Summary
Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Hücresel membranlar, biyomoleküler reaksiyonlar ve sinyalizasyon için oldukça kalabalık ortamlardır. Bununla birlikte, lipitlerle protein etkileşimini araştıran çoğu in vitro deney, çıplak çift katmanlı membranlar kullanır. Bu tür sistemler, membrana gömülü proteinler ve glikanlar tarafından kalabalıklaşmanın karmaşıklığından yoksundur ve hücresel membran yüzeylerinde karşılaşılan ilişkili hacim etkilerini dışlar. Ayrıca, lipit çift katmanlarının oluştuğu negatif yüklü cam yüzey, transmembran biyomoleküllerinin serbest difüzyonunu önler. Burada, kalabalık lipid membranları için bir mimik olarak iyi karakterize edilmiş bir polimer-lipid membranı sunuyoruz. Bu protokol, polietilen glikol (PEG) konjuge lipitleri, crowder'ları desteklenen lipit çift katmanına (SLB) dahil etmek için genelleştirilmiş bir yaklaşım olarak kullanır. İlk olarak, tek moleküllü deneyler yapmak için mikroskobik slaytların ve örtülerin temizleme prosedürü sunulmuştur. Daha sonra, PEG-SLB'leri karakterize etme ve tek moleküllü izleme ve fotobeyazlatma kullanarak biyomoleküllerin bağlanması, difüzyonu ve montajının tek moleküllü deneylerini gerçekleştirme yöntemleri tartışılmaktadır. Son olarak, bu protokol, tek moleküllü fotobeyazlatma analizi ile kalabalık lipit membranları üzerinde bakteriyel gözenek oluşturan toksin Sitolisin A'nın (ClyA) nanopore montajının nasıl izleneceğini göstermektedir. Örnek veri kümelerine sahip MATLAB kodları, parçacık izleme, difüzyon davranışını ayıklama ve alt birim sayımı gibi bazı yaygın analizleri gerçekleştirmek için de dahil edilmiştir.
Introduction
Hücresel membranlar oldukça kalabalık ve karmaşık sistemlerdir1. Moleküler kalabalıklaşma, protein ve lipitler gibi membrana bağlı varlıkların difüzyonu üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir 2,3,4. Benzer şekilde, reseptör dimerizasyonu veya membran komplekslerinin oligomerizasyonu gibi lipit membranlar üzerindeki bimoleküler reaksiyonlar 5,6,7 kalabalığından etkilenir. Kalabalıkların doğası, konfigürasyonu ve konsantrasyonu, membran bağlanmasını, difüzyonunu ve protein-protein etkileşimini çeşitli şekillerde yönetebilir 8,9. Hücresel membranlar üzerindeki membran kalabalığını kontrol etmek ve gömülü biyomoleküller üzerindeki etkisini yorumlamak zor olduğundan, araştırmacılar alternatif in vitro sistemler kurmaya çalışmışlardır10.
Yapay kalabalık membranlar için popüler bir yaklaşım, çift katmanlı membranların polimer (polietilen glikol, PEG gibi) aşılanmış lipitlerle dopinglenmesidir11,12. Desteklenen lipit çift katmanları (SLB'ler) üzerindeki protein ve lipit dinamiklerinin görselleştirilmesi sırasında, bu polimerler ayrıca membrana gömülü bileşenleri, çift katmanı altta yatan destekten etkili bir şekilde kaldırarak altta yatan negatif yüklü substrattan (cam gibi) korur. Polimerin boyutunu ve konsantrasyonunu değiştirerek, moleküler kalabalıklaşmanın derecesini ve altta yatan katı destekten ayrılmasını kontrol edebilir13,14. Bu, polimer yastıkları olmayan katı substratlar üzerinde desteklenen lipit çift katmanlıtabakalara göre açıkça bir avantajdır 15,16, transmembran biyomolekülleri aktivitelerini kaybedebilir17,18,19. Daha da önemlisi, birçok membran işlemi için kritik olan hücre zarının kalabalık ortamını in vitro olarak özetlememizi sağlar.
Membranlar üzerindeki yüzey aşılı polimerler de aşılama yoğunluklarına bağlı olarak konfigürasyonlarında değişikliklere uğrar12. Düşük konsantrasyonlarda, membran yüzeyinin üzerinde, mantar olarak bilinen entropik olarak sarılmış bir konfigürasyonda kalırlar. Artan konsantrasyonla, etkileşime girmeye başlarlar ve açılma ve genişleme eğilimindedirler, sonunda membran21 üzerinde yoğun bir fırça benzeri oluşum sağlarlar. Mantardan fırça rejimine geçiş oldukça heterojen olduğundan ve polimerin kötü karakterize edilmiş koşullarında ortaya çıktığından, polimer aşılı membranlarda kalabalıklaşma için iyi karakterize edilmiş koşulların kullanılması önemlidir. Yakın tarihli bir çalışma20 ile karşılaştırıldığında, transmembran biyomoleküllerinin difüzif taşınımını ve aktivitesini koruyan kalabalık membran bileşimlerini tanımlamakta ve raporlamaktayız.
Bu protokolde, PEGile lipid membranlarının nasıl üretileceğini tartışıyoruz ve iki farklı polimer konfigürasyon rejiminde (yani, mantar ve fırça) kalabalığı taklit eden PEG yoğunlukları için önerilerde bulunuyoruz. Protokol ayrıca bu kalabalık membranlara gömülü moleküller için tek moleküllü bağlanma, parçacık izleme ve fotobeyazlatma veri toplama ve analizini de açıklar. İlk olarak, kapsamlı temizleme adımlarını, görüntüleme odasının montajını ve PEG-SLB'lerin oluşumunu açıklıyoruz. İkincisi, tek moleküllü bağlama, parçacık izleme ve fotobeyazlatma deneyleri için ayrıntılar sağlıyoruz. Üçüncüsü, i) nispi bağlanma afinitelerinin çıkarılmasını, ii) moleküler difüzyonun karakterize edilmesini ve iii) membran üzerindeki tek moleküllerin filmlerinden bir protein grubundaki alt birimlerin sayılmasını tartışıyoruz.
Bu sistemi tek moleküllü görüntüleme ile karakterize etmemize rağmen, protokol, kalabalıklaşmanın lipit membranları üzerindeki biyomoleküler reaksiyonlar üzerindeki etkisini anlamak isteyen tüm membran biyofizikçileri için yararlıdır. Genel olarak, kalabalık ve desteklenen lipit çift katmanları yapmak için sağlam bir boru hattı, bunlar üzerinde yürütülen çeşitli tek moleküllü testler ve ilgili analiz rutinleri sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tek moleküllü deneyler için sürgü ve kapak kaymasının temizlenmesi
- Görüntüleme odasının montajından önce, hem kapak kapaklarını hem de slaytları temizleyin ve hazırlayın. Elmas kaplı matkap uçlarına (0,5-1 mm çapında) sahip bir delme makinesi kullanarak cam kızaklar üzerinde birden fazla delik çifti açın. Akrilik levhalar kullanılıyorsa, Şekil 1'de gösterildiği gibi hassas delikler (0,5 mm) yapmak için bir lazer kesici kullanın.
NOT: Her bir delik çifti, bireysel bir mikroakışkan odası için akış değişimi için bir giriş ve çıkış görevi görecektir. Akrilik slayttaki delikler için temsili bir CAD dosyası Ek Kodlama Dosyası 1'de mevcuttur. Cam kızaklara açılan delikler genellikle matkap ucu boyutundan 1,5x-2 kat daha büyüktür. - Slaytları ve kapak kapaklarını deterjanla temizleyin. Deiyonize su ile iyice durulayın. Slaytları ve kapak kapaklarını suyla ayrı bir slayt boyama (Coplin) kavanozuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca bir banyo sonikatöründe sonikasyon yapın. Tüm sonication adımları için, bir 70 W güç ayarı kullanın.
- Suyu çıkarın ve cam slaytları ve kapakları içeren Coplin kavanozunu ağzına kadar asetonla doldurun (kavanoz hacmine bağlı olarak 50-100 mL). Akrilik levhalar söz konusu olduğunda, aynı hacimde önceden karıştırılmış% 50 (v / v) aseton çözeltisi kullanın, aksi takdirde slaytlar donar. Tüm slaytların ve kapakların çözeltiye tamamen daldırıldığından emin olmak için Coplin kavanozunu sallayın ve 30 dakika boyunca bir banyo sonikatöründe sonikasyon yapın.
- Asetonu çıkarın ve bir atık kabına atın, metanolü Coplin kavanozlarına dökün (% 50, akrilik slaytlar için v / v) ve 30 dakika boyunca sonikat yapın. Hem aseton hem de metanolü, slaytlardaki organik parçacıkları uzaklaştırmak için kullanılır.
- Slaytları ve örtüleri bol miktarda tip 1 su ile durulayın ve bir cam Coplin kavanozuna yerleştirin. Kavanozun içine 1 M KOH çözeltisi dökün ve 1 saat boyunca sonikleştirin. Akrilik kızaklar için 0,5 M KOH kullanın.
- KOH'yi inorganik bir atık kabına atın. Kavanozu bol suyla durulayın ve Coplin kavanozlarını piranha tedavisi için bir duman başlığına yerleştirin. Akrilik slaytlar için piranha tedavisi yapmayın; doğrudan adım 1.9'a geçin.
DİKKAT: Piranha tedavisi, uygun eldivenler, güvenlik gözlükleri ve asitleri işlemek için bir önlük bulunan bir duman başlığında yapılmalıdır. Piranha çözeltisi güçlü bir oksitleyici ajandır ve artık organik parçacıkları slaytlardan ve kapaklardan uzaklaştırır. - Piranha çözeltisini hazırlamak için, bir cam kabın içine yavaşça 2/3 hacimli sülfürik asit (% 98, v / v) dökün ve geri kalanını hidrojen peroksit (% 30, v / v) ile doldurun. Çözeltiyi dikkatlice bir cam çubukla karıştırın, Coplin kavanozuna dökün ve Coplin kavanozunu duman davlumbazında en az 1 saat bekletin.
- Piranha çözeltisini Coplin kavanozundan duman davlumbazının içinde tutulan asit atıkları için bir atma kabında boşaltın. Coplin kavanozunu bol miktarda tip 1 su ile durulayın.
- Kızakları ve örtüleri yumuşak bir azot gazı akışında kurutun ve temiz bir Coplin kavanozuna yerleştirin. Kurutulmuş slaytlar ve örtüler artık plazma tedavisi için hazırdır. Bir çift slayt ve kapak kapağı alın ve bunları plazma makinesine yerleştirin.
- Odada bir vakum oluşturun. Odada plazma üretmek için düğmeyi 8-12 MHz radyo frekansına çevirin. Odanın içindeki mor bir parıltı, odada bir plazma oluşumunu gösterecektir.
- Plazma tedavisini 8-10 dakika boyunca gerçekleştirin. Plazmayı kapattıktan sonra vakumu yavaşça serbest bırakın ve mikroakışkan görüntüleme odasını monte etmek için adım 2'ye geçin.
2. Mikroakışkan odanın montajı
NOT: Görüntüleme odası, çift taraflı bandın önceden temizlenmiş bir kapak kayması arasına sıkıştırılması ve aşağıda açıklandığı gibi önceki adımdan kaydırılmasıyla oluşturulur.
- Şekil 1'de gösterildiği gibi plazma işleminden sonra slaytları ve örtüleri birleştirin. Cam slaytı temiz bir kağıt mendil üzerine yerleştirin. Çift taraflı bandı ~ 2-3 mm genişliğinde şeritler halinde kesin ve cam slayttaki bir çift deliğin her iki tarafına yerleştirin. Bandı düzleştirmek için pipet ucu kullanın, aksi takdirde bir kanaldan diğerine sızıntıya neden olur.
NOT: Alternatif olarak, lazer veya otomatik çizici kesici kullanarak tüm slayt için bandı kesin (Şekil 1). - Odayı kapatmak için plazma ile işlenmiş kapak kapağını bantlı slaytın üzerine yerleştirin. Kanalı su geçirmez hale getirmek için kapak kaymasını bantlı bölgelere hafifçe bastırmak için bir pipet ucu kullanın.
- Cam slaytlar kullanıyorsanız, epoksi reçine kullanarak kenarları kapatın. Son olarak, bir slayt ve kapak kaymasından yapılan her görüntüleme odasının boyutu 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (uzunluk x genişlik x derinlik). Hazırlanan mikroakışkan görüntüleme odalarını kurumuş koşullarda (tercihen 10-25 °C arasında) 1-2 hafta saklayınız.
NOT: Akrilik kızaklarla kullanılan lazer kesim bantlar için, bant kenarları sızdırmazlık sızdırmaz sıkı bir sızdırmazlık oluşturduğundan epoksi kullanmak gerekli değildir.
3. Vezikül füzyonu ile cam substrat üzerinde desteklenen çift katmanlı yapım
NOT: Görüntüleme odasının duvarlarında, katkılı PEG-lipidlerle hazırlanan lipid veziküllerinin füzyonu ile kalabalık destekli lipid çift tabakaları üretilir.
- Temiz bir cam şişe alın, tercihen piranha çözeltisi kullanılarak önceden temizlenir. PEG2000 lipitlerinin istenen mol fraksiyonuna 1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin (POPC) ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polietilen glikol)-2000] (DOPE-PEG2000) kloroform çözeltisini ekleyin, böylece tampon eklendikten sonra son konsantrasyon adım 3.4'te 3 mM lipit olacaktır. Lipitlerin diğer membran bileşimlerini benzer şekilde hazırlayın.
- Kloroformu şişeden küçük bir girdap ile yumuşak bir azot akışı kullanarak kurutun, böylece kurutulmuş lipitler şişenin yüzeyinde düzgün bir şekilde kaplanır. Şişeyi 1 saat boyunca vakumlu bir kurutucuya koyun. Bu, cam şişedeki kalıntı kloroformu ortadan kaldıracaktır. 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Aşağıda açıklandığı gibi küçük unilamellar veziküller (SUV'lar) hazırlayın.
- Çözelti bulanık ve sütlü hale gelene kadar gece boyunca inkübasyondan sonra 1-2 dakika boyunca yavaşça vorteks.
- Bu çözeltinin 100 μL'sini küçük bir 500 μL santrifüj tüpünde alın ve bir banyo sonikatöründe yaklaşık 1 saat boyunca sonikasyon yapın (70 W güç ayarında ayarlayın). Çözüm netleşecek; değilse, o zaman ek bir 30 dakika daha sonikasyon. Bu adım, 50-100 nm çapında SUV'lar üretecek.
NOT: İlk kez hazırlanıyorsanız, SUV'ları dinamik ışık saçılımı22,23 (DLS) veya eşdeğer bir yöntem kullanarak karakterize edin.
- Soniklenmiş veziküllere kalsiyum klorür (CaCl 2, 3 M stok) ekleyin, böylece nihai konsantrasyonu lipit çözeltisinde 30 mM olur.
- Numune çözeltisini enjekte etmek için bir mikropipet ucunu deliğe sıkıca oturacak şekilde kesin. Lipit çözeltisini karıştırın ve adım 2'de yapılan görüntüleme odasındaki deliklerden birinden enjekte edin. Bitişik kanalların kirlenmesini önlemek için odadan çıkıştan çıkan fazla çözeltiyi temiz bir doku ile silin.
- Bu tertibatı nemlendirilmiş bir odada 90 dakika bekletin. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün sonuna ıslak bir doku yerleştirerek bir nemlendirme odası hazırlayın. Sürgüyü, tüp kapakları kapalıyken tüpün içine yana doğru yerleştirin. Veziküller kaynaşacak ve cam yüzeyinde düzgün bir çift katman oluşturacaktır.
- Odayı bol miktarda PBS tamponu ile iyice yıkayın (görüntüleme odasının hacminin yaklaşık 5 katı). Yıkama sırasında hava kabarcıklarının odaya girmesini önleyin, çünkü bu membranda kusurlara neden olabilir.
4. Mikroskop kurulumu ve tek parçacıklı görüntüleme ölçümleri
NOT: Tek moleküllü deneyler objektif tabanlı toplam iç yansıma floresan24,25,26 (TIRF) mikroskop kurulumu üzerinde gerçekleştirilmektedir (Şekil 2). TIRF görüntüleme, tek moleküllü görüntüleme için daha iyi bir sinyal-gürültü oranı sağlar, ancak epi-floresan mikroskoplar belirli koşullar altında da kullanılabilir (özellikle floresan biyomolekülleri yıkanarak toplu çözeltiden çıkarılabildiğinde). Prizma tipi TIRF kullanılabilir, ancak mikroakışkanların kurulma kolaylığı için objektif tip tercih edilir27. Hedef tipi TIRF için, yüksek sayısal diyaframlı bir hedef (100x büyütme, genellikle ticari olarak TIRF hedefi olarak temin edilebilir) önerilir.
- Hareketlilik ve montaj konusunda herhangi bir deney yapmadan önce, kaçış alanının aydınlatması nedeniyle optimum sinyal-gürültü oranını sağlamak için TIRF mikroskobunu hizalayın. Hizalama sırasında, lazer gücünü 100 μW ile 1 mW arasında düşük tutun.
DİKKAT: Lazer ışınının hizalanması sırasında lazer güvenlik gözlükleri kullanılmalıdır.- Mikroskobu hizalamak için, mikroakışkan kanala düşük konsantrasyonlarda (~ 100 pM'de) ekleyerek bir floresan boncuk örneği hazırlayın, böylece tek boncuklardan floresan lekeler görüntülerde üst üste binmez.
- İlk olarak, boncukları epifloresan modunda görselleştirin. Aydınlatma epifloresan modundayken, M5 ayna çeviri aşamasını (lazeri dikroiğe yansıtan ayna) objektiften çıkan ışın sonunda toplam iç yansıma konfigürasyonuna girene kadar bükülecek şekilde hareket ettirin.
- TIR aydınlatmasının sağlanıp sağlanmadığını doğrulayın. TIR kaçış alanı boncuk numunesini aydınlatırken, yalnızca yüzeydeki boncukların görünür olduğunu ve yüzeyden uzakta serbest yüzen boncukların gözlenmediğini kontrol edin.
- Deneyin başlangıcında, floroforların foto-tahribatını (fotobeyazlatma) önlemek için lazer gücünü objektif arka odak düzleminde 5-10 mW'a ayarlayın.
- Slaytı mikroskop aşamasında tutun ve önce çıplak membrana (florofor olmadan) odaklanın. Genellikle, lipit membranlarındaki küçük safsızlık izleri bunu yapmak için yeterlidir. İsteğe bağlı: Adım 3.1 sırasında az sayıda floresan boncuk veya kuantum noktası (alt pikomolar aralık) ekleyin, böylece doğru odağın tanımlanmasını kolaylaştırmak için görüş alanında yalnızca iki ila beş floresan parçacık bulunur.
- Adım 3.7'de yapılan PEG-SLB kaplı görüntüleme odasına bir mikropipet kullanarak numuneyi (membran-proteinler vb.) enjekte edin.
- Tek moleküllü bağlanma kinetiğini ölçmek için, etiketli biyomolekülleri giriş deliklerinden mikroakışkan odasına akıtmak için bir şırınga pompası kullanın (Şekil 3). 50-500 μL/dak akış hızı kullanın.
- Çözümü görüntüleme odasına eklemeden önce film alımına başlayın. Membran yüzeyinde yeni noktaların görünümünde daha fazla artış olmayıncaya kadar sürekli akış altında 25-50 kare/sn kare hızında 5.000 kare > elde edin (Video 1). Bağlanma kinetik analizi için, 6.1'deki adımları izleyin.
- Tek parçacık izleme için, etiketli biyomolekülleri düşük konsantrasyonlarda (bağlanma sabitine kıyasla) bir mikropipet kullanarak kanala ekleyin. Konsantrasyonu <0,1 partikül/μm2 yoğunluğa optimize edin, böylece tek tek parçacıklar nadiren yolları kesişir (Video 2). Bu, veri kümelerinden kurtarılan parçaların yüksek doğrulukta olmasını sağlar. Gerekirse nemlendirici bir ortamda (biyomoleküller tarafından zayıf membran bağlanması durumunda, ~ 10 dakika) inkübe edin ve odayı tamponla yıkayın.
NOT: Membran üzerindeki bağlanmanın zayıf olması ve floresan moleküllerinin çoğunun çözelti içinde kalması durumunda yıkama gereklidir. Aksi takdirde, bu durum görüntülemeyi engelleyebilir ve sinyal-gürültü oranının düşük olmasına neden olabilir. - Tek parçacıklı yörünge analizi için, 10-100 kare / s'de 200-500 kare elde edin. Objektif lensin çift katmanlı düzleme odaklanmasını ve edinme aralığı boyunca minimum aşama kayması ile koruyun.
5. Bir protein düzeneğindeki alt birimleri saymak için görüntü toplama
NOT: Stokiyometriyi tahmin etmek için görüntü elde etmek, floroforların sürekli ağartılmasını ve daha fazla florofor floresan yaymayana kadar adım sayısının tespit edilmesini gerektirir.
- Alt birimleri ölçmek için, etiketli biyomoleküllerin ilgili konsantrasyonunu ekleyin (örnek: sonuçlara bakın; ClyA, mikroakışkan görüntüleme odasına 25 nM konsantrasyonunda eklendi ve inkübe edildi (gerekirse yıkayın). Slaytı nemlendirme odasındaki bir nemlendirme odasında istenen süre boyunca gerekli süre boyunca inkübe edin (örneğin: ClyA'nın montajı için 37 °C ve 60 dakika).
- Aşağıda açıklandığı gibi tek moleküllü fotobeyazlatma için görüntü yakalama gerçekleştirin.
- Görüntülemeden önce görüntüleme odasını bir tamponla yıkayın (gerekirse). Slaytı mikroskopa yerleştirin ve etiketli molekülleri görselleştirmek için odağı ayarlayın.
- Lazer gücünü, floroforun ağartılmasının kademeli olarak (~ 1-5 dakika) gerçekleştiği bir seviyeye ayarlayın. İdeal olarak, monte edilen her biyomolekül için, fotobeyazlatma adım hızını >10-20 görüntüleme çerçevelerini ayrı tutun. Tüm moleküller tamamen fotobeyazlatılana kadar görüntüleri elde edin (Video 3).
NOT: Gerekli fotobeyazlatma yörüngesinin toplam süresini belirlemek için, tek tek noktaların ortalama yoğunluğunu görüntüleme karelerinin sayısıyla çizin ve üstel bir bozunma fonksiyonu takarak zaman sabitini belirleyin. Satın almanın toplam süresi, zaman sabitinin 5-10 katına ayarlanabilir.
- Numune hazneye girer girmez film alımını başlatarak ve PEG-SLB'nin farklı segmentlerinden membran bağlandıktan sonra sabit zaman aralıklarında yeni fotobeyazlatma filmleri elde ederek zamana bağlı bir montaj ölçümü gerçekleştirin.
6. Görüntü ve veri analizi
- Aşağıda açıklandığı gibi tek parçacık bağlama ve izleme gerçekleştirin.
- Şekil 4'te gösterildiği gibi, yukarıda edinilen filmlerden tek parçacıklı yörüngeleri çıkarın. Tek parçacıkları algılamak ve izlemek için MATLAB paketini, u-track28'i veya ImageJ'deki bir eklenti olan ve aynı zamanda sağlam bir tek parçacık izleme algoritması sağlayan Trackmate29'u kullanın. Ek Dosya 1'de gösterildiği gibi u-track analizini ayarlama adımlarını izleyin.
NOT: Tek parçacık izleme için kritik parametreler, parçacık boyutunun standart sapması (piksel cinsinden) ve boşluk kapatma uzunluğudur. İzleme için en katı ölçütler olarak bu parametreler için sırasıyla 1 ve 0 kullanın. - Bağlanma hızı sabitlerini hesaplamak için, önce zaman içinde membran yüzeyine bağlanan parçacıkların sayısını tahmin edin. Adım 6.1'den elde edilen membranda görünen parçacık sayısını tanımlamak ve çizmek için u-track çıktı klasörüyle birlikte MATLAB dosya binding_SPT (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanın. Gözlemlenen kinetiği uygun kinetik modellere sığdırın (örneğin: zaman sabitini belirlemek için tek üstel uyum, tersi görünür oran sabitine atanabilir)30 hız sabitlerini çıkarmak için (bkz. sonuçlar, Şekil 5).
- Difüzyon parçacıklarının ortalama kareli yer değiştirmesi (MSD) (PEG-SLB'lerdeki DNA izleyici gibi, Şekil 6) difüzyonun doğasını gösterir. MSD grafiğini gecikme süresinin bir fonksiyonu olarak elde etmek için u-track çıktı klasörüyle birlikte MATLAB paket MSD_ISD (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanın (Şekil 6B).
- Heterojen difüzyon türlerini tanımlamak için, Şekil 6C'de gösterildiği gibi anlık kareli yer değiştirme (ISD) dağılımlarını hesaplayın. (Xt+τ - X t)2 + (Yt+τ− Yt)2 olarak tanımlanan ISD2, burada gecikme süresi, τ = 2, gürültüyü azalttığı için tercih edilir. Gürültüyü azaltmak için üçten az kareye sahip kısa yörüngeleri filtreleyin.
- İzlenen parçacıkların ISD'lerini çizmek için u-track çıktısıyla MATLAB'da ISD_analyzer (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanın (Şekil 6C).
- Şekil 4'te gösterildiği gibi, yukarıda edinilen filmlerden tek parçacıklı yörüngeleri çıkarın. Tek parçacıkları algılamak ve izlemek için MATLAB paketini, u-track28'i veya ImageJ'deki bir eklenti olan ve aynı zamanda sağlam bir tek parçacık izleme algoritması sağlayan Trackmate29'u kullanın. Ek Dosya 1'de gösterildiği gibi u-track analizini ayarlama adımlarını izleyin.
- Aşağıda açıklandığı gibi tek moleküllü fotobeyazlatma analizi yapın.
- Membran komplekslerinin stokiyometrisini tahmin etmek için, floresan komplekslerinin zamana bağlı yoğunlukları üzerinde bir fotobeyazlatma analizi yapın (Video 3). Bunun için, çeviri sürüklenmesini ayıklamak üzere film karelerinin otokorelasyonuna dayalı bir sapma düzeltme algoritması (drift_correct_images, Ek Kodlama Dosyası 2) uygulayın. Bu, monte edilen yapıların görüntü yakalama sırasında büyük ölçüde hareketsiz olduğunu varsayar. Filmlerden partikül yoğunluğu zaman izlerini algılamak için MATLAB paket Extract_traces_1C (Ek Kodlama Dosyası 2) çalıştırın.
- Yoğunluk zaman izlemeleri için adım algılamasını gerçekleştirmek üzere MATLAB kod Stepcount_immobile (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanın. Parçacıkların hareketsiz olmaması durumunda, hareketli parçacıkların yerini çıkarmak için u-track paketini kullanın. Bu xy koordinatları seti, membran üzerinde yanal olarak yayılırken hareket eden parçacığın yoğunluk değerlerini çıkarmak için ham filmlerle eşlenebilir. Bu seçenek için u-track analizinden elde edilen çıktıyla utrack_Int (Ek Kodlama Dosyası 2) MATLAB paketini kullanın.
- Doğru protein kompleksi stokiyometrisini tahmin etmek için biyomoleküllerin florofor etiketleriyle eksik etiketlenmesi için bir düzeltme yapın. Konsantrasyonu tahmin etmek için boya ve protein emilimini ölçer ölçerek bir UV-VIS spektrofotometresi ile etiketleme verimliliğini belirleyin. Etiketleme verimliliğini, boyanın proteine molar oranı olarak hesaplayın.
NOT: Bazı boyalar ayrıca 280 nm'ye yakın dalga boylarında da emilir ve bu nedenle, boyanın bu absorpsiyon katkısı konsantrasyon hesaplaması sırasında hesaba katılmalıdır. - Adım 6.2.2'deki adım sayımından elde edilen verilerle MATLAB kod Step_correction (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanarak floroforun eksik etiketleme verimliliğini aşağıdaki şekilde hesaba katmak için bir binom düzeltmesi gerçekleştirin. Örneğin, dodecamerik halka benzeri bir yapı oluşturan Cytolysin A gibi gözenek oluşturan bir toksin için, aşağıdaki formülü kullanarak bir binom düzeltmesi uygulayın:
nk
burada
= etiketleme verimliliği, n = fotobeyazlatma adımlarının sayısı ve s = gerçek sayımlar. Düzeltilmiş oligomerik türleri kurtarmak için MATLAB rutin Stepcount_immobile kullanın. Oligomerlerin (si) frekansını kütle fraksiyonlarına dönüştürün (Şekil 7C; Ek Kodlama Dosyası 2).
NOT: İzlediğiniz çözümlenmiş dosyalar kümesi Ek Kodlama Dosyası 3'te bulunur. Ek Kodlama Dosyası 2'deki MATLAB kodları bu veri kümeleriyle çalıştırılabilir.
= etiketleme verimliliği, n = fotobeyazlatma adımlarının sayısı ve s = gerçek sayımlar. Düzeltilmiş oligomerik türleri kurtarmak için MATLAB rutin Stepcount_immobile kullanın. Oligomerlerin (si) frekansını kütle fraksiyonlarına dönüştürün (Şekil 7C; Ek Kodlama Dosyası 2).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ClyA proteininin PEGile membranlara bağlanmasının izlenmesi
Adım 4.5'ten sonra, bağlanma kinetiği, zaman içinde membran yüzeyine bağlanan parçacıkların sayısını çizerek tahmin edilir (Video 1). ClyA proteini% 5 mol% PEG2000 lipitli bir zara bağlandığında, parçacık yoğunluğu artar ve doygunluğa ulaşır (Şekil 5). Bağlı parçacıklara (camgöbeği daireleri) uyan üstel bir bozunum, membran bağlanması için zaman sabitini (τb) verir (özellikle, başlangıç zaman noktaları [kırmızı daireler] bu durumda uygun değildir).
DNA izleyicinin kalabalık membranlarda hareketliliği
PEG aracılı kalabalıklaşma altında membranı karakterize etmek için DNA izleyicileri (bir tokoferol ile membrana tutturulmuş DNA), lipofilik izleyici boyaları (örneğin, DiI) veya membran proteinlerini (örneğin, ClyA) yaygın olarak kullanıyoruz. Etiketli izleyici moleküllerin (25-100 pM) yanal difüzyonu, parçacık bağlanması üzerine membranın görüntülenmesiyle izlenebilir. Membranda herhangi bir PEG polimerinin yokluğunda, çoğu izleyici (özellikle çift katmanın dışına uzananlar) SLB'ler üzerinde sınırlı difüzyon gösterir (Şekil 6A). Membrandaki küçük PEG2000 seviyeleri (% 0.5-2 mol) ile, çift katman altta yatan yüzeyden uzaklaşır ve izleyici molekülleri kısıtlama olmaksızın yayılabilir. Öte yandan, PEG moleküllerinin yoğun bir fırça rejiminde olduğu ve aralarında çeşitli davranışlar sergilenen yüksek bir PEG konsantrasyonunda (% 20 mol) aşırı hapsedilme gözlenir. Bu üç koşul için MSD grafikleri Şekil 6B'de gösterilmiştir. POPC/DOPE-PEG2000 çift katmanlı membranların karakterizasyonuna dayanarak, mantar rejiminde kalabalığa neden olan 1-3 mol% DOPE-PEG2000 fraksiyonunu öneriyoruz. % 7.5 mol PEG2000-lipidin üzerinde, fırça rejiminin başlangıcını gözlemleriz ve kalabalıklaşmayı ve hapsolmayı indüklemek için% 25 mol PEG2000-lipide kadar bileşimler kullanılabilir. İki rejim arasındaki geçişe karşılık gelen müdahale eden %4-7 PEG2000-lipid koşulları zayıf karakteristiktir ve kaçınılmalıdır.
ClyA'nın kalabalık membranlara montajı
Kalabalık membran üzerinde inkübasyondan sonra ClyA proteininin bireysel kırınım sınırlı noktalarının yoğunluk yörüngeleri (Şekil 7A, B), çok sayıda farklı fotobeyazlatma adımı gösterir ve bu da çeşitli montaj ara ürünlerinin oluşumunu düşündürür31. Bir transmembran proteini olan ClyA, PEG yokluğunda negatif yüklü cam yüzeyle etkileşime girer ve çok zayıf bir şekilde birleşir. % 7.5 mol PEG2000 lipitlerinde, monte edilen kompleksler ölçülmüş ve Şekil 7C'de çizilmiştir. Etiketleme verimliliğini düzelttikten sonra (bu durumda 0.9), oligomerlerin son dağılımı, dodecamerik ClyA türlerini yapısal verilerle tutarlı olarak baskın yapı olarak gösterir32.
Şekil 1: Temizleme adımları ve mikroakışkan oda tertibatı için şematik. (A) Cam slaytlar ve kapak kaymaları, deterjan, aseton, metanol, KOH ve piranha çözeltisinde sıralı sonikasyon ile temizlenir ve her adım arasında tip 1 ultra saf su ile çoklu durulama yapılır. Slaytlar ve kapak kapakları daha sonra plazma işleminden önce azot gazı ile kurutulur. (B) Mikroakışkan görüntüleme odası daha sonra sürgüyü kapak kapağına bağlayan önceden kesilmiş çift taraflı bir yapışkan bant kullanılarak monte edilir. * Akrilik slaytlar piranha çözeltisi ile muamele edilmez ve aseton, metanol ve KOH, kapak kayması temizliği için kullanılanın% 50'lik (v / v) konsantrasyonunda kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: TIRF mikroskop kurulumu. Ters çevrilmiş mikroskop üzerine uyarlanmış tipik bir objektif tip TIRF mikroskop kurulumu, temel optikler vurgulanarak gösterilmiştir. M1-M5, lazer ışınını yönlendirmek için aynalardır. L1 ve L2 lensleri lazer ışınını genişletmek için kullanılır ve L3 lens, lazer ışınını objektif lensin arka odak düzlemine odaklar. I1 ve I2, lazer ışınını hizalamak için kullanılan Iris diyaframlarıdır. Floresan moleküllerinin gereksiz fotobeyazlatmasını önlemek için kritik öneme sahip lazer ışını aydınlatmasını kontrol etmek için bir deklanşör kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Membran bağlama kinetiği akış kurulumu. Bağlama deneyini yürütmek için, numuneyi bir şırınga pompası yardımıyla akıtmak için ince bir PTFE borusu (ID'de 0.022 x OD'de 0.042) kullanılır (görüntü ölçeklenemez). Borunun ucu, bir mikropipet ucu yardımıyla görüntüleme odası çıkışına bağlanır. Atma, prize takılı küçük bir mikro uç haznesinde toplanır ve verilen hacim her zaman görüntüleme odasının hacminin 10 katından fazladır. Görüntüleme odasının kesitini gösteren iç kısım şekli. (görüntü ölçeklendirilmemelidir) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tek parçacıklı yörüngelerden ve fotobeyazlatma filmlerinden analiz için boru hattı. (A) Elde edilen filmler, yörüngeleri (x, y) ve her bir parçacığın yoğunluklarını (i) kare kare elde etmek için MATLAB'da u-track kullanılarak analiz edildi. Bu yörüngeler daha sonra anlık kare yer değiştirmeyi (ISD), ISD1 ve ISD2'yi hesaplamak için kullanıldı. ISD'ler daha sonra mobil türleri tanımlamak için histogramlar olarak çizilebilir. Alternatif olarak, ortalama kare yer değiştirme (MSD) grafikleri, hareketin Gaussian, sınırlı veya süper difüzyonlu33,34 olup olmadığını bildirir. Gizli Markov Model35 (HMM) analizi, tek bir parçacığın farklı difüzyon durumlarını ayırt etmek için kullanılabilir. (B) Fotobeyazlatma analizi için, filmler önce sistemdeki sürüklenme için düzeltildi (gerekirse), ardından u-track kullanılarak parçacık algılama veya izleme yapıldı. Yoğunluk dağılımı 23'ü (ve diğer parçacık özelliklerini) tahmin etmenin yanı sıra, yoğunluk yörüngeleri, adım bulma algoritmaları36,37,38 kullanılarak fotobeyazlatma adımlarının sayısı için analiz edilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: ClyA'nın desteklenen lipit membranlarına %5 mol DOPE-PEG2000 ile bağlanması. Tipik bir bağlanma eğrisi, u-track tarafından tanımlanan her çerçevedeki parçacık sayısını saydıktan sonra elde edilir. Membran bağlayıcı ClyA proteininin akışından önce görüntüleme başlatılır. Parçacık sayılarına (camgöbeği daireleri) uyan üstel bir bozunma fonksiyonu (siyah çizgi), ClyA'nın membrana bağlanması için zaman sabitini geri kazanmak için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Lipofilik DNA'nın PEG-lipid çift katmanlı membranlar üzerindeki hareketliliği . (A) POPC/DOPE-PEG2000 membranındaki lipofilik DNA izleyici için şematik gösterilmiştir. (B) Farklı PEG-SLB'ler için tek parçacık izlemeden hesaplanan ortalama kareli yer değiştirmeler gösterilir. % 2 mol DOPE-PEG2000'de, DNA izleyici, polimerin yokluğunda engellenmiş hareketliliğe kıyasla saf Brownian davranışı gösterir (kesikli çizgi referans için dahil edilmiştir). Öte yandan, aynı DNA izleyici saf Brownian difüzyonundan uzaklaşır ve %20 mol DOPE-PEG2000 varlığında hareketliliği azaltılmış alt difüzyonu gösterir. (C) İki farklı PEG2000 lipid membranında lipofilik DNA izleyicisinin difüzyonu için ISD2 dağılımı çıplak SLB'lerle karşılaştırılmıştır .
Şekil 7: Fotobeyazlatma izleri ve ClyA'nın lipid çift katmanlı membranlar üzerine montajı . (A,B) Temsili zaman izleri, adım 6.2.1'de tespit edilen ClyA nanopore kompleksinin fotobeyazlatma adımlarını göstermektedir. sırasıyla 7 ve 5 adımlı monte edilmiş bir ClyA kompleksi için. (C) 37 °C'de 60 dakika boyunca %64,7 POPC:% 27,8 Kolesterol:% 7,5 DOPE-PEG2000 membran üzerinde inkübe edilen ClyA (25 nM) için fotobeyazlatma adımı dağılımı (gri) gösterilmiştir. Eksik etiketleme etkinliği düzeltildikten sonra, çeşitli oligomerik türlerin (macenta) tahmini kütle fraksiyonu gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: ClyA'nın membran üzerine bağlanması. %5 mol DOPE-PEG2000 içeren SLB membranına bağlanan Cy3 etiketli ClyA proteininin izlenmesi. Bağlı parçacıklar u-track tarafından algılanır (camgöbeği daireleri) ve izler yörüngelerinde sonraki beş pozisyon için çizilir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 2: DNA izleyicinin %2 mol PEG membranı üzerine difüzyonu. 2 mol% PEG2000 membranındaki tokoferol yoluyla lipit membranına tutturulmuş Cy3 etiketli DNA için bir film. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 3: Fotobeyazlatma filmi. Membran üzerinde Cy3 etiketli ClyA moleküllerinin monte edilmiş oligomerlerinin% 7.5 mol% DOPE-PEG2000 içeren bir filmi. Daha büyük kompleksler, tek bir proteine kıyasla birkaç kat daha yüksek yoğunluklardan ve ayrıca sürekli aydınlatma altında zaman içinde parçacık yoğunluğu gözlendiğinde çoklu fotobeyazlatma adımlarından belirgindir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 1: Adım 6'da u-track ve farklı MATLAB kodlarının nasıl kullanılacağı hakkında bilgi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyası 1: Akrilik slaytta delik açmak ve tüm slayt için bant kesmek için temsili bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyaları 2: Adım 6'da görüntü ve veri analizi için gereken ilişkili MATLAB kodlarını içeren sıkıştırılmış klasör. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyaları 3: Adım 6'da görüntü ve veri analizi için örnek veriler. MATLAB kodları https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis'da da mevcuttur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, membrana gömülü biyomoleküller için kalabalık bir ortam ortaya koyan desteklenen lipit çift katmanları (SLB'ler) üzerinde tek moleküllü deneyler gösteriyoruz. Kalabalık ortam, dışlanmış bir hacim etkisi yaratır ve biyomoleküler reaksiyonlarınartmasına yol açar 1,2,39,40. Polimerin öncelikle çift katmanın dışındaki hacmi kapladığı PEG-lipid sistemi için, bu etki özellikle büyük ekto-alanlara sahip moleküler türler için belirgindir. Bu nedenle, lipofilik boyalarla karşılaştırıldığında, reseptörler, glikoproteinler ve glikolipidler gibi zara gömülü büyük bir hidrofilik molekülün difüzyonu önemli ölçüde azaltılabilir. Tokoferol yoluyla membrana tutturulmuş floresan izleyici DNA'sını kullanarak (Şekil 5), bu tür kalabalıklaşma etkilerini tanımlayabiliriz.
Ayrı olarak, alt broşürde PEG varlığı da SLB'yi kaldırır ve biyomoleküllerin destek substratı14,41 ile etkileşimini azaltır. Genellikle, görüntüleme camı yüzeyinin negatif yüklü yüzeyi sıklıkla hareketliliği ve moleküler reaksiyonları engeller. Bu nedenle, membranı camdan uzaklaştırmak için PEG-lipitlerin kullanılması, kalabalıklaşma amacıyla olmasa bile avantajlıdır. Bununla birlikte, bu durumlarda moleküler kalabalık göstermeyen konsantrasyon rejimlerini tanımlamak için dikkatli olunmalıdır. Çift katmanın dışına daha büyük alanlar genişleten proteinler için, PEG5000 gibi daha yüksek moleküler ağırlıklı bir PEG-lipitin kullanılması gerekli olabilir42.
SLB sistemlerindeki tek moleküllü görüntüleme için birkaç önemli nokta kritik öneme sahiptir. Slaytların ve kapak kapaklarının titizlikle temizlenmesi, tek moleküllü deneylerde kritik öneme sahiptir (adım 1). Kirliliklere sahip bir yüzeyin görüntülenmesi, lipit zarında kusurlara neden olacaktır. Bu, membran yüzeyinde floresan olarak etiketlenmiş biyomoleküllerin yamalarına neden olabilir. Oluşan SLB'nin kapsamı ve homojenliği, çift katmanlı bir lipit boyası (DiI veya Lissamine Rhodamine DOPE) ile dopinglenerek ve bir floresan mikroskobu altında görüntülenerek ayrı bir preparatta doğrulanabilir. FRAP analizi, difüzyon davranışını karşılaştırmak için de kullanılabilir43,44.
Membran bağlama deneyleri için (adım 4), hava kabarcıklarının odaya girmesini önlemek için boru ile akış astarlanması gerekir. Daha yüksek akış hızları veya hava kabarcıklarının varlığı zarı yırtacak ve moleküller doğrudan kapak kaymasına bağlanacaktır. Görüntü toplama, akış başlamadan önce başlamalıdır, çünkü bazı moleküller borudan yayılır ve membrana bağlanır. Görüntüleme sırasında hedefi çift katmana odaklamak, çift katmanı altın nanopartiküller, kuantum noktaları veya floresan boncuklarla düşük konsantrasyonda dopingleyerek kolaylaştırılabilir.
Tek parçacık izleme deneyleri için, parçacık yörüngelerinin aşırı örtüşmesi nedeniyle izlemenin zor olduğu bir senaryodan kaçınmak için membran üzerindeki parçacık sayısı kontrol edilmelidir. Görüntüleme sırasında göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli faktör lazer gücüdür. Yüksek bir lazer gücü, floroforları hızlı bir şekilde fotobeyazlatırken, düşük yoğunluk ve buna karşılık gelen yavaş görüntü yakalama oranları bulanıklığa neden olur. Optimum lazer gücü, simetrik ve parçacıkların kırınım sınırlı görüntülerine yakın bir şekilde korunurken önemli bir yörünge uzunluğu (ortalama olarak en az >5) sağlamalıdır. Floroforların fotobeyazlatmasını uzatmak için bir oksijen süpürme sistemi de kullanılabilir45. Burada sunulan fotobeyazlatma analizinin bir sınırlaması, nükleer gözenek kompleksi 47 gibi büyük moleküler montajlar (~ 20 alt birimden büyük) durumunda37,46 ortaya çıkmaktadır. Bu gibi durumlarda, 48,49,50 alt birim popülasyonunu çıkarmak için Bayes temelli bir yaklaşım kullanılabilir.
Çoğu durumda biyomoleküllerin floroforlarla etiketlenmesi tam değildir51. Bu, etiketlenmemiş türlere sahip bir kümedeki alt birimlerin sayılmasında bir zorluk teşkil eder. Alt par etiketleme verimliliği için binom düzeltmesi, moleküler türlerin stokiyometrisi sabitlendiğinde genellikle makul bir yaklaşımdır. Birçok durumda, oligomerik türler, oligomerizasyon sürecinde olduğu gibi, fotobeyazlatma verilerinden altta yatan dağılımları çıkarmak için yeni araçların geliştirilmesini gerektiren heterojen veya dinamik olarak değişebilir.
Genel olarak, bu protokol, tek moleküllü bağlanmayı kullanma, gerçekleştirme ve analiz etme koşulları ve membran biyomolekülleri için fotobeyazlatma analizini izleme ve gerçekleştirme koşulları için önerilerle birlikte PEG-SLB'ler üretmek için bir boru hattı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, ClyA proteini için plazmid ekspresyonunu paylaştığı için Prof. Benjamin Schuler'e teşekkür ediyor. Bu çalışma Human Frontier Science Program (RGP0047-2020) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 ml Syringes | HMD Healthcare | Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin | Plastic syringe |
| Acetone | Finar Chemicals | 10020LL025 | |
| Acrylic Sheet | 2 mm thick | ||
| Acrylic Sheet | BigiMall | 2 mm, Clear | |
| Bath Sonicator | Branson | CPX-1800 | |
| Calcium Chloride | |||
| Chloroform | Sigma | 528730 | HPLC grade |
| Cholesterol | Avanti | 700100 | |
| Coplin Jar | Duran Wheaton Kimble | S6016 | 8 Slide Jar with Glass Cover |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | 24 mm X 50 mm |
| Cy3-DNA Strand | IDT | GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3 |
|
| Cyanine Dye (Cy3) | Cytiva Life Sciences | PA23001 | |
| DiI | Invitrogen | D3911 | Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) |
| DNA Connector Strand 1 | Sigma Aldrich | GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T |
|
| DNA Connector Strand 2 | Sigma Aldrich | CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT |
|
| DNA Tocopherol Strand | Biomers | Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA | |
| DOPE-PEG2000 | Avanti | 880130 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| Double Sided Tape | 3M | LF93010LE | |
| Drill Bits (Diamond Coated) | 0.5 - 1 mm | ||
| Drilling Machine | Dremel | 220 | Workstation |
| EMCCD | Andor | DU-897U-CS0-#BV | |
| Fluorescence Beads | Invitrogen | F10720 | |
| Glass Slides | Blue Star | Micro Slides, PIC-1 | |
| Glass Vials | Sigma | 854190 | |
| Hydrogen Peroxide | Lobachemie | 00182 | 30% Solution, AR Grade |
| Labolene | Thermo-Fischer Scientific | Detergent | |
| Laser 532 nm | Coherent | Sapphire | |
| Laser Cutter | Universal Laser Systems | ILS12.75 | |
| Lissamine Rhodamine DOPE | Avanti | 810150 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) |
| Methanol | Finar Chemicals | 30932LL025 | |
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | 1X | ||
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma Inc | PDC-002 | |
| POPC | Avanti | 850457 | 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine |
| Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE1010 | High Pressure Syringe Pump |
| PTFE Caps | Sigma | 27141 | |
| PTFE Tubing | Cole-Parmer | WW-06417-21 | Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD |
| Sulphuric Acid | SD Fine Chemicals | 98%, AR Grade | |
| TIRF Objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | |
| Vacuum Desiccator | Tarsons | ||
| Vortex Mixer | Tarsons |
References
- Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
- Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
- Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
- Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
- Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
- Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
- Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
- Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
- Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
- Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
- Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
- Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
- Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
- Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
- Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
- Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
- Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
- Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
- Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
- Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
- Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
- Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
- Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
- Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
- Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
- Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
- Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
- Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
- Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
- Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
- Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
- Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
- Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
- Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
