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Biochemistry

Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

Published: July 19, 2022 doi: 10.3791/64243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

Summary

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Abstract

Las membranas celulares son ambientes muy concurridos para las reacciones biomoleculares y la señalización. Sin embargo, la mayoría de los experimentos in vitro que investigan la interacción de proteínas con lípidos emplean membranas bicapa desnudas. Tales sistemas carecen de las complejidades del hacinamiento por proteínas y glicanos incrustados en la membrana y excluyen los efectos de volumen asociados encontrados en las superficies de la membrana celular. Además, la superficie de vidrio cargada negativamente sobre la que se forman las bicapas lipídicas impide la libre difusión de las biomoléculas transmembrana. Aquí, presentamos una membrana polimérico-lípida bien caracterizada como un imitador de membranas lipídicas abarrotadas. Este protocolo utiliza lípidos conjugados con polietilenglicol (PEG) como un enfoque generalizado para incorporar crowders en la bicapa lipídica soportada (SLB). En primer lugar, se presenta un procedimiento de limpieza de los portaobjetos microscópicos y cubreobjetos para realizar experimentos de una sola molécula. A continuación, se discuten los métodos para caracterizar los PEG-SLB y realizar experimentos de una sola molécula de unión, difusión y ensamblaje de biomoléculas utilizando el seguimiento de una sola molécula y el fotoblanqueo. Finalmente, este protocolo demuestra cómo monitorear el ensamblaje de nanoporos de la toxina formadora de poros bacteriana citolisina A (ClyA) en membranas lipídicas abarrotadas con análisis de fotoblanqueo de una sola molécula. También se incluyen códigos de MATLAB con datasets de ejemplo para realizar algunos de los análisis comunes, como el seguimiento de partículas, la extracción de comportamiento difusivo y el recuento de subunidades.

Introduction

Las membranas celulares son sistemas muy concurridos y complejos1. El hacinamiento molecular puede tener un impacto considerable en la difusión de entidades unidas a la membrana como proteínas y lípidos 2,3,4. Del mismo modo, las reacciones bimoleculares en las membranas lipídicas como la dimerización del receptor o la oligomerización de los complejos de membrana están influenciadas por el hacinamiento 5,6,7. La naturaleza, configuración y concentración de los crowders pueden gobernar la unión a la membrana, la difusividad y la interacción proteína-proteína de varias maneras 8,9. Dado que controlar el apiñamiento de la membrana en las membranas celulares e interpretar su influencia en las biomoléculas incrustadas es un desafío, los investigadores han tratado de establecer sistemas alternativos in vitro 10.

Un enfoque popular para las membranas artificiales apiñadas es dopar las membranas bicapa con lípidos injertados de polímero (como polietilenglicol, PEG)11,12. Durante la visualización de la dinámica de proteínas y lípidos en bicapas lipídicas soportadas (SLB), estos polímeros también protegen los componentes incrustados en la membrana del sustrato subyacente cargado negativamente (como el vidrio) al levantar efectivamente la bicapa lejos del soporte subyacente. Al variar el tamaño y la concentración del polímero, se puede controlar el grado de apiñamiento molecular, así como su separación del soporte sólido subyacente13,14. Esto es claramente una ventaja sobre las bicapas lipídicas soportadas sobre sustratos sólidos sin amortiguadores poliméricos15,16, donde las biomoléculas transmembrana pueden perder su actividad17,18,19. Más importante aún, nos permite recapitular el ambiente abarrotado de la membrana celular in vitro, que es crítico para muchos procesos de membrana.

Los polímeros injertados superficialmente en membranas también sufren cambios en su configuración dependiendo de su densidad de injerto12. A bajas concentraciones, permanecen en una configuración entrópicomente enrollada, conocida como hongo, por encima de la superficie de la membrana. Con el aumento de la concentración, comienzan a interactuar y tienden a desenrollarse y extenderse, produciendo finalmente una densa formación en forma de cepillo en la membrana21. Dado que la transición del régimen de hongo al régimen de cepillo es altamente heterogénea y se manifiesta en condiciones poco caracterizadas del polímero, es importante utilizar condiciones bien caracterizadas para el apiñamiento en membranas injertadas de polímero. En comparación con un estudio reciente20, identificamos e informamos composiciones de membrana abarrotadas que mantienen el transporte difusivo y la actividad de las biomoléculas transmembrana.

En este protocolo, discutimos cómo generar membranas lipídicas pegiladas y proporcionamos recomendaciones para densidades de PEG que imitan el hacinamiento en dos regímenes diferentes de configuración de polímeros (a saber, hongo y cepillo). El protocolo también describe la unión de moléculas individuales, el seguimiento de partículas y la adquisición y análisis de datos de fotoblanqueo para moléculas incrustadas en estas membranas abarrotadas. Primero, describimos los pasos de limpieza a fondo, el ensamblaje de la cámara de imágenes y la generación de PEG-SLB. En segundo lugar, proporcionamos detalles para los experimentos de unión de moléculas individuales, seguimiento de partículas y fotoblanqueo. En tercer lugar, discutimos i) extraer las afinidades de unión relativas, ii) caracterizar la difusión molecular, y iii) contar subunidades en un ensamblaje de proteínas a partir de películas de moléculas individuales en la membrana.

Si bien caracterizamos este sistema con imágenes de una sola molécula, el protocolo es útil para todos los biofísicos de membrana interesados en comprender el efecto del hacinamiento en las reacciones biomoleculares en las membranas lipídicas. En general, presentamos una sólida cartera para hacer bicapas lipídicas abarrotadas y soportadas, junto con varios ensayos de moléculas individuales realizados en ellas y las rutinas de análisis correspondientes.

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Protocol

1. Limpieza del portaobjetos y del cubreobjetos para experimentos de una sola molécula

  1. Antes del montaje de la cámara de imágenes, limpie y prepare tanto los cubreobjetos como los portaobjetos. Perfore varios pares de agujeros en las guías de vidrio utilizando una máquina perforadora con brocas recubiertas de diamante (0.5-1 mm de diámetro). Si se utilizan láminas de acrílico, utilice un cortador láser para hacer agujeros precisos (0,5 mm), como se muestra en la Figura 1.
    NOTA: Cada par de orificios actuará como una entrada y salida para el intercambio de flujo para una cámara microfluídica individual. Un archivo CAD representativo para agujeros en una diapositiva de acrílico está disponible en Archivo de codificación suplementario 1. Los agujeros perforados en portaobjetos de vidrio generalmente terminan siendo 1.5x-2x más grandes que el tamaño de la broca.
  2. Limpie los portaobjetos y cubreobjetos con detergente. Enjuáguelos bien con agua desionizada. Coloque los portaobjetos y cubreobjetos en un frasco separado para la tinción de diapositivas (Coplin) con agua y sonicate en un sonicador de baño durante 30 minutos. Para todos los pasos de sonicación, utilice un ajuste de potencia de 70 W.
  3. Retire el agua y llene el frasco Coplin que contiene los portaobjetos de vidrio y los cubreobjetos con acetona hasta el borde (50-100 ml dependiendo del volumen del frasco). En el caso de láminas de acrílico, use el mismo volumen de solución de acetona premezclada al 50% (v / v) o de lo contrario los portaobjetos se congelarán. Agite el frasco de Coplin para asegurarse de que todos los portaobjetos y cubreobjetos estén completamente sumergidos en la solución y sonicar en un sonicador de baño durante 30 minutos.
  4. Retire la acetona y deséchela en un recipiente de desechos, vierta metanol en los frascos de Coplin (50%, v / v para portaobjetos de acrílico) y sonicar durante 30 minutos. Tanto la acetona como el metanol se utilizan para eliminar las partículas orgánicas en los portaobjetos.
  5. Enjuague los portaobjetos y cubreobjetos con grandes cantidades de agua tipo 1 y colóquelos en un frasco de vidrio Coplin. Vierta 1 M de solución de KOH en el frasco y sanice durante 1 h. Para las diapositivas de acrílico, utilice 0,5 M de KOH.
  6. Deseche el KOH en un contenedor de residuos inorgánicos. Enjuague el frasco con abundante agua y coloque los frascos de Coplin en una campana extractora para el tratamiento de pirañas. No realice tratamiento con piraña para portaobjetos de acrílico; Continúe directamente con el paso 1.9.
    PRECAUCIÓN: El tratamiento con piraña debe realizarse en una campana extractora con guantes adecuados, gafas de seguridad y un delantal para manipular ácidos. La solución de piraña es un agente oxidante fuerte y elimina cualquier partícula orgánica sobrante de los portaobjetos y cubreobjetos.
  7. Para preparar la solución de piraña, vierta suavemente un volumen de 2/3 de ácido sulfúrico (98%, v / v) en un vaso de precipitados de vidrio y llene el resto con peróxido de hidrógeno (30%, v / v). Mezcle la solución cuidadosamente con una varilla de vidrio, viértala en el frasco de Coplin y deje el frasco de Coplin en la campana extractora durante al menos 1 h.
  8. Decantar la solución de piraña del frasco de Coplin en un recipiente de desecho para residuos ácidos guardados dentro de la campana extractora. Enjuague el frasco de Coplin con una gran cantidad de agua tipo 1.
  9. Seque los portaobjetos y cubreobjetos en una corriente suave de gas nitrógeno y colóquelos en un frasco de Coplin limpio. Los portaobjetos secos y los cubreobjetos ya están listos para el tratamiento con plasma. Tome un par de portaobjetos y cubreobjetos y colóquelos en la máquina de plasma.
  10. Crear un vacío en la cámara. Gire la perilla a la frecuencia de radio de 8-12 MHz para generar plasma en la cámara. Un resplandor púrpura dentro de la cámara indicará la formación de un plasma en la cámara.
  11. Realizar el tratamiento con plasma durante 8-10 min. Suelte suavemente el vacío después de apagar el plasma y continúe con el paso 2 para ensamblar la cámara de imágenes microfluídicas.

2. Montaje de la cámara microfluídica

NOTA: La cámara de imágenes se crea intercalando cinta adhesiva de doble cara entre un cubreobjetos previamente limpiado y una diapositiva del paso anterior como se describe a continuación.

  1. Ensamble los portaobjetos y el cubreobjetos después del tratamiento con plasma, como se muestra en la Figura 1. Coloque el portaobjetos de vidrio sobre un pañuelo de papel limpio. Corte la cinta de doble cara en tiras de ~ 2-3 mm de ancho y colóquelas a cada lado de un par de agujeros en el portaobjetos de vidrio. Use una punta de pipeta para aplanar la cinta o causará fugas de un canal a otro.
    NOTA: Alternativamente, corte la cinta para toda la diapositiva utilizando un cortador láser o trazador automático (Figura 1).
  2. Coloque el cubreobjetos tratado con plasma en el portaobjetos con cinta adhesiva para cerrar la cámara. Use una punta de pipeta para presionar suavemente el cubreobjetos sobre las regiones pegadas con cinta adhesiva para que el canal sea hermético.
  3. Si usa portaobjetos de vidrio, selle los bordes con resina epoxi. Finalmente, cada cámara de imágenes hecha de un portaobjetos y un cubreobjetos tiene una dimensión de 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (longitud x anchura x profundidad). Conservar las cámaras de imágenes microfluídicas preparadas durante 1-2 semanas en condiciones de desecación (preferiblemente entre 10-25 °C).
    NOTA: Para las cintas cortadas con láser utilizadas con portaobjetos acrílicos, no es necesario usar epoxi ya que los bordes de la cinta forman un sello hermético a prueba de fugas.

3. Fabricación de bicapas soportadas sobre sustrato de vidrio mediante fusión de vesículas

NOTA: Las bicapas lipídicas soportadas apiñadas se generan en las paredes de la cámara de imagen mediante la fusión de vesículas lipídicas preparadas con lípidos PEG dopados.

  1. Tome un vial de vidrio limpio, preferiblemente prelimpiado con solución de pirana. Añadir solución de cloroformo de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (DOPE-PEG2000) a la fracción molar deseada de lípidos PEG2000 de tal manera que la concentración final después de añadir tampón sea de 3 mM de lípidos en el paso 3.4. Prepare otras composiciones de membrana de lípidos de manera similar.
  2. Seque el cloroformo del vial con una corriente suave de nitrógeno con un pequeño remolino para que los lípidos secos se cubran uniformemente en la superficie del vial. Coloque el vial en un desecador al vacío durante 1 h. Esto eliminará cualquier cloroformo residual en el vial de vidrio. Añadir 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) e incubar durante la noche a 37 °C.
  3. Prepare pequeñas vesículas unilamelares (SUV) como se describe a continuación.
    1. Realice un vórtice suave durante 1-2 minutos después de la incubación nocturna hasta que la solución se vuelva turbia y lechosa.
    2. Tome 100 μL de esta solución en un pequeño tubo centrífugo de 500 μL y sonicar durante aproximadamente 1 h en un sonicador de baño (ajustado a un ajuste de potencia de 70 W). La solución será clara; Si no, entonces Sonicate por 30 minutos adicionales. Este paso generará SUVs de 50-100 nm de diámetro.
      NOTA: Si se prepara por primera vez, caracterice los SUV utilizando la dispersión dinámica de luz22,23 (DLS) o un método equivalente.
  4. Añadir cloruro de calcio (CaCl2, 3 M stock) a las vesículas sonicadas de tal manera que su concentración final sea de 30 mM en la solución lipídica.
  5. Corte una punta de micropipeta para inyectar la solución de muestra de manera que encaje firmemente en el orificio. Mezcle la solución lipídica e inyecte a través de uno de los orificios de la cámara de imágenes realizada en el paso 2. Limpie el exceso de solución que sale de la cámara desde la salida con un pañuelo limpio para evitar la contaminación de los canales adyacentes.
  6. Deje este conjunto en una cámara humidificada durante 90 min. Prepare una cámara de humidificación colocando un pañuelo húmedo en el extremo de un tubo de centrífuga de 50 ml. Coloque el portaobjetos hacia los lados dentro del tubo con las tapas del tubo cerradas. Las vesículas se fusionarán y generarán una bicapa uniforme en la superficie del vidrio.
  7. Lave bien la cámara con una cantidad copiosa de tampón PBS (aproximadamente 5 veces el volumen de la cámara de imágenes). Evite la entrada de burbujas de aire en la cámara durante el lavado ya que esto puede generar defectos en la membrana.

4. Configuración del microscopio y mediciones de imágenes de partículas individuales

NOTA: Los experimentos de una sola molécula se llevan a cabo en una configuración de microscopio de fluorescencia de reflexión interna total24,25,26 (TIRF) basada en objetivos (Figura 2). Las imágenes TIRF proporcionan una mejor relación señal-ruido para imágenes de una sola molécula, aunque los microscopios de epifluorescencia también se pueden usar bajo ciertas condiciones (especialmente cuando las biomoléculas fluorescentes se pueden eliminar de la solución a granel mediante lavado). Se puede utilizar el TIRF de tipo prisma, pero el tipo objetivo es preferible por la facilidad de configuración de la microfluídica27. Para TIRF de tipo objetivo, se recomienda un objetivo de apertura numérica alta (aumento de 100x, generalmente disponible comercialmente como objetivo TIRF).

  1. Antes de realizar cualquier experimento sobre movilidad y montaje, alinee el microscopio TIRF para garantizar una relación señal-ruido óptima debido a la iluminación del campo evanescente. Durante la alineación, mantenga la potencia del láser baja, entre 100 μW y 1 mW.
    PRECAUCIÓN: Se deben usar gafas de seguridad láser durante la alineación del rayo láser.
    1. Para alinear el microscopio, prepare una muestra de perlas fluorescentes agregándolas al canal microfluídico a bajas concentraciones (a ~100 pM) de modo que las manchas fluorescentes de cuentas individuales no se superpongan en las imágenes.
    2. Primero, visualice las cuentas en modo de epifluorescencia. Mientras la iluminación está en modo de epifluorescencia, mueva la etapa de traslación del espejo M5 (el espejo que refleja el láser al dicroico) de tal manera que el haz que sale del objetivo se doble hasta que finalmente esté en una configuración de reflexión interna total.
    3. Verifique si se ha logrado la iluminación TIR. Cuando el campo evanescente TIR esté iluminando la muestra de cuentas, compruebe que solo las cuentas de la superficie son visibles y que no se observan cuentas flotantes lejos de la superficie.
  2. Al comienzo del experimento, ajuste la potencia del láser en el plano focal posterior del objetivo a 5-10 mW para evitar la fotodestrucción (fotoblanqueo) de los fluoróforos.
  3. Mantenga el portaobjetos en la etapa del microscopio y concéntrese primero en la membrana desnuda (sin fluoróforos). Por lo general, pequeños rastros de impurezas en las membranas lipídicas son suficientes para hacer esto. Opcional: Incorpore un pequeño número de perlas fluorescentes o puntos cuánticos (rango subpicomolar) durante el paso 3.1, de modo que solo estén presentes de dos a cinco partículas fluorescentes en el campo de visión para facilitar la identificación del enfoque correcto.
  4. Inyectar la muestra (proteínas de membrana, etc.) con una micropipeta en la cámara de imagen recubierta de PEG-SLB realizada en el paso 3.7.
  5. Para medir la cinética de unión de una sola molécula, use una bomba de jeringa para hacer fluir las biomoléculas marcadas a través de los orificios de entrada hacia la cámara microfluídica (Figura 3). Utilice un caudal de 50-500 μL/min.
    1. Inicie la adquisición de películas antes de agregar la solución a la cámara de imágenes. Adquiera >5.000 fotogramas a una velocidad de fotogramas de 25-50 fotogramas/s bajo flujo continuo hasta que no haya un aumento adicional en la aparición de nuevas manchas en la superficie de la membrana (Video 1). Para el análisis de la cinética de unión, siga los pasos de 6.1.
  6. Para el seguimiento de una sola partícula, agregue las biomoléculas marcadas a bajas concentraciones (en comparación con la constante de unión) al canal utilizando una micropipeta. Optimice la concentración a una densidad de <0.1 partículas/μm 2 para que las partículas individuales rara vez se crucen (Video 2). Esto garantiza la alta fidelidad de las pistas recuperadas de los conjuntos de datos. Incubar si es necesario (en caso de mala unión a la membrana por biomoléculas, ~ 10 min) en un ambiente humidificador y lavar la cámara con el tampón.
    NOTA: El lavado es necesario en caso de que la unión sea deficiente en la membrana y la mayoría de las moléculas fluorescentes permanezcan en la solución. De lo contrario, esto puede interferir con las imágenes y dar lugar a una mala relación señal-ruido.
  7. Para el análisis de trayectoria de una sola partícula, adquiera 200-500 fotogramas a 10-100 fotogramas/s. Mantenga la lente del objetivo enfocada en el plano bicapa con una deriva mínima de la etapa durante el intervalo de adquisición.

5. Adquisición de imágenes para contar subunidades en un ensamblaje de proteínas

NOTA: La adquisición de imágenes para estimar la estequiometría requiere el blanqueo continuo de los fluoróforos y la detección del número de pasos hasta que no haya más fluoróforos que emitan fluorescencia.

  1. Para medir subunidades, agregue la concentración relevante de biomoléculas marcadas (ejemplo: ver resultados; ClyA se añadió a una concentración de 25 nM) a la cámara de imágenes microfluídicas e incubar (lavar si es necesario). Incubar el portaobjetos en una cámara de humidificación a la temperatura deseada durante el tiempo requerido (ejemplo: 37 °C y 60 min para el montaje de ClyA).
  2. Realice la adquisición de imágenes para fotoblanqueo de una sola molécula como se describe a continuación.
    1. Lave la cámara de imágenes con un tampón antes de obtener imágenes (si es necesario). Coloque el portaobjetos en el microscopio y ajuste el enfoque para visualizar las moléculas etiquetadas.
    2. Ajuste la potencia del láser a un nivel en el que el blanqueamiento del fluoróforo se produzca gradualmente (~ 1-5 min). Idealmente, para cada biomolécula ensamblada, mantenga la tasa de paso de fotoblanqueo >10-20 fotogramas de imagen separados. Adquirir las imágenes hasta que todas las moléculas estén completamente fotoblanqueadas (Video 3).
      NOTA: Para determinar la duración total de la trayectoria de fotoblanqueo requerida, trace la intensidad promedio de los puntos individuales con el número de fotogramas de imagen y determine la constante de tiempo ajustando una función de decaimiento exponencial. La duración total de la adquisición se puede establecer en 5-10 veces la constante de tiempo.
  3. Realice una medición de ensamblaje dependiente del tiempo iniciando la adquisición de películas tan pronto como la muestra se introduzca en la cámara y adquiriendo nuevas películas de fotoblanqueo a intervalos de tiempo fijos después de la unión a la membrana de diferentes segmentos del PEG-SLB.

6. Análisis de imágenes y datos

  1. Realice el enlace y el seguimiento de una sola partícula como se describe a continuación.
    1. Extraiga trayectorias de partículas individuales de las películas adquiridas anteriormente, como se muestra en la Figura 4. Para detectar partículas individuales y rastrearlas, utilice el paquete de MATLAB, u-track28, o el Trackmate29, un complemento en ImageJ, que también proporciona un robusto algoritmo de seguimiento de partículas individuales. Siga los pasos para configurar el análisis u-track como se muestra en el archivo complementario 1.
      NOTA: Los parámetros críticos para el seguimiento de una sola partícula son la desviación estándar del tamaño de partícula (en píxeles) y la longitud de cierre de la brecha. Utilice 1 y 0, respectivamente, para estos parámetros como los criterios más estrictos para el seguimiento.
    2. Para calcular las constantes de velocidad de enlace, primero estime el número de partículas que se unen a la superficie de la membrana a lo largo del tiempo. Utilice el archivo MATLAB binding_SPT (Supplementary Coding File 2) con la carpeta de salida u-track para identificar y trazar el número de partículas que aparecen en la membrana obtenida del paso 6.1. Ajuste la cinética observada a los modelos cinéticos apropiados (ejemplo: ajuste exponencial único para determinar la constante de tiempo, cuya inversa puede asignarse a la constante de velocidad aparente)30 para extraer las constantes de velocidad (ver resultados, Figura 5).
    3. El desplazamiento cuadrático medio (MSD) de las partículas difusoras (como el trazador de ADN en PEG-SLB, Figura 6) indica la naturaleza de la difusión. Utilice el paquete MATLAB MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) con la carpeta de salida u-track para obtener la gráfica MSD en función del tiempo de retraso (Figura 6B).
    4. Para identificar especies difusoras heterogéneas, calcule las distribuciones de desplazamiento cuadrático instantáneo (ISD) como se muestra en la Figura 6C. ISD2, definido como (X t+τ - X t)2 + (Yt+τ− Yt)2, donde se prefiere el tiempo de retraso, τ = 2, ya que reduce el ruido. Filtra trayectorias cortas con menos de tres fotogramas para reducir el ruido.
    5. Utilice ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) en MATLAB con la salida u-track para trazar los ISD de las partículas rastreadas (Figura 6C).
  2. Realice un análisis de fotoblanqueo de una sola molécula como se describe a continuación.
    1. Para estimar la estequiometría de los complejos de membrana, realice un análisis de fotoblanqueo sobre las intensidades dependientes del tiempo de los complejos fluorescentes (Video 3). Para ello, aplique un algoritmo de corrección de deriva (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) basado en la autocorrelación de fotogramas de película para extraer la deriva de traslación. Esto supone que las estructuras ensambladas son en gran medida inmóviles durante la adquisición de imágenes. Ejecute el paquete de MATLAB Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) para detectar trazas de tiempo de intensidad de partículas de las películas.
    2. Utilice el código de MATLAB Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2) para realizar la detección de pasos para los seguimientos de tiempo de intensidad. En caso de que las partículas no estén inmóviles, use el paquete u-track para extraer la ubicación de las partículas en movimiento. Este conjunto de coordenadas xy se puede asignar a las películas en bruto para extraer los valores de intensidad de la partícula en movimiento a medida que se difunde lateralmente en la membrana. Utilice el paquete MATLAB utrack_Int (Supplementary Coding File 2) con la salida del análisis u-track para esta opción.
    3. Realizar una corrección para el etiquetado incompleto de las biomoléculas con etiquetas fluoróforas para estimar la estequiometría correcta del complejo proteico. Determine la eficiencia del etiquetado con un espectrofotómetro UV-VIS midiendo la absorción de colorante y proteína para estimar la concentración. Calcule la eficiencia del etiquetado como la relación molar entre el tinte y la proteína.
      NOTA: Algunos colorantes también absorben en longitudes de onda cercanas a 280 nm y, por lo tanto, esta contribución de absorción por el tinte debe tenerse en cuenta durante el cálculo de la concentración.
    4. Realice una corrección binomial para tener en cuenta la eficiencia de etiquetado incompleta del fluoróforo de la siguiente manera utilizando el código de MATLAB Step_correction (Supplementary Coding File 2) con los datos obtenidos del recuento de pasos en el paso 6.2.2. Por ejemplo, para una toxina formadora de poros como la citolisina A, que forma una estructura dodecamérica en forma de anillo, aplique una corrección binomial utilizando la siguiente fórmula:
      nkEquation 1
      donde Equation 2 = eficiencia de etiquetado, n = número de pasos de fotoblanqueo y s = recuentos reales. Utilice la rutina de MATLAB Stepcount_immobile para recuperar las especies oligoméricas corregidas. Convertir la frecuencia de oligómeros (si) en fracciones de masa (Figura 7C; Archivo de codificación complementario 2).
      NOTA: Un conjunto de archivos analizados de seguimiento se incluyen en el archivo de codificación suplementario 3. Los códigos de MATLAB en Supplementary Coding File 2 se pueden ejecutar con estos conjuntos de datos.

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Representative Results

Monitorización de la unión de la proteína ClyA en membranas PEGiladas
Después del paso 4.5, la cinética de unión se estima trazando el número de partículas que se unen a la superficie de la membrana a lo largo del tiempo (Video 1). A medida que la proteína ClyA se une a una membrana con 5 lípidos mol% PEG2000, la densidad de partículas aumenta y alcanza la saturación (Figura 5). Un ajuste de decaimiento exponencial a las partículas unidas (círculos cian) da la constante de tiempo (τb) para la unión a la membrana (notablemente, los puntos de tiempo iniciales [círculos rojos] no encajan en este caso).

Movilidad del trazador de ADN en membranas abarrotadas
Comúnmente usamos trazadores de ADN (ADN anclado a la membrana con un tocoferol), colorantes trazadores lipofílicos (por ejemplo, DiI) o proteínas de membrana (por ejemplo, ClyA) para caracterizar la membrana bajo aglomeración mediada por PEG. La difusión lateral de moléculas trazadoras marcadas (25-100 pM) se puede monitorear mediante imágenes de la membrana al unirse a las partículas. En ausencia de cualquier polímero PEG en la membrana, la mayoría de los trazadores (especialmente los que se extienden fuera de la bicapa) muestran difusión restringida en SLB (Figura 6A). Con pequeños niveles de PEG2000 en la membrana (0,5-2 moles), la bicapa se aleja de la superficie subyacente y las moléculas trazadoras pueden difundirse sin restricciones. Por otro lado, se observa un confinamiento extremo a una alta concentración de PEG (20 moles%), donde las moléculas de PEG están en un régimen de cepillo denso, con una variedad de comportamientos mostrados en el medio. Los gráficos MSD para estas tres condiciones se muestran en la Figura 6B. Basándonos en nuestra caracterización de las membranas bicapa POPC/DOPE-PEG2000, recomendamos una fracción DOPE-PEG2000 de 1-3 moles que induce el hacinamiento en el régimen de hongos. Por encima de 7.5 mol% PEG2000-lípido, observamos el inicio del régimen de cepillo, y se pueden emplear composiciones de hasta 25 mol% de PEG2000-lípido para inducir hacinamiento y confinamiento. Las condiciones lipídicas PEG2000 del 4-7% que intervienen correspondientes a la transición entre los dos regímenes están mal caracterizadas y deben evitarse.

Montaje de ClyA en membranas abarrotadas
Las trayectorias de intensidad de los puntos individuales limitados por difracción de la proteína ClyA después de la incubación en la membrana abarrotada (Figura 7A, B) muestran un gran número de pasos distintos de fotoblanqueo, lo que sugiere la formación de varios intermedios de ensamblaje31. ClyA, al ser una proteína transmembrana, interactúa con la superficie de vidrio cargada negativamente en ausencia de PEG y se ensamblará muy mal. A 7,5 mol% de lípidos PEG2000, se midieron los complejos ensamblados y se representan en la Figura 7C. Después de corregir la eficiencia del etiquetado (0,9 en este caso), la distribución final de oligómeros muestra la especie dodecamérica ClyA como estructura dominante, consistente con los datos estructurales32.

Figure 1
Figura 1: Esquema para los pasos de limpieza y el montaje de la cámara microfluídica. (A) Los portaobjetos de vidrio y los cubreobjetos se limpian con sonicación secuencial en detergente, acetona, metanol, KOH y solución de piraña, con enjuague múltiple con agua ultrapura tipo 1 entre cada paso. Los portaobjetos y cubreobjetos se secan con gas nitrógeno antes del tratamiento con plasma. (B) La cámara de imágenes microfluídicas se ensambla utilizando una cinta adhesiva de doble cara precortada que une la diapositiva al cubreobjetos. * Los portaobjetos de acrílico no se tratan con solución de piraña, y la acetona, el metanol y el KOH se utilizan a una concentración del 50% (v / v) de la utilizada para la limpieza de cubreobjetos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuración del microscopio TIRF. Se muestra una configuración típica de microscopio TIRF de tipo objetivo adaptada en un microscopio invertido con la óptica esencial resaltada. M1-M5 son espejos para dirigir el rayo láser. Las lentes L1 y L2 se utilizan para expandir el rayo láser, y la lente L3 enfoca el rayo láser en el plano focal posterior de la lente del objetivo. I1 e I2 son los diafragmas de iris utilizados para alinear el rayo láser. Se utiliza un obturador para controlar la iluminación del rayo láser, fundamental para evitar el fotoblanqueo innecesario de las moléculas de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Configuración del flujo cinético de unión a la membrana. Para llevar a cabo el experimento de unión, se utiliza un tubo delgado de PTFE (0.022 en ID x 0.042 en OD) para hacer fluir la muestra con la ayuda de una bomba de jeringa (imagen no a escala). El extremo del tubo se conecta a la salida de la cámara de imágenes con la ayuda de una punta de micropipeta. El descarte se recoge en un pequeño depósito de micropunta enchufado a la toma de corriente, y el volumen introducido es siempre superior a 10 veces el volumen de la cámara de imágenes. Figura insertada que muestra la sección transversal de la cámara de imágenes. (imagen no a escala) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Pipeline para análisis de trayectorias de partículas individuales y películas de fotoblanqueo. (A) Las películas adquiridas se analizaron utilizando u-track en MATLAB para obtener las trayectorias como (x, y) y las intensidades (i) de cada partícula, cuadro por cuadro. Estas trayectorias se utilizaron para calcular el desplazamiento cuadrado instantáneo (ISD), ISD1 e ISD2. Los ISD se pueden trazar como histogramas para identificar especies móviles. Alternativamente, las gráficas de desplazamiento cuadrático medio (MSD) informan si el movimiento es gaussiano, confinado o superdifusivo33,34. El análisis oculto del modelo35 de Markov (HMM) se puede emplear para distinguir diferentes estados difusivos de una sola partícula. (B) Para el análisis de fotoblanqueo, las películas se corrigieron primero para detectar la deriva en el sistema (si era necesario), seguidas de la detección o seguimiento de partículas utilizando u-track. Además de estimar la distribución de intensidad23 (y otras características de partículas), las trayectorias de intensidad se pueden analizar para el número de pasos de fotoblanqueo utilizando algoritmos de búsqueda de pasos36,37,38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Unión de ClyA a membranas lipídicas soportadas con 5 mol% DOPE-PEG2000. Una curva de enlace típica se obtiene después de contar el número de partículas en cada fotograma identificado por u-track. Las imágenes se inician antes del flujo de la proteína ClyA de unión a la membrana. Se utiliza una función de decaimiento exponencial (línea negra) ajustada a los números de partículas (círculos cian) para recuperar la constante de tiempo para la unión de ClyA a la membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Movilidad del ADN lipofílico en membranas bicapa lipídica PEG. (A) Se muestra el esquema para el trazador de ADN lipofílico en la membrana POPC/DOPE-PEG2000. (B) Se muestran los desplazamientos cuadrados medios calculados a partir del seguimiento de una sola partícula para diferentes PEG-SLB. En 2 mol% DOPE-PEG2000, el trazador de ADN muestra un comportamiento browniano puro en comparación con la movilidad obstaculizada en ausencia del polímero (se incluye la línea discontinua como referencia). Por otro lado, el mismo trazador de ADN se desvía de la difusión browniana pura, lo que indica un movimiento subdifusivo con movilidad reducida en presencia de 20 mol% DOPE-PEG2000. (C) La distribución de ISD2 para la difusión del trazador de ADN lipofílico en dos membranas lipídicas PEG2000 diferentes se compara con SLB desnudas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Trazas de fotoblanqueo y ensamblaje de ClyA en membranas de bicapa lipídica. (A,B) Las trazas de tiempo representativas muestran los pasos de fotoblanqueo del complejo de nanoporos ClyA detectado en el paso 6.2.1. para un complejo ClyA ensamblado con 7 y 5 pasos, respectivamente. (C) Se muestra la distribución de la etapa de fotoblanqueo (gris) para ClyA (25 nM) incubada en 64,7% POPC: 27,8% Colesterol: 7,5% membrana DOPE-PEG2000 durante 60 min a 37 °C. Después de corregir la eficiencia de etiquetado incompleta, se muestra la fracción de masa estimada de varias especies oligoméricas (magenta). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Unión de ClyA en la membrana. Monitorización de la unión de la proteína ClyA marcada con Cy3 a la membrana SLB que contiene 5 mol% de DOPE-PEG2000. Las partículas unidas son detectadas (círculos cian) por u-track, y las pistas se trazan para cinco posiciones posteriores en su trayectoria. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Difusión del trazador de ADN en la membrana de PEG al 2% mol. Una película para ADN marcado con Cy3 anclado a la membrana lipídica a través de tocoferol en la membrana PEG2000 de 2 mol%. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 3: Película de fotoblanqueo. Una película de oligómeros ensamblados de moléculas ClyA marcadas con Cy3 en la membrana que contiene 7.5 mol% DOPE-PEG2000. Los complejos más grandes son evidentes por las intensidades varias veces más altas en comparación con una sola proteína, así como por los múltiples pasos de fotoblanqueo cuando se observa la intensidad de las partículas a lo largo del tiempo bajo iluminación continua. Haga clic aquí para descargar este video.

Archivo complementario 1: Información sobre cómo utilizar u-track y diferentes códigos de MATLAB en el paso 6. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 1: Un archivo representativo de diseño asistido por computadora (CAD) para hacer agujeros en el portaobjetos de acrílico y cinta de corte para toda la diapositiva. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivos de codificación suplementarios 2: carpeta comprimida que contiene los códigos de MATLAB asociados necesarios para el análisis de imágenes y datos en el paso 6. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivos de codificación suplementarios 3: Datos de muestra para el análisis de imágenes y datos en el paso 6. Los códigos de MATLAB también están disponibles en https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Aquí, demostramos experimentos de una sola molécula en bicapas lipídicas soportadas (SLB) que manifiestan un ambiente abarrotado para biomoléculas incrustadas en membrana. El ambiente hacinado genera un efecto de volumen excluido, lo que lleva a la mejora de las reacciones biomoleculares 1,2,39,40. Para el sistema PEG-lipídico, donde el polímero ocupa principalmente el volumen fuera de la bicapa, este efecto es especialmente pronunciado para especies moleculares con grandes ectodominios. Por lo tanto, en comparación con los colorantes lipofílicos, la difusión de una gran molécula hidrófila incrustada en la membrana, como receptores, glicoproteínas y glicolípidos puede reducirse significativamente. Usando ADN trazador fluorescente anclado a la membrana a través de tocoferol (Figura 5), podemos identificar tales efectos de hacinamiento.

Por separado, la presencia de PEG en el folio inferior también levanta el SLB y reduce la interacción de las biomoléculas con el sustrato de soporte14,41. Por lo general, la superficie cargada negativamente de la superficie del vidrio de imagen con frecuencia dificulta la movilidad y las reacciones moleculares. Por lo tanto, el uso de lípidos PEG para levantar la membrana lejos del vidrio es ventajoso incluso cuando no es con el propósito de amontonamiento. Sin embargo, se debe tener cuidado para identificar los regímenes de concentración que no manifiestan aglomeración molecular en esos casos. Para proteínas que extienden dominios más grandes fuera de la bicapa, podría ser necesario el uso de un lípido PEG de mayor peso molecular como PEG500042.

Algunos puntos clave son críticos para la obtención de imágenes de una sola molécula en sistemas SLB. La limpieza rigurosa de los portaobjetos y cubreobjetos es fundamental en experimentos de una sola molécula (paso 1). Obtener imágenes de una superficie con impurezas dará lugar a defectos en la membrana lipídica. Esto puede resultar en parches de biomoléculas marcadas con fluorescencia en la superficie de la membrana. La cobertura y la uniformidad de SLB formada se pueden verificar en una preparación separada dopando la bicapa con un colorante lipídico (DiI o Lissamine Rhodamine DOPE) y obteniendo imágenes bajo un microscopio de fluorescencia. El análisis FRAP también se puede utilizar para comparar el comportamiento difusivo43,44.

Para experimentos de unión a la membrana (paso 4), la configuración del flujo con el tubo debe cebarse con tampón para evitar la entrada de burbujas de aire en la cámara. Los caudales más altos o la presencia de burbujas de aire romperán la membrana y las moléculas se unirán directamente al cubreobjetos. La adquisición de imágenes debe comenzar antes de que comience el flujo, ya que algunas moléculas se difunden desde el tubo y se unen a la membrana. Enfocar el objetivo en la bicapa durante la obtención de imágenes se puede facilitar dopando la bicapa a baja concentración con nanopartículas de oro, puntos cuánticos o perlas fluorescentes.

Para los experimentos de seguimiento de partículas individuales, el número de partículas en la membrana debe controlarse para evitar un escenario en el que el seguimiento sea desafiante debido a la superposición excesiva de las trayectorias de las partículas. Otro factor importante a considerar durante la obtención de imágenes es la potencia del láser. Una alta potencia láser fotoblanqueará los fluoróforos rápidamente, mientras que la baja intensidad y las correspondientes tasas lentas de adquisición de imágenes causarán desenfoque. La potencia óptima del láser debe producir una longitud de trayectoria significativa (al menos >5 en promedio) mientras se mantienen imágenes simétricas y cercanas a la difracción limitada de partículas. También se puede utilizar un sistema de eliminación de oxígeno para prolongar el fotoblanqueo de fluoróforos45. Una limitación del análisis de fotoblanqueo presentado aquí surge 37,46 en el caso de ensamblajes moleculares grandes (~ mayores de 20 subunidades), como el complejo de poro nuclear47. En tales casos, se puede utilizar un enfoque basado en Bayesian para inferir la población de subunidades48,49,50.

El etiquetado de biomoléculas con fluoróforos en la mayoría de los casos no es completo51. Esto plantea un desafío en el conteo de subunidades en un grupo con especies no etiquetadas. Una corrección binomial para la eficiencia de etiquetado por debajo del par suele ser una aproximación razonable cuando se fija la estequiometría de las especies moleculares. En muchos casos, las especies oligoméricas podrían ser heterogéneas o cambiar dinámicamente, como en un proceso de oligomerización, lo que requiere el desarrollo de nuevas herramientas para extraer las distribuciones subyacentes de los datos de fotoblanqueo.

En general, este protocolo proporciona una tubería para generar PEG-SLB, con recomendaciones para las condiciones para usar, realizar y analizar la unión de moléculas individuales, y rastrear y realizar análisis de fotoblanqueo para biomoléculas de membrana.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen al Prof. Benjamin Schuler por compartir el plásmido de expresión de la proteína ClyA. Este trabajo fue apoyado por Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 - 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons

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Bioquímica Número 185
Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros
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