Summary
Здесь представлен протокол для выполнения и анализа связывания, подвижности и сборки отдельных молекул на искусственных переполненных липидных мембранах с использованием одномолекулярной флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (smTIRF).
Abstract
Клеточные мембраны представляют собой сильно переполненные среды для биомолекулярных реакций и передачи сигналов. Тем не менее, большинство экспериментов in vitro , исследующих взаимодействие белка с липидами, используют голые двухслойные мембраны. Таким системам не хватает сложностей скученности мембранными белками и гликанами и исключают связанные с этим объемные эффекты, встречающиеся на поверхностях клеточных мембран. Кроме того, отрицательно заряженная стеклянная поверхность, на которой образуются липидные бислои, препятствует свободной диффузии трансмембранных биомолекул. Здесь мы представляем хорошо охарактеризованную полимерно-липидную мембрану в качестве имитации для переполненных липидных мембран. Этот протокол использует полиэтиленгликоль (ПЭГ)-конъюгированные липиды в качестве обобщенного подхода к включению краудеров в поддерживаемый липидный бислой (SLB). Сначала представлена процедура очистки микроскопических слайдов и обложек для выполнения одномолекулярных экспериментов. Далее обсуждаются методы характеристики PEG-SLB и проведения одномолекулярных экспериментов по связыванию, диффузии и сборке биомолекул с использованием одномолекулярного отслеживания и фотоотбеливания. Наконец, этот протокол демонстрирует, как контролировать нанопоровую сборку бактериального порообразующего токсина Cytolysin A (ClyA) на переполненных липидных мембранах с помощью одномолекулярного анализа фотоотбеливания. Коды MATLAB с примерами наборов данных также включены для выполнения некоторых общих анализов, таких как отслеживание частиц, извлечение диффузионного поведения и подсчет субъединиц.
Introduction
Клеточные мембраны представляют собой сильно переполненные и сложные системы1. Молекулярная скученность может оказывать значительное влияние на диффузию связанных с мембраной объектов, таких как белок и липиды 2,3,4. Аналогичным образом, на бимолекулярные реакции на липидных мембранах, такие как димеризация рецепторов или олигомеризация мембранных комплексов, влияют скученность 5,6,7. Природа, конфигурация и концентрация краудеров могут управлять мембранным связыванием, диффузионной активностью и белково-белковым взаимодействием несколькими способами 8,9. Поскольку контроль скученности мембран на клеточных мембранах и интерпретация ее влияния на встроенные биомолекулы является сложной задачей, исследователи попытались создать альтернативные системы in vitro 10.
Популярным подходом для искусственных переполненных мембран является легирование двухслойных мембран полимерными (такими как полиэтиленгликоль, ПЭГ) привитыми липидами11,12. Во время визуализации динамики белка и липидов на поддерживаемых липидных бислоях (SLB) эти полимеры дополнительно защищают мембранные компоненты от лежащей в основе отрицательно заряженной подложки (такой как стекло), эффективно поднимая бислой от основной опоры. Изменяя размер и концентрацию полимера, можно контролировать степень молекулярной скученности, а также ее отделение от лежащей в основе твердой опоры13,14. Это явно преимущество перед липидными бислоями, поддерживаемыми на твердых подложках без полимерных подушек15,16, где трансмембранные биомолекулы могут терять свою активность 17,18,19. Что еще более важно, это позволяет нам рекапитулировать переполненную среду клеточной мембраны in vitro, что имеет решающее значение для многих мембранных процессов.
Поверхностно-привитые полимеры на мембранах также претерпевают изменения в своей конфигурации в зависимости от их плотности прививки12. При низких концентрациях они остаются в энтропически свернутой конфигурации, известной как гриб, над поверхностью мембраны. С увеличением концентрации они начинают взаимодействовать и имеют тенденцию раскручиваться и расширяться, в конечном итоге давая плотное кустарниковое образование на мембране21. Поскольку переход от грибного к кустарниковому режиму отличается высокой неоднородностью и проявляется в плохо охарактеризованных условиях полимера, важно использовать хорошо охарактеризованные условия для скученности на полимерно-привитых мембранах. По сравнению с недавним исследованием20, мы идентифицируем и сообщаем о переполненных мембранных композициях, которые поддерживают диффузный транспорт и активность трансмембранных биомолекул.
В этом протоколе мы обсуждаем, как генерировать PEGylated липидные мембраны и предоставляем рекомендации для плотностей ПЭГ, которые имитируют скученность в двух разных режимах полимерной конфигурации (а именно, гриб и щетка). Протокол также описывает связывание одной молекулы, отслеживание частиц и сбор и анализ данных фотоотбеливания для молекул, встроенных в эти переполненные мембраны. Во-первых, мы описываем этапы тщательной очистки, сборку камеры визуализации и генерацию PEG-SLB. Во-вторых, мы предоставляем подробную информацию для экспериментов по связыванию одной молекулы, отслеживанию частиц и фотоотбеливанию. В-третьих, мы обсуждаем i) извлечение относительных сродств связывания, ii) характеристику молекулярной диффузии и iii) подсчет субъединиц в сборке белка из фильмов отдельных молекул на мембране.
Хотя мы охарактеризовали эту систему с помощью одномолекулярной визуализации, протокол полезен для всех мембранных биофизиков, заинтересованных в понимании влияния скученности на биомолекулярные реакции на липидные мембраны. В целом, мы представляем надежный конвейер для создания переполненных и поддерживаемых липидных бислоев, а также различные одномолекулярные анализы, проведенные на них, и соответствующие процедуры анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Очистка слайда и крышки для одномолекулярных экспериментов
- Перед сборкой камеры визуализации очистите и подготовьте как крышки, так и слайды. Просверлите несколько пар отверстий на стеклянных слайдах с помощью сверлильного станка с алмазным покрытием (диаметром 0,5-1 мм). Если используются акриловые листы, используйте лазерный резак для создания точных отверстий (0,5 мм), как показано на рисунке 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая пара отверстий будет выступать в качестве входного и выходного отверстия для обмена потока для отдельной микрофлюидной камеры. Репрезентативный файл САПР для отверстий в акриловом слайде доступен в дополнительном файле кодирования 1. Отверстия, просверленные на стеклянных горках, обычно оказываются в 1,5-2 раза больше, чем размер сверла. - Очистите слайды и крышки моющим средством. Тщательно промойте их деионизированной водой. Поместите горки и крышки в отдельную банку для окрашивания слайдов (Coplin) с водой и ультразвуком в ультразвуковом аппарате ванны на 30 минут. Для всех этапов обработки ультразвуком используйте настройку мощности 70 Вт.
- Удалите воду и наполните банку Coplin, содержащую стеклянные слайды и крышки, ацетоном до краев (50-100 мл в зависимости от объема банки). В случае акриловых листов используйте тот же объем предварительно смешанного 50% (v/v) раствора ацетона, иначе слайды станут морозными. Встряхните банку Coplin, чтобы убедиться, что все слайды и крышки полностью погружены в раствор, и храните ультразвуком в сонистаторе ванны в течение 30 минут.
- Извлеките ацетон и выбросьте его в контейнер для отходов, налейте метанол в банки Coplin (50%, v/v для акриловых слайдов) и храните ультразвуком в течение 30 минут. Как ацетон, так и метанол используются для удаления органических частиц на слайдах.
- Промойте горки и крышки обильным количеством воды типа 1 и поместите их в стеклянную банку Coplin. Вылейте 1 М KOH раствор в банку и храните ультразвуком в течение 1 ч. Для акриловых горок используйте 0,5 М KOH.
- Выбросьте KOH в контейнер для неорганических отходов. Промойте банку большим количеством воды и поместите банки Coplin в вытяжку для обработки пираньей. Не выполняйте обработку пираньей для акриловых горок; непосредственно перейдите к шагу 1.9.
ВНИМАНИЕ: Лечение пираньей должно проводиться в вытяжном шкафу с соответствующими перчатками, защитными очками и фартуком для работы с кислотами. Раствор пираньи является сильным окислителем, и он удаляет любые оставшиеся органические частицы со слайдов и обложек. - Для приготовления раствора пираньи аккуратно насыпьте 2/3 объема серной кислоты (98%, v/v) в стеклянный стакан и заполните остальное перекисью водорода (30%, v/v). Тщательно смешайте раствор со стеклянным стержнем, налейте его в банку Coplin и оставьте банку Coplin в вытяжном шкафу не менее чем на 1 ч.
- Раствор пираньи из банки Coplin можно поместить в контейнер для выбрасывания кислотных отходов, хранящихся внутри вытяжного шкафа. Промойте банку Коплина обильным количеством воды типа 1.
- Высушите горки и крышки в нежной струе газообразного азота и поместите их в чистую банку Coplin. Высушенные горки и крышки теперь готовы к плазменной обработке. Возьмите пару слайдов и обложек и поместите их в плазменную машину.
- Создайте вакуум в камере. Поверните ручку на радиочастоту 8-12 МГц для генерации плазмы в камере. Фиолетовое свечение внутри камеры будет указывать на образование плазмы в камере.
- Проводят плазменную обработку в течение 8-10 мин. Осторожно освободите вакуум после выключения плазмы и перейдите к этапу 2 для сборки микрофлюидной камеры визуализации.
2. Сборка микрофлюидной камеры
ПРИМЕЧАНИЕ: Камера визуализации создается путем сэндвичинга двусторонней ленты между предварительно очищенным чехлом и слайдом с предыдущего этапа, как описано ниже.
- Соберите слайды и крышки после плазменной обработки, как показано на рисунке 1. Поместите стеклянный слайд на чистую папиросную бумагу. Разрежьте двухстороннюю ленту на полоски шириной ~2-3 мм и поместите их с каждой стороны пары отверстий на стеклянной горке. Используйте наконечник пипетки, чтобы сгладить ленту, иначе это приведет к утечке из одного канала в другой.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, вырежьте ленту для всего слайда с помощью лазерного или автоматизированного плоттерного резака (рисунок 1). - Поместите обработанную плазмой крышку на заклеенный затвор, чтобы закрыть камеру. Используйте наконечник пипетки, чтобы осторожно надавить крышкой на заклеенные области, чтобы сделать канал водонепроницаемым.
- При использовании стеклянных слайдов запечатайте края с помощью эпоксидной смолы. Наконец, каждая камера визуализации, изготовленная из слайда и крышки, имеет размеры 10 мм x 2 мм x 0,1 мм (длина x ширина x глубина). Хранить подготовленные микрофлюидные камеры визуализации в течение 1-2 недель в высушенных условиях (предпочтительно между 10-25 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лент лазерной резки, используемых с акриловыми слайдами, нет необходимости использовать эпоксидную смолу, поскольку края ленты образуют плотное герметичное уплотнение.
3. Изготовление опорных бислоев на стеклянной подложке методом плавления везикул
ПРИМЕЧАНИЕ: Переполненные поддерживаемые липидные бислои образуются на стенках камеры визуализации путем слияния липидных везикул, полученных с легированными PEG-липидами.
- Возьмите чистый стеклянный флакон, желательно предварительно очищенный с помощью раствора пираньи. Добавляют раствор хлороформа 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолина (POPC) и 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000] (DOPE-PEG2000) на желаемую мольную фракцию липидов PEG2000 таким образом, чтобы конечная концентрация после добавления буфера составляла 3 мМ липидов на стадии 3.4. Аналогичным образом готовят другие мембранные композиции липидов.
- Высушите хлороформ из флакона с помощью мягкой струи азота с небольшим вихрем так, чтобы высушенные липиды равномерно покрывались на поверхности флакона. Поместите флакон в вакуумный осушитель на 1 ч. Это удалит любой остаточный хлороформ в стеклянном флаконе. Добавьте 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
- Приготовьте небольшие одноламеллярные везикулы (SUV), как описано ниже.
- Осторожно вихрь в течение 1-2 мин после ночной инкубации до тех пор, пока раствор не станет мутным и молочным.
- Возьмите 100 мкл этого раствора в небольшой центрифужной трубке объемом 500 мкл и соникуйте в течение примерно 1 ч в ультразвуковом аппарате для ванны (устанавливается при мощности 70 Вт). Решение станет ясным; если нет, то настаивайте ультразвуком в течение дополнительных 30 минут. На этом этапе будут генерироваться внедорожники диаметром 50-100 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке впервые охарактеризуйте внедорожники с помощью динамического рассеяния света22,23 (DLS) или эквивалентного метода.
- Добавьте хлорид кальция (CaCl2, 3 M штучки) в обработанные ультразвуком везикулы таким образом, чтобы его конечная концентрация в растворе липидов составляла 30 мМ.
- Вырежьте наконечник микропипетки для введения раствора образца так, чтобы он плотно прилегал к отверстию. Смешайте липидный раствор и введите через одно из отверстий в камере визуализации, сделанных на этапе 2. Протрите лишний раствор, выходящий из камеры из розетки, чистой тканью, чтобы предотвратить загрязнение соседних каналов.
- Оставьте этот узел в увлажненной камере на 90 минут. Подготовьте увлажняющую камеру, поместив влажную ткань на конец трубки центрифуги объемом 50 мл. Поместите затвор боком внутрь трубки с закрытыми крышками труб. Везикулы будут сливаться и генерировать однородный бислой на поверхности стекла.
- Тщательно промыть камеру обильным количеством буфера PBS (примерно в 5 раз больше объема камеры визуализации). Предотвратите попадание пузырьков воздуха в камеру во время промывки, так как это может привести к дефектам мембраны.
4. Установка микроскопа и измерения одночастичной визуализации
ПРИМЕЧАНИЕ: Одномолекулярные эксперименты проводятся на объективной установке флуоресцентного микроскопа с полной внутренней отражением 24,25,26 (TIRF) (рисунок 2). Визуализация TIRF обеспечивает лучшее соотношение сигнал/шум для одномолекулярной визуализации, хотя эпифлуоресцентные микроскопы также могут использоваться при определенных условиях (особенно когда флуоресцентные биомолекулы могут быть удалены из объемного раствора путем промывки). Можно использовать TIRF призменного типа, но объектив предпочтительнее для удобства настройки микрофлюидики27. Для TIRF типа объектива рекомендуется объектив с высокой числовой апертурой (100-кратное увеличение, обычно коммерчески доступное в качестве цели TIRF).
- Перед проведением любого эксперимента по мобильности и сборке выровняйте микроскоп TIRF, чтобы обеспечить оптимальное соотношение сигнал/шум за счет освещения испаряющимся полем. Во время выравнивания держите мощность лазера на низком уровне, от 100 мкВт до 1 мВт.
ВНИМАНИЕ: Лазерные защитные очки следует использовать во время выравнивания лазерного луча.- Чтобы выровнять микроскоп, подготовьте образец флуоресцентных шариков, добавив их в микрофлюидный канал при низких концентрациях (при ~100 пМ), чтобы флуоресцентные пятна от одиночных шариков не перекрывались на изображениях.
- Во-первых, визуализируйте бусины в режиме эпифлуоресценции. Пока освещение находится в режиме эпифлуоресценции, переместите ступень зеркального перевода M5 (зеркало, которое отражает лазер на дихроику) таким образом, чтобы луч, выходящий из объектива, изгибался до тех пор, пока он в конечном итоге не окажется в полной конфигурации внутреннего отражения.
- Проверить, достигнуто ли освещение МДП. Когда испаряющееся поле МДП освещает образец бусины, убедитесь, что видны только бусины на поверхности и не наблюдаются свободно плавающие бусины вдали от поверхности.
- В начале эксперимента установили мощность лазера в задней фокальной плоскости объектива на 5-10 мВт для предотвращения фоторазрушения (фотоотбеливания) флуорофоров.
- Держите слайд на ступени микроскопа и сначала сосредоточьтесь на голой мембране (без флуорофоров). Обычно для этого достаточно небольших следов примесей в липидных мембранах. Необязательно: Включите небольшое количество флуоресцентных шариков или квантовых точек (субпикомолярный диапазон) на этапе 3.1, так что только от двух до пяти флуоресцентных частиц присутствуют в поле зрения, чтобы облегчить идентификацию правильного фокуса.
- Введите образец (мембранные белки и т.д.) с помощью микропипетки в камеру визуализации с покрытием PEG-SLB, изготовленную на этапе 3.7.
- Для измерения кинетики связывания с одной молекулой используйте шприцевой насос для пропуска меченых биомолекул через входные отверстия в микрофлюидную камеру (рисунок 3). Используйте расход 50-500 мкл/мин.
- Начните сбор пленки, прежде чем добавлять решение в камеру обработки изображений. Получайте >5000 кадров со скоростью кадров 25-50 кадров/с при непрерывном потоке до тех пор, пока не произойдет дальнейшего увеличения появления новых пятен на поверхности мембраны (Видео 1). Для анализа кинетики связывания выполните действия, описанные в пункте 6.1.
- Для отслеживания одиночных частиц добавьте меченые биомолекулы в низких концентрациях (по сравнению с константой связывания) в канал с помощью микропипетки. Оптимизируйте концентрацию до плотности <0,1 частицы/мкм2 , чтобы отдельные частицы редко пересекались (Видео 2). Это обеспечивает высокую точность треков, восстановленных из наборов данных. Инкубировать при необходимости (в случае плохого связывания мембраны биомолекулами, ~10 мин) в увлажняющей среде и промыть камеру буфером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка необходима в случае, если связывание плохое на мембране и большинство флуоресцентных молекул остаются в растворе. В противном случае это может помешать визуализации и привести к плохому соотношению сигнал/шум. - Для анализа траектории одной частицы получите 200-500 кадров со скоростью 10-100 кадров/с. Поддерживайте фокусировку объектива на двухслойной плоскости с минимальным дрейфом ступени в течение интервала захвата.
5. Получение изображения для подсчета субъединиц в белковой сборке
ПРИМЕЧАНИЕ: Получение изображения для оценки стехиометрии требует непрерывного отбеливания флуорофоров и определения количества шагов до тех пор, пока флуорофоры больше не будут излучать флуоресценцию.
- Для измерения субъединиц добавить соответствующую концентрацию меченых биомолекул (пример: см. результаты; ClyA добавляли при концентрации 25 нМ) в микрофлюидную камеру визуализации и инкубат (промывали при необходимости). Инкубируйте затвор в увлажняющей камере при желаемой температуре в течение необходимого количества времени (пример: 37 °C и 60 мин для сборки ClyA).
- Выполняйте получение изображений для одномолекулярного фотоотбеливания, как описано ниже.
- Промывайте камеру визуализации буфером перед визуализацией (при необходимости). Поместите слайд на микроскоп и отрегулируйте фокус, чтобы визуализировать меченые молекулы.
- Установите мощность лазера на уровень, при котором отбеливание флуорофора происходит постепенно (~1-5 мин). В идеале, для каждой собранной биомолекулы, держите скорость шага фотоотбеливания >10-20 кадров изображения друг от друга. Получайте изображения до тех пор, пока все молекулы не будут полностью фотоотбелены (Видео 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить общую продолжительность требуемой траектории фотоотбеливания, нанесите среднюю интенсивность отдельных пятен с количеством кадров изображения и определите постоянную времени путем установки экспоненциальной функции распада. Общая продолжительность приобретения может быть установлена в 5-10 раз больше постоянной времени.
- Выполните зависящее от времени измерение сборки, начав сбор пленки, как только образец вводится в камеру, и приобретая новые пленки фотоотбеливания через фиксированные промежутки времени после связывания мембраны из разных сегментов PEG-SLB.
6. Анализ изображений и данных
- Выполните связывание и отслеживание одиночных частиц, как описано ниже.
- Извлеките траектории одиночных частиц из фильмов, полученных выше, как показано на рисунке 4. Для обнаружения отдельных частиц и их отслеживания используйте пакет MATLAB, u-track28 или Trackmate29, плагин в ImageJ, который также обеспечивает надежный алгоритм отслеживания одной частицы. Выполните действия по настройке анализа u-track, как показано в дополнительном файле 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Критическими параметрами для отслеживания одной частицы являются стандартное отклонение размера частицы (в пикселях) и длина закрытия зазора. Используйте 1 и 0 соответственно для этих параметров в качестве наиболее строгих критериев отслеживания. - Чтобы рассчитать константы скорости связывания, сначала оцените количество частиц, связывающихся с поверхностью мембраны с течением времени. Используйте файл MATLAB binding_SPT (Дополнительный файл кодирования 2) с выходной папкой u-track для идентификации и построения графика количества частиц, появляющихся на мембране, полученной из шага 6.1. Подгонка наблюдаемой кинетики к соответствующим кинетическим моделям (пример: одинарная экспоненциальная подгонка для определения константы времени, обратная из которой может быть присвоена кажущейся константе скорости)30 для извлечения констант скорости (см. результаты, рисунок 5).
- Среднеквадратичное смещение (MSD) диффузионных частиц (таких как индикатор ДНК в PEG-SLB, рисунок 6) указывает на природу диффузии. Используйте пакет MATLAB MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) с выходной папкой u-track для получения графика MSD в зависимости от времени задержки (рисунок 6B).
- Чтобы идентифицировать гетерогенные диффузные виды, рассчитайте распределения мгновенного квадратного смещения (ISD), как показано на рисунке 6C. ISD2, определяемый как (Xt+τ - Xt)2 + (Yt+τ− Yt)2, где время задержки, τ = 2, является предпочтительным, поскольку оно уменьшает шум. Отфильтруйте короткие траектории с менее чем тремя кадрами, чтобы уменьшить шум.
- Используйте ISD_analyzer (Файл дополнительного кодирования 2) в MATLAB с u-трековым выходом для построения ISD отслеживаемых частиц (рисунок 6C).
- Извлеките траектории одиночных частиц из фильмов, полученных выше, как показано на рисунке 4. Для обнаружения отдельных частиц и их отслеживания используйте пакет MATLAB, u-track28 или Trackmate29, плагин в ImageJ, который также обеспечивает надежный алгоритм отслеживания одной частицы. Выполните действия по настройке анализа u-track, как показано в дополнительном файле 1.
- Выполните одномолекулярный анализ фотоотбеливания, как описано ниже.
- Для оценки стехиометрии мембранных комплексов выполняют фотоотбеливающий анализ зависящих от времени интенсивностей флуоресцентных комплексов (Видео 3). Для этого примените алгоритм коррекции дрейфа (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) на основе автокорреляции кадров фильма для извлечения дрейфа перевода. Это предполагает, что собранные структуры в значительной степени неподвижны во время получения изображения. Запустите пакет MATLAB Extract_traces_1C (дополнительный файл кодирования 2), чтобы обнаружить следы времени интенсивности частиц из фильмов.
- Используйте Stepcount_immobile кода MATLAB (файл дополнительного кодирования 2) для выполнения определения шага для трассировки времени интенсивности. В случае, если частицы не неподвижны, используйте пакет u-track для извлечения местоположения движущихся частиц. Этот набор координат xy может быть сопоставлен с необработанными фильмами для извлечения значений интенсивности движущейся частицы, когда она диффундирует поперек на мембране. Используйте пакет MATLAB utrack_Int (Файл дополнительного кодирования 2) с выходными данными анализа u-track для этого параметра.
- Выполните коррекцию неполной маркировки биомолекул флуорофорными метками для оценки правильной стехиометрии белкового комплекса. Определите эффективность маркировки с помощью спектрофотометра UV-VIS путем измерения поглощения красителя и белка для оценки концентрации. Рассчитайте эффективность маркировки как молярное отношение красителя к белку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые красители также поглощают на длинах волн, близких к 280 нм, и, следовательно, этот вклад поглощения красителем должен быть учтен при расчете концентрации. - Выполните биномиальную коррекцию для учета неполной эффективности маркировки флуорофора следующим образом, используя код MATLAB Step_correction (Файл дополнительного кодирования 2) с данными, полученными в результате подсчета шагов на шаге 6.2.2. Например, для порообразующего токсина, такого как цитолизин А, который образует додекамерную кольцеобразную структуру, применяют биномиальную коррекцию по следующей формуле:
нк
где
= эффективность маркировки, n = количество шагов фотоотбеливания, а s = фактические подсчеты. Используйте рутинную Stepcount_immobile MATLAB для восстановления скорректированных олигомерных видов. Преобразование частоты олигомеров (si) в массовые доли (рисунок 7C; Дополнительный кодовый файл 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Набор анализируемых вами файлов включен в Файл дополнительного кодирования 3. Коды MATLAB в файле дополнительного кодирования 2 могут быть запущены с этими наборами данных.
= эффективность маркировки, n = количество шагов фотоотбеливания, а s = фактические подсчеты. Используйте рутинную Stepcount_immobile MATLAB для восстановления скорректированных олигомерных видов. Преобразование частоты олигомеров (si) в массовые доли (рисунок 7C; Дополнительный кодовый файл 2).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мониторинг связывания белка ClyA на peGylated мембранах
После этапа 4.5 кинетику связывания оценивают путем построения графика количества частиц, связывающихся с поверхностью мембраны с течением времени (видео 1). Поскольку белок ClyA связывается с мембраной с 5 моль% липидов PEG2000, плотность частиц увеличивается и достигает насыщения (рисунок 5). Экспоненциальный распад, прилегающий к связанным частицам (голубым кругам), дает постоянную времени (τb) для связывания мембраны (примечательно, что начальные временные точки [красные круги] в этом случае не подходят).
Подвижность индикатора ДНК на переполненных мембранах
Мы обычно используем трассеры ДНК (ДНК, закрепленная на мембране с помощью токоферола), липофильные индикаторные красители (например, DiI) или мембранные белки (например, ClyA) для характеристики мембраны при ПЭГ-опосредованной скученности. Латеральную диффузию меченых молекул индикатора (25–100 пМ) можно контролировать путем визуализации мембраны при связывании частиц. При отсутствии какого-либо полимера ПЭГ в мембране большинство индикаторов (особенно тех, которые выходят за пределы бислоя) демонстрируют ограниченную диффузию на SLB (рисунок 6A). При небольших уровнях PEG2000 в мембране (0,5-2 моль) бислой поднимается от подлежащей поверхности, и молекулы индикатора могут диффундировать без ограничений. С другой стороны, экстремальное удержание наблюдается при высокой концентрации ПЭГ (20 моль%), где молекулы ПЭГ находятся в плотном режиме щетки, с различным поведением, отображаемым между ними. Графики MSD для этих трех условий показаны на рисунке 6B. Основываясь на нашей характеристике двухслойных мембран POPC /DOPE-PEG2000, мы рекомендуем фракцию 1-3 моль% DOPE-PEG2000, которая вызывает скученность в грибном режиме. Выше 7,5 моль% PEG2000-липидов мы наблюдаем начало режима кисти, и композиции до 25 моль% PEG2000-липидов могут быть использованы для индуцирования скученности и удержания. Промежуточные 4-7% PEG2000-липидные состояния, соответствующие переходу между двумя режимами, плохо характеризуются и их следует избегать.
Сборка ClyA на переполненных мембранах
Траектории интенсивности отдельных дифракционно-ограниченных пятен белка ClyA после инкубации на переполненной мембране (фиг.7A,B) отображают большое количество отчетливых стадий фотоотбеливания, предполагающих образование различных сборочных промежуточных продуктов31. ClyA, являясь трансмембранным белком, взаимодействует с отрицательно заряженной стеклянной поверхностью в отсутствие ПЭГ и будет собираться очень плохо. При 7,5 моль% липидов PEG2000 собранные комплексы были измерены и построены на рисунке 7C. После корректировки на эффективность маркировки (0,9 в данном случае) конечное распределение олигомеров отображает додекамерный вид ClyA в качестве доминирующей структуры, согласующейся со структурными данными32.
Рисунок 1: Схема этапов очистки и сборки микрофлюидной камеры. (A) Стеклянные слайды и крышки очищаются последовательным ультразвуком в моющем средстве, ацетоне, метаноле, KOH и растворе пираньи с многократным промывкой сверхчистой водой типа 1 между каждым этапом. Затем слайды и крышки сушат газообразным азотом перед плазменной обработкой. (B) Затем микрофлюидная камера визуализации собирается с использованием предварительно вырезанной двусторонней клейкой ленты, которая связывает слайд с крышкой. * Акриловые слайды не обрабатывают раствором пираньи, а ацетон, метанол и KOH используются в концентрации 50% (v / v) от той, которая используется для очистки крышки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка микроскопа TIRF. Типичная установка микроскопа TIRF объективного типа, адаптированная на инвертированном микроскопе, показана с выделенной основной оптикой. M1–M5 – это зеркала для управления лазерным лучом. Линзы L1 и L2 используются для расширения лазерного луча, а объектив L3 фокусирует лазерный луч на задней фокальной плоскости объектива. I1 и I2 - это диафрагмы радужной оболочки глаза, используемые для выравнивания лазерного луча. Затвор используется для управления освещением лазерного луча, что имеет решающее значение для предотвращения ненужного фотоотбеливания флуоресцентных молекул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Настройка потока кинетики мембранного связывания. Для проведения эксперимента по связыванию для прокачки образца с помощью шприцевого насоса используется тонкая трубка из PTFE (0,022 в ID x 0,042 в OD). Конец трубки соединен с выпускным отверстием камеры визуализации с помощью наконечника микропипетки. Выброс собирается в небольшой резервуар микроконечного наконечника, подключенный к выпускному отверстию, и введенный объем всегда превышает объем камеры визуализации. Рисунок вставки, показывающий поперечное сечение камеры визуализации. (изображение не масштабируется) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Конвейер для анализа траекторий одиночных частиц и фотоотбеливающих фильмов. (A) Полученные фильмы были проанализированы с использованием u-трека в MATLAB для получения траекторий как (x, y), так и интенсивности (i) каждой частицы, кадр за кадром. Эти траектории затем использовались для расчета мгновенного квадратного смещения (ISD), ISD1 и ISD2. Затем ISD могут быть нанесены на график в виде гистограмм для идентификации подвижных видов. С другой стороны, графики среднего квадратного смещения (MSD) сообщают, является ли движение гауссовским, ограниченным или супердиффузным33,34. Анализ скрытой марковской модели35 (HMM) может быть использован для различения различных диффузных состояний одной частицы. (B) Для анализа фотоотбеливания фильмы сначала корректировались на дрейф в системе (при необходимости), а затем обнаружение или отслеживание частиц с использованием u-трека. Помимо оценки распределения интенсивности23 (и других признаков частиц), траектории интенсивности могут быть проанализированы для количества шагов фотоотбеливания с использованием алгоритмов определения шага 36,37,38. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Связывание ClyA с поддерживаемыми липидными мембранами с 5 моль% DOPE-PEG2000. Типичная кривая связывания получается после подсчета количества частиц в каждом кадре, идентифицированных u-треком. Визуализация инициируется до протекания мембраносвязывающего белка ClyA. Экспоненциальная функция распада (черная линия), соответствующая числам частиц (голубые круги), используется для восстановления константы времени для связывания ClyA с мембраной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Подвижность липофильной ДНК на ПЭГ-липидных двухслойных мембранах. (А) Показана схема липофильного индикатора ДНК в мембране POPC/DOPE-PEG2000. (B) Показаны средние квадратные смещения, рассчитанные на основе отслеживания одной частицы для различных ПЭГ-SLP. В 2 моль% DOPE-PEG2000 индикатор ДНК демонстрирует чистое броуновское поведение по сравнению с затрудненной подвижностью в отсутствие полимера (пунктирная линия включена для справки). С другой стороны, тот же индикатор ДНК отклоняется от чистой броуновской диффузии, указывая на субдиффузное движение с уменьшенной подвижностью в присутствии 20 моль% DOPE-PEG2000. (C) Распределение ISD2 для диффузии липофильного индикатора ДНК в двух разных липидных мембранах PEG2000 сравнивается с голыми SLB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Следы фотоотбеливания и сборка ClyA на липидных двухслойных мембранах. (A,B) Репрезентативные временные следы показывают стадии фотоотбеливания нанопорового комплекса ClyA, обнаруженные на этапе 6.2.1. для собранного комплекса ClyA с 7 и 5 ступенями соответственно. (C) Показано распределение стадии фотоотбеливания (серый) для ClyA (25 нМ), инкубированной на 64,7% POPC: 27,8% холестерина: 7,5% мембраны DOPE-PEG2000 в течение 60 мин при 37 °C. После корректировки на неполную эффективность маркировки показана расчетная массовая доля различных олигомерных видов (пурпурный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Связывание ClyA на мембране. Мониторинг связывания Cy3-меченого белка ClyA с мембраной SLB, содержащей 5 моль% DOPE-PEG2000. Связанные частицы обнаруживаются (голубые круги) u-треком, а треки строятся для пяти последующих позиций в их траектории. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Диффузия индикатора ДНК на мембране ПЭГ 2 моль%. Фильм для Cy3-меченой ДНК, прикрепленной к липидной мембране через токоферол в мембране PEG2000 2 моль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 3: Фотоотбеливающий фильм. Пленка собранных олигомеров меченых Cy3 молекул ClyA на мембране, содержащей 7,5 моль% DOPE-PEG2000. Более крупные комплексы проявляются из в несколько раз более высоких интенсивностей по сравнению с одним белком, а также из нескольких стадий фотоотбеливания, когда интенсивность частиц наблюдается с течением времени при непрерывном освещении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительный файл 1: Информация о том, как использовать u-track и различные коды MATLAB на шаге 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл кодирования 1: Репрезентативный файл автоматизированного проектирования (CAD) для создания отверстий в акриловом слайде и режущей ленты для всего слайда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные файлы кодирования 2: Сжатая папка, содержащая связанные коды MATLAB, необходимые для анализа изображений и данных на шаге 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные файлы кодирования 3: Образцы данных для анализа изображений и данных на шаге 6. Коды MATLAB также доступны в https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы демонстрируем одномолекулярные эксперименты на поддерживаемых липидных бислоях (SLB), которые демонстрируют переполненную среду для мембранных биомолекул. Переполненная среда генерирует эффект исключенного объема, приводящий к усилению биомолекулярныхреакций 1,2,39,40. Для ПЭГ-липидной системы, где полимер в первую очередь занимает объем вне бислоя, этот эффект особенно выражен для молекулярных видов с большими экто-доменами. Поэтому, по сравнению с липофильными красителями, диффузия большой гидрофильной молекулы, встроенной в мембрану, такой как рецепторы, гликопротеины и гликолипиды, может быть значительно снижена. Используя флуоресцентный индикатор ДНК, прикрепленный к мембране через токоферол (рисунок 5), мы можем идентифицировать такие эффекты скученности.
Отдельно наличие ПЭГ в нижней листовке также поднимает SLB и уменьшает взаимодействие биомолекул с опорным субстратом14,41. Обычно отрицательно заряженная поверхность поверхности изображения стекла часто препятствует подвижности и молекулярным реакциям. Поэтому использование PEG-липидов для поднятия мембраны от стекла выгодно даже тогда, когда это не с целью скученности. Тем не менее, необходимо позаботиться о выявлении режимов концентрации, которые не проявляют молекулярную скученность в этих случаях. Для белков, расширяющих более крупные домены за пределами бислоя, может потребоваться использование более высокомолекулярного PEG-липида, такого как PEG500042.
Несколько ключевых моментов имеют решающее значение для одномолекулярной визуализации в системах SLB. Строгая очистка слайдов и обшивки имеет решающее значение в экспериментах с одной молекулой (шаг 1). Визуализация поверхности с примесями приведет к дефектам в липидной мембране. Это может привести к образованию пятен флуоресцентно меченых биомолекул на поверхности мембраны. Покрытие и однородность образующихся SLB можно проверить в отдельном препарате путем легирования бислоя липидным красителем (DiI или Lissamine Rhodamine DOPE) и визуализации его под флуоресцентным микроскопом. Анализ FRAP может быть использован для сравнения диффузионного поведения, а также43,44.
Для экспериментов с мембранным связыванием (этап 4) установка потока с трубкой должна быть загрунтована буфером для предотвращения попадания пузырьков воздуха в камеру. Более высокие скорости потока или наличие пузырьков воздуха разорвут мембрану, и молекулы будут напрямую связываться с покровным листом. Получение изображения должно начаться до начала потока, поскольку некоторые молекулы диффундируют из трубки и связываются с мембраной. Фокусировка цели на бислое во время визуализации может быть облегчена легированием бислоя в низкой концентрации наночастицами золота, квантовыми точками или флуоресцентными шариками.
Для экспериментов по отслеживанию одной частицы количество частиц на мембране должно контролироваться, чтобы избежать сценария, в котором отслеживание является сложным из-за чрезмерного перекрытия траекторий частиц. Другим важным фактором, который следует учитывать во время визуализации, является мощность лазера. Высокая мощность лазера будет быстро фотоотбеливать флуорофоры, в то время как низкая интенсивность и соответствующая медленная скорость получения изображения вызовут размытие. Оптимальная мощность лазера должна давать значительную длину траектории (в среднем не менее >5) при сохранении симметричных и близких к дифракционным ограничениям изображений частиц. Система очистки кислорода также может быть использована для продления фотоотбеливания флуорофоров45. Ограничение анализа фотоотбеливания, представленного здесь, возникает37,46 в случае крупных молекулярных сборок (~ более 20 субъединиц), таких как ядерный поровый комплекс47. В таких случаях байесовский подход может быть использован для определения численности населения субъединицы в 48,49,50 человек.
Маркировка биомолекул флуорофорами в большинстве случаев не является полной51. Это создает проблему при подсчете субъединиц в кластере с немаркированными видами. Биномиальная коррекция эффективности маркировки ниже номинала обычно является разумным приближением, когда фиксируется стехиометрия молекулярных видов. Во многих случаях олигомерные виды могут быть неоднородными или динамически изменяющимися, как в процессе олигомеризации, что требует разработки новых инструментов для извлечения базовых распределений из данных фотоотбеливания.
В целом, этот протокол обеспечивает конвейер для генерации PEG-SLB с рекомендациями по условиям использования, выполнения и анализа связывания одной молекулы, а также отслеживания и выполнения анализа фотоотбеливания для мембранных биомолекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают профессора Бенджамина Шулера за то, что он поделился экспрессионной плазмидой для белка ClyA. Эта работа была поддержана Программой Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 ml Syringes | HMD Healthcare | Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin | Plastic syringe |
| Acetone | Finar Chemicals | 10020LL025 | |
| Acrylic Sheet | 2 mm thick | ||
| Acrylic Sheet | BigiMall | 2 mm, Clear | |
| Bath Sonicator | Branson | CPX-1800 | |
| Calcium Chloride | |||
| Chloroform | Sigma | 528730 | HPLC grade |
| Cholesterol | Avanti | 700100 | |
| Coplin Jar | Duran Wheaton Kimble | S6016 | 8 Slide Jar with Glass Cover |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | 24 mm X 50 mm |
| Cy3-DNA Strand | IDT | GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3 |
|
| Cyanine Dye (Cy3) | Cytiva Life Sciences | PA23001 | |
| DiI | Invitrogen | D3911 | Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) |
| DNA Connector Strand 1 | Sigma Aldrich | GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T |
|
| DNA Connector Strand 2 | Sigma Aldrich | CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT |
|
| DNA Tocopherol Strand | Biomers | Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA | |
| DOPE-PEG2000 | Avanti | 880130 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| Double Sided Tape | 3M | LF93010LE | |
| Drill Bits (Diamond Coated) | 0.5 - 1 mm | ||
| Drilling Machine | Dremel | 220 | Workstation |
| EMCCD | Andor | DU-897U-CS0-#BV | |
| Fluorescence Beads | Invitrogen | F10720 | |
| Glass Slides | Blue Star | Micro Slides, PIC-1 | |
| Glass Vials | Sigma | 854190 | |
| Hydrogen Peroxide | Lobachemie | 00182 | 30% Solution, AR Grade |
| Labolene | Thermo-Fischer Scientific | Detergent | |
| Laser 532 nm | Coherent | Sapphire | |
| Laser Cutter | Universal Laser Systems | ILS12.75 | |
| Lissamine Rhodamine DOPE | Avanti | 810150 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) |
| Methanol | Finar Chemicals | 30932LL025 | |
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | 1X | ||
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma Inc | PDC-002 | |
| POPC | Avanti | 850457 | 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine |
| Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE1010 | High Pressure Syringe Pump |
| PTFE Caps | Sigma | 27141 | |
| PTFE Tubing | Cole-Parmer | WW-06417-21 | Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD |
| Sulphuric Acid | SD Fine Chemicals | 98%, AR Grade | |
| TIRF Objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | |
| Vacuum Desiccator | Tarsons | ||
| Vortex Mixer | Tarsons |
References
- Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
- Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
- Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
- Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
- Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
- Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
- Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
- Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
- Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
- Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
- Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
- Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
- Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
- Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
- Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
- Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
- Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
- Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
- Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
- Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
- Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
- Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
- Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
- Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
- Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
- Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
- Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
- Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
- Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
- Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
- Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
- Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
- Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
- Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
