Summary
Het huidige protocol beschrijft het gebruik van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) om de associatie en dissociatiekinetiek van de binding tussen een DNA-aptamer en tetracycline te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, lopende normen en monsters, en het interpreteren van de resulterende gegevens.
Abstract
De bepaling van bindingsaffiniteit en gedrag tussen een aptamer en zijn doel is de meest cruciale stap bij het selecteren en gebruiken van een aptamer voor toepassing. Vanwege de drastische verschillen tussen het aptamer en kleine moleculen, moeten wetenschappers veel moeite doen om hun bindende eigenschappen te karakteriseren. Isothermische titratiecalorimetrie (ITC) is hiervoor een krachtige aanpak. ITC gaat verder dan het bepalen van disassociatieconstanten (Kd) en kan de enthalpieveranderingen en bindende stoichiometrie van de interactie tussen twee moleculen in de oplossingsfase leveren. Deze benadering voert continue titratie uit met behulp van labelvrije moleculen en registreert de vrijgekomen warmte in de loop van de tijd bij de bindingsgebeurtenissen die door elke titratie worden geproduceerd, zodat het proces de binding tussen macromoleculen en hun kleine doelen gevoelig kan meten. Hierin introduceert het artikel een stapsgewijze procedure van de ITC-meting van een geselecteerde aptamer met een klein doelwit, tetracycline. Dit voorbeeld bewijst de veelzijdigheid van de techniek en het potentieel ervan voor andere toepassingen.
Introduction
Aptameren zijn ssDNA- of RNA-fragmenten geselecteerd via een evolutieproces met een hoge bindingsaffiniteit en specificiteit voor de gewenste doelen 1,2, die kunnen werken als geavanceerde herkenningselementen of chemische antilichamen 3,4,5. De bindingsaffiniteit en specificiteit van aptameren aan hun doelen spelen dus een cruciale rol bij de selectie en toepassing van een aptamer, en isotherme titratiecalorimetrie (ITC) is op grote schaal gebruikt voor deze karakteriseringsdoeleinden. Veel benaderingen zijn gebruikt om de affiniteit van aptameren te bepalen, waaronder ITC, oppervlakteplasmonresonantie (SPR), colorimetrische titratie, thermoforese op microschaal (MST) en Bio-Layer Interferometry (BLI). Onder hen is ITC een van de nieuwste technieken om de thermodynamische en kinetische associatie van twee moleculen in de oplossingsfase te bepalen. Deze benadering voert continue titratie uit met behulp van labelvrije moleculen en registreert de vrijgekomen warmte in de loop van de tijd bij de bindingsgebeurtenissen die door elke titratie worden geproduceerd 6,7. In tegenstelling tot andere methoden kan ITC bindingsaffiniteit, verschillende bindingsplaatsen en thermodynamische en kinetische associatie bieden (figuur 1A). Op basis van deze initiële parameters worden de Gibbs vrije energieveranderingen en entropieveranderingen bepaald met behulp van de volgende relatie:
ΔG = ΔH-TΔS
Dat betekent dat ITC een compleet thermodynamisch profiel van de moleculaire interactie biedt om de bindingsmechanismen op te helderen (figuur 1B). Het bepalen van de bindingsaffiniteit voor kleine moleculen met een aptamer is moeilijk vanwege de drastisch verschillende groottes tussen aptamer en target. Ondertussen kan ITC gevoelige metingen uitvoeren zonder moleculen te labelen en te immobiliseren, wat een middel biedt om de natuurlijke structuur van het aptamer en het doel tijdens de meting te behouden. Met de genoemde attributen kan ITC worden gebruikt als de standaardmethode voor de karakterisering van binding tussen een aptamer en kleine doelen.
Na selectie door de Gu-groep werd deze aptamer geïntegreerd met verschillende platforms, waaronder elektrochemische op aptamer gebaseerde biosensoren, een competitieve enzymgebonden aptamer-assay en een microtiterplaat, die detectie met hoge doorvoer van tetracycline 8,9,10 kan bereiken. De bindingseigenschappen zijn echter niet goed genoeg opgehelderd om het juiste platform te kiezen8; het is de moeite waard om de binding van het aptamer aan het tetracycline te karakteriseren met behulp van ITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Figuur 2 toont de belangrijkste stappen van het ITC-experiment voor het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline.
1. Bereiding van monsters
OPMERKING: Monsters voor ITC moeten in dezelfde buffer worden bereid voor zowel het aptamer als het ligand om warmteafgifte te voorkomen die wordt veroorzaakt door het mengen van verschillende buffers uit de monstercel en spuit. Dit wordt meestal bereikt door dialyse van alle materialen in dezelfde buffer. De buffer wordt uitgewisseld met behulp van een protocol dat is aangepast aan het protocol van een 3 kDa molecular weight cutoff (MWC) concentrator met enkele wijzigingen, zoals hieronder:
- Activeer het membraan van de dialysekolom (3 kDa MWC) met 1x PBS, pH 7,4, gekocht bij de fabrikant, met behulp van de volgende stappen: vul met 1x buffer (PBS), equilibraat gedurende 10 minuten bij RT en centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 15 minuten.
- Verwijder de buffer en laad 500 μL aptamermonsters in de kolom, centrifugeer bij 5.000 x g en herhaal deze 4x om de oorspronkelijke buffer te vervangen door 1x PBS. Wanneer de buffer door het membraan gaat, zullen alle moleculen met een massa van minder dan 3 kDa door het membraan gaan en zal het aptamer aan de bovenzijde van het membraan blijven.
- Verzamel de gedialyseerde DNA-aptamer met behulp van een pipet en breng deze over naar de nieuwe buis (en) van 1,5 ml.
- Verzamel de laatste flowthrough buffer om tetracycline op te lossen. Tetracycline poeder is puur en klein, dus dialyse is niet nodig. Gebruik echter de vorige gedialyseerde buffer voor DNA voor het doelwit om ervoor te zorgen dat de buffer voor het experiment in de spuit overeenkomt met de buffer in de referentiecel.
- Bepaal de aptamerconcentratie opnieuw met behulp van een UV-zichtbare spectrometer. Gebruik de laatste uitwisselingsbuffer om de concentratie aan te passen aan 40 μM tetracycline en 2 μM aptamer.
- Vouw het DNA-aptamer door gedurende 10 minuten te verwarmen op 90 °C, gedurende 10 minuten af te koelen bij 4 °C en vervolgens gedurende 20 minuten terug te keren naar RT.
- Ontgas het gevouwen aptamer en het gedialyseerde tetracycline met behulp van een ontgassingsstation of vacuümpomp ingesteld op 600 mmHg bij 25 °C gedurende 25 minuten om opgeloste gassen te elimineren.
2. Het instrument wassen en de testkit uitvoeren
- Reinig de oplosmiddelpoorten om ervoor te zorgen dat het volledige monsterpad vrij is. Reinig door de afvaloplossing weg te gooien en te laden met pure methanol, water en buffer. Elke poort bevat meer dan 250 ml om voldoende oplossing voor reiniging te garanderen.
OPMERKING: Het reinigingsproces wordt automatisch voltooid door door de gebruiker programmeerbare ITC-besturingssoftware. - Test de reinheid van de machine door ITC met behulp van buffer in een buffer uit te voeren (d.w.z. 1x PBS in 1x PBS).
OPMERKING: Een normale ruisbasislijn is zichtbaar tussen de kleine buffer in bufferinjectiepieken. Wanneer de titratiespuit en canules voldoende zijn gereinigd en volledig droog, zal de basislijn stabiel zijn; een toename of afname van de basislijn weerspiegelt vuile instrumentatie of bellen in het instrument, die moeten worden gecorrigeerd voordat de werkelijke monsters worden uitgevoerd. - Test de nauwkeurigheid van de machine met een standaardkit met EDTA en CaCl2 (figuur 3), met behulp van het standaardprogramma en volgens de instructies van de fabrikant.
3. Het monster uitvoeren om de binding tussen aptamer en tetracycline te bepalen
- Stel de loopparameters in: een roersnelheid van 200 tpm, draaiend op 25 °C, 2 μM aptamer en 40 μM tetracycline, 30 injecties met elk 2,0 μL, een vertragingstijd van 180 s.
- Controleer de vereiste volumes met behulp van een actieve programmacalculator. Voer met deze lopende parameter ITC-metingen uit met 230 μL 40 μM tetracycline in de ITC-spuit en 485 μL 2 μM aptamer in de ITC-monstercel met behulp van de ITC.
- Laad de gedialyseerde tetracycline spuitplaten en het gevouwen aptamer in de monstercel en vermijd bubbels met behulp van een pipet.
- Begin met het uitvoeren van het ITC-instrument door op de startknop in de software te klikken.
OPMERKING: Het ITC-instrumentproces is volledig geautomatiseerd na het handmatig vullen van de referentiecel- en titrantmonsterplaten.
4. Gegevens analyseren met behulp van software
- Open de data-analysesoftware door te dubbelklikken om te beginnen met het analyseren van de gegevens.
- Open het pad van de opgeslagen onbewerkte gegevens om de neiging tot binding te kennen.
- Open het tabblad Modellering en gebruik verschillende bindingsmodellen om de beste pasvorm voor de gegevenscurve te vinden. Vervolgens berekent de software automatisch het ITC-thermogram en verschillende thermodynamische parameters, waaronder enthalpie (ΔH), entropie (ΔS), vrije energie (ΔG), evenwichtsbindingsconstante (Ka) en stoichiometrie.
- Verzamel de thermodynamische parameters die worden bepaald op basis van de gegevens en de informatie over het montagemodel.
- Maak een rapport, inclusief afbeeldingen van het ITC-thermogram en verschillende thermodynamische parameters, zoals weergegeven in figuur 4 en tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ITC biedt een nauwkeurige disassociatieconstante (Kd), de bindingsstoichiometrie en de thermodynamische parameters van interacties met twee moleculen6. In dit voorbeeld bindt de aptamer geselecteerd door Kim et al.9,11 aan tetracycline met bindingsaffiniteiten van Kd 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Interessant is dat deze binding werd bepaald met behulp van de evenwichtsfiltratiemethode en een gerapporteerde Kd van 63,3 nM, wat niet veel verschilt van de gunstige bindingsplaats (site 2). Het aanpassingsmodel en de stoichiometrie van ITC geven aan dat het aptamer bindt aan tetracycline door middel van een bindingsverhouding van 2:1 met het sequentiële bindingsmodel (figuur 4, tabel 1).
De thermodynamische parameters bepaald door ITC-meting voor plaats 2 (ΔH = -1200 kcal/mol en -TΔS = 99,75 kcal/mol) gaven aan dat enthalpie die relatief significant entropisch verlies overwint, de sterke binding aandrijft. De enthalpie-gedreven binding met entropieverlies heeft betrekking op de RNA-conformatieveranderingen, die zijn gerapporteerd als bindingsgedrag tussen RNA en een klein molecuul. Thoa et al. rapporteerden bijvoorbeeld dergelijk bindingsgedrag (ΔH = -27 kcal/mol en -TΔS = +17 kcal/mol) tussen een RNA-aptamer en Ru(bpy)312. Bovendien gaven Horowitz et al. aan dat entropie-gedreven binding geassocieerd is met de intercalatie van proflavine tot een oligonucleotide (ΔH = -2,6 kcal/mol en -TΔS = -3,3 kcal/mol)13. Op basis van deze vergelijkingen functioneert de aptamer met schakelstructureel gedrag op enthalpie-gedreven binding, waardoor het aptamer kan worden gebruikt als herkenning voor de ontwikkeling van een eenvoudige sensor.
Figuur 1: Bindingsdisassociatieconstante (Kd) en thermodynamisch profiel. (A) ITC identificeert de bindingsdisassociatieconstante (Kd) en het thermodynamische profiel, inclusief verandering in enthalpie (ΔH) en verandering in entropie (ΔS). (B) Het thermodynamische profiel zorgt voor de sterkte en het mechanisme van interactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Belangrijkste stappen van het ITC-experiment. Het schema toont de belangrijkste stappen van het ITC-experiment voor het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: ITC-standaardtest tussen EDTA en CaCl2. De Ca2+-EDTA chelatie is gebruikt als standaardreactie om ITC te valideren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: ITC thermogram van een DNA aptamer en tetracycline. Het aanpassingsmodel van thermodynamische en kinetische associatie weerspiegelt dat de binding twee onafhankelijke bindingsplaatsen heeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Opeenvolgende twee sites | Kd (M) | 1,359 x 10-5 |
| Kd (M) | 5,378 x 10-8 | |
| ΔH (kcal/mol) | 1223 | |
| ΔH (kcal/mol) | -1200 | |
| Ka (Mˉ¹) | 7,358 x 104 | |
| Ka (Mˉ¹) | 1,859 x 107 | |
| ΔS (cal/mol K) | 4,123 x 103 | |
| ΔS (cal/mol K) | -3,992 x 103 |
Tabel 1: Parameters van de binding tussen aptamer en tetracycline. Verschillende thermodynamische parameters, waaronder enthalpie (ΔH), entropie (ΔS), vrije energie (ΔG), evenwichtsbindingsconstante (Ka) en stoichiometrie, kunnen worden bepaald door het bindingsmechanisme van twee moleculen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde methode is aangepast volgens de instructies van TA Instruments en is voldoende om de bindingsaffiniteit en thermodynamica van veel geselecteerde aptameren en doelen in ons centrum te bepalen. Cruciale stappen uit deze procedure zijn onder meer het uitwisselen van de buffer om een doel te hebben dat overeenkomt met het ligand, het uitvoeren van monsters met de juiste parameters en het vinden van het juiste bindingsmodel om de gegevens te analyseren. Continue registratie van warmteafgifte vereist het elimineren van alle geluidswarmte, zoals van mismatch van de buffer, vuilheid van de cel en spuit en bubbels in de monsters. In de bufferuitwisselingsstap is het beter om de laatste dialysebuffer of doorstroombuffer in het dialysemembraan of de spinkolom te gebruiken om het ligand op te lossen, omdat het duur is om kleine moleculen rechtstreeks uit te wisselen.
De meeste andere bindingsaffiniteitsbepalingsmethoden gaan uit van een bindingsverhouding van 1:1 tussen aptamer en ligand. Vanwege het bindingsgedrag en de drastisch verschillende grootte tussen kleine moleculen en aptameren, is het 1:1 bindingsmodel echter niet altijd nauwkeurig14,15. In dit aspect kan het ITC gegevens geven over de bindingsstoichiometrie om het aantal bindingsplaatsen te kennen en informatie te geven over bindingsgedrag 7,15. Die geavanceerde functie kan worden geleverd door het juiste bindingsmodel uit de ITC-analysesoftware te gebruiken, het bindingsmodel met één of twee locaties. Eén verzadigd punt kan worden geanalyseerd met een andere bindingsverhouding van 1:1 (1 bindingsplaats), 1:2 of 0,5:1 (twee bindingsplaatsen). Voor het sequentiële model is er geen afzonderlijke verzadigde site, maar alleen een totaal aantal verzadigde sites. Als de sites identiek zijn, passen de gegevens bij sequentiële verzadiging. Daar heeft de eerste bindingsplaats meer lege exemplaren van dezelfde soort om uit te kiezen dan de tweede site, zoals blijkt uit de afname van de vrijgekomen warmte-energie van site naar site 14,15,16. De bindingsparameters bepalen de bindingsconstante K voor elke bindingsplaats. In dit geval toont het de binding met twee sequentiële bindingsplaatsen, wat de conformatieverandering in het totale molecuul bevestigt. Hoewel ITC veel geavanceerde functies biedt om de binding tussen het aptamer en kleine moleculen te karakteriseren, kost het optimalisatieproces met goede omstandigheden tijd 7,16,17. Bovendien is ITC-apparatuur in vergelijking met andere instrumenten duur en vereist het behandeling door een goed opgeleide technicus.
In de meeste gevallen is het bepalen van de bindingsaffiniteit tussen een aptamer en een ligand met een klein molecuul een uitdaging. ITC kan worden beschouwd als een geavanceerde methode voor dit doel omdat ITC zeer nauwkeurige bindingsaffiniteiten biedt, evenals thermodynamische informatie. Op basis van deze informatie kunnen we het gedrag ervan voorspellen om het te gebruiken voor klinisch gebruik of detectie. Met de geselecteerde aptamer met twee bindingsplaatsen kunnen we deze bijvoorbeeld afkappen om één bindingsplaats te behouden als één site niet gunstig is voor binding, of we kunnen de aptamer in twee aptameren splitsen als beide bindingsplaatsen hetzelfde gedrag vertonen. Ook kunnen we met conformatiestructuurveranderingsgedrag de aptamer combineren met een blusplatform om een sensor te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de Research and Development Funding van Aptagen LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
