajectoires ont ensuite été utilisées pour calculer le déplacement carré instantané (DSI), la DSI1 et la DSI2. Les DSI peuvent ensuite être tracées sous forme d’histogrammes pour identifier les espèces mobiles. Alternativement, les diagrammes de déplacement carré moyen (MSD) indiquent si le mouvement est gaussien, confiné ou super-diffusif33,34. L’analyse HMM (Hidden Markov Model35) peut être utilisée pour distinguer différents états diffusifs d’une seule particule. (B) Pour l’analyse du photoblanchiment, les films ont d’abord été corrigés pour la dérive dans le système (si nécessaire), suivis par la détection ou le suivi des particules à l’aide de u-track. Outre l’estimation de la distribution d’intensité23 (et d’autres caractéristiques de particules), les trajectoires d’intensité peuvent être analysées pour le nombre d’étapes de photoblanchiment à l’aide d’algorithmes de recherche de pas36,37,38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Liaison de ClyA aux membranes lipidiques supportées avec 5 mol% DOPE-PEG2000. Une courbe de liaison typique est obtenue après avoir compté le nombre de particules dans chaque image identifiée par u-track. L’imagerie est initiée avant l’écoulement de la protéine ClyA liant la membrane. Une fonction de décroissance exponentielle (ligne noire) adaptée au nombre de particules (cercles cyan) est utilisée pour récupérer la constante de temps pour la liaison de ClyA à la membrane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Mobilité de l’ADN lipophile sur les membranes bicouches PEG-lipides. (A) Le schéma du traceur d’ADN lipophile dans la membrane POPC/DOPE-PEG2000 est montré. (B) Les déplacements quadratiques moyens calculés à partir du suivi d’une seule particule pour différents PEG-SLB sont indiqués. Dans 2 mol% DOPE-PEG2000, le traceur ADN présente un comportement brownien pur par rapport à une mobilité entravée en l’absence du polymère (une ligne pointillée est incluse pour référence). D’autre part, le même traceur d’ADN s’écarte de la diffusion brownienne pure, indiquant un mouvement sous-diffusif avec une mobilité réduite en présence de 20 mol% molaire DOPE-PEG2000. (C) La distribution ISD2 pour la diffusion du traceur d’ADN lipophile dans deux membranes lipidiques PEG2000 différentes est comparée à celle des SLB nus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Traces de photoblanchiment et assemblage de ClyA sur les membranes bicouches lipidiques. (A,B) Des traces temporelles représentatives montrent des étapes de photoblanchiment du complexe de nanopores ClyA détectées à l’étape 6.2.1. pour un complexe ClyA assemblé avec 7 et 5 étapes, respectivement. (C) La distribution par étapes de photoblanchiment (gris) pour ClyA (25 nM) incubée sur 64,7% POPC: 27,8% Cholestérol: membrane DOPE-PEG2000 à 7,5% pendant 60 min à 37 °C est montrée. Après correction de l’efficacité incomplète du marquage, la fraction massique estimée de diverses espèces oligomères (magenta) est montrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1: Liaison de ClyA sur la membrane. Surveillance de la liaison de la protéine ClyA marquée Cy3 à la membrane SLB contenant 5 % en mole de DOPE-PEG2000. Les particules liées sont détectées (cercles cyan) par u-track, et les traces sont tracées pour cinq positions ultérieures dans leur trajectoire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Diffusion d’un traceur d’ADN sur la membrane PEG à 2 mol%. Un film pour l’ADN marqué Cy3 ancré à la membrane lipidique via le tocophérol dans la membrane PEG2000 à 2 % molaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3: Film de photoblanchiment. Un film d’oligomères assemblés de molécules ClyA marquées au Cy3 sur la membrane contenant 7,5 % mol de DOPE-PEG2000. Des complexes plus importants sont évidents à partir des intensités plusieurs fois plus élevées par rapport à une seule protéine, ainsi que des multiples étapes de photoblanchiment lorsque l’intensité des particules est observée au fil du temps sous éclairage continu. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Fichier supplémentaire 1 : Informations sur l’utilisation de u-track et des différents codes MATLAB à l’étape 6. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 1 : Un fichier de conception assistée par ordinateur (CAO) représentatif pour faire des trous dans la lame acrylique et du ruban de découpe pour l’ensemble de la lame. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichiers de codage supplémentaires 2 : dossier compressé contenant les codes MATLAB associés nécessaires à l’analyse des images et des données à l’étape 6. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichiers de codage supplémentaires 3 : exemples de données pour l’analyse d’images et de données à l’étape 6. Les codes MATLAB sont également disponibles sur https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Ici, nous démontrons des expériences sur une seule molécule sur des bicouches lipidiques soutenues (SLB) qui manifestent un environnement encombré pour les biomolécules intégrées dans la membrane. L’environnement surpeuplé génère un effet de volume exclu, conduisant à l’amélioration des réactions biomoléculaires 1,2,39,40. Pour le système PEG-lipide, où le polymère occupe principalement le volume en dehors de la bicouche, cet effet est particulièrement prononcé pour les espèces moléculaires avec de grands domaines ecto. Par conséquent, par rapport aux colorants lipophiles, la diffusion d’une grande molécule hydrophile intégrée dans la membrane, telle que les récepteurs, les glycoprotéines et les glycolipides, peut être considérablement réduite. En utilisant l’ADN traceur fluorescent ancré à la membrane via le tocophérol (Figure 5), nous pouvons identifier de tels effets d’encombrement.

Par ailleurs, la présence de PEG dans la notice inférieure soulève également le SLB et réduit l’interaction des biomolécules avec le substratde support 14,41. Habituellement, la surface chargée négativement de la surface du verre d’imagerie entrave souvent la mobilité et les réactions moléculaires. Par conséquent, l’utilisation de lipides PEG pour soulever la membrane loin du verre est avantageuse même dans le but de l’encombrement. Cependant, il faut prendre soin d’identifier les régimes de concentration qui ne manifestent pas d’encombrement moléculaire dans ces cas. Pour les protéines étendant des domaines plus grands en dehors de la bicouche, l’utilisation d’un PEG-lipide de poids moléculaire plus élevé tel que PEG5000 pourrait être nécessaire42.

Quelques points clés sont essentiels à l’imagerie monomoléculaire sur les systèmes SLB. Un nettoyage rigoureux des lames et des lames de couverture est essentiel dans les expériences sur une seule molécule (étape 1). L’imagerie d’une surface avec des impuretés entraînera des défauts dans la membrane lipidique. Cela peut entraîner des taches de biomolécules marquées par fluorescence à la surface de la membrane. La couverture et l’uniformité du SLB formé peuvent être vérifiées dans une préparation séparée en dopant la bicouche avec un colorant lipidique (DiI ou Lissamine Rhodamine DOPE) et en l’imageant au microscope à fluorescence. L’analyse FRAP peut également être utilisée pour comparer le comportement diffusif43,44.

Pour les expériences de liaison à membrane (étape 4), la configuration de l’écoulement avec le tube doit être amorcée avec un tampon pour empêcher l’entrée de bulles d’air dans la chambre. Des débits plus élevés ou la présence de bulles d’air rompront la membrane et les molécules se lieront directement à la lamelle de couverture. L’acquisition d’images doit commencer avant le début de l’écoulement, car certaines molécules diffusent à partir du tube et se lient à la membrane. La focalisation de l’objectif sur la bicouche pendant l’imagerie peut être facilitée par le dopage de la bicouche à faible concentration avec des nanoparticules d’or, des points quantiques ou des billes fluorescentes.

Pour les expériences de suivi d’une seule particule, le nombre de particules sur la membrane doit être contrôlé pour éviter un scénario où le suivi est difficile en raison d’un chevauchement excessif des trajectoires des particules. Un autre facteur important à considérer lors de l’imagerie est la puissance laser. Une puissance laser élevée photoblanchira rapidement les fluorophores, tandis qu’une faible intensité et les taux d’acquisition d’image lents correspondants provoqueront un flou. La puissance laser optimale devrait donner une longueur de trajectoire significative (au moins >5 en moyenne) tout en maintenant des images symétriques et proches de la diffraction limitée des particules. Un système de piégeage de l’oxygène peut également être utilisé pour prolonger le photoblanchiment des fluorophores45. Une limitation de l’analyse de photoblanchiment présentée ici se pose 37,46 dans le cas de grands assemblages moléculaires (~ supérieurs à 20 sous-unités), tels que le complexe de pores nucléaires47. Dans de tels cas, une approche bayésienne peut être utilisée pour déduire la population sous-unitaire48,49,50.

Le marquage des biomolécules avec des fluorophores dans la plupart des cas n’est pas complet51. Cela pose un défi pour compter les sous-unités dans un groupe avec des espèces non étiquetées. Une correction binomiale de l’efficacité de marquage inférieure à la normale est généralement une approximation raisonnable lorsque la stœchiométrie de l’espèce moléculaire est fixe. Dans de nombreux cas, les espèces oligomères peuvent être hétérogènes ou changer dynamiquement, comme dans un processus d’oligomérisation, nécessitant le développement de nouveaux outils pour extraire les distributions sous-jacentes des données de photoblanchiment.

Dans l’ensemble, ce protocole fournit un pipeline pour générer des PEG-SLB, avec des recommandations pour les conditions d’utilisation, effectuer et analyser la liaison à une seule molécule, et suivre et effectuer une analyse de photoblanchiment pour les biomolécules membranaires.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le professeur Benjamin Schuler pour avoir partagé le plasmide d’expression de la protéine ClyA. Ce travail a été soutenu par Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 - 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons

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Diffusion et assemblage d’une molécule unique sur des membranes lipidiques encombrées de polymères
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