Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) כדי לנתח את קינטיקה של הקשר והדיסוציאציה של הקשירה בין אפטמר DNA לטטרציקלין, כולל הכנת דגימות, הפעלת תקנים ודגימות, ופענוח הנתונים המתקבלים.
Abstract
קביעת זיקה והתנהגות מחייבת בין אפטמר לבין מטרתו היא השלב המכריע ביותר בבחירת אפטמר ליישום ובשימוש בו. בשל ההבדלים הדרסטיים בין האפטמר למולקולות קטנות, מדענים צריכים להשקיע מאמץ רב באפיון תכונות הקשירה שלהן. קלורימטריה איזותרמית של טיטרציה (ITC) היא גישה רבת עוצמה למטרה זו. ITC חורג מקביעת קבועי ההתנתקות (Kd) ויכול לספק את השינויים האנתלפיים ואת הסטויכיומטריה המחייבת של האינטראקציה בין שתי מולקולות בשלב התמיסה. גישה זו מבצעת טיטרציה רציפה באמצעות מולקולות נטולות תוויות ומתעדת חום המשתחרר לאורך זמן על אירועי הקשירה המיוצרים על ידי כל טיטרציה, כך שהתהליך יכול למדוד ברגישות את הקשירה בין מקרומולקולות לבין המטרות הקטנות שלהן. כאן, המאמר מציג הליך שלב אחר שלב של מדידת ITC של אפטמר נבחר עם מטרה קטנה, טטרציקלין. דוגמה זו מוכיחה את הרבגוניות של הטכניקה ואת הפוטנציאל שלה ליישומים אחרים.
Introduction
Aptamers הם מקטעי ssDNA או RNA שנבחרו בתהליך אבולוציה עם זיקה וספציפיות גבוהה ליעדים הרצויים 1,2, שיכולים לעבוד כיסודות זיהוי מתקדמים או נוגדנים כימיים 3,4,5. לפיכך, זיקתם וספציפיותם של האפטמרים למטרותיהם ממלאות תפקיד מכריע בבחירה וביישום של אפטאמר, וקלורימטריה איזותרמית של טיטרציה (ITC) נמצאת בשימוש נרחב למטרות אפיון אלה. גישות רבות שימשו לקביעת הזיקה של אפטמרים, כולל ITC, תהודת פלסמון פני השטח (SPR), טיטרציה צבעונית, תרמופורזה בקנה מידה זעיר (MST) ואינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI). ביניהם, ITC היא אחת הטכניקות האחרונות כדי לקבוע את הקשר התרמודינמי והקינטי של שתי מולקולות בשלב התמיסה. גישה זו מבצעת טיטרציה רציפה באמצעות מולקולות נטולות תוויות ומתעדת חום המשתחרר לאורך זמן על אירועי הקשירה המיוצרים על ידי כל טיטרציה 6,7. בניגוד לשיטות אחרות, ITC יכול להציע זיקה מחייבת, מספר אתרי קשירה וקשר תרמודינמי וקינטי (איור 1A). מפרמטרים ראשוניים אלה, השינויים באנרגיה החופשית של גיבס ושינויי האנטרופיה נקבעים באמצעות הקשר הבא:
ΔG = ΔH-TΔS
משמעות הדבר היא ש-ITC מציע פרופיל תרמודינמי מלא של האינטראקציה המולקולרית כדי להבהיר את מנגנוני הקשירה (איור 1B). קביעת זיקת הקשירה למולקולות קטנות עם אפטמר קשה בשל הגדלים השונים באופן דרסטי בין אפטמר למטרה. בינתיים, ITC יכול לספק מדידה רגישה ללא תיוג ושיתוק מולקולות, מה שמספק אמצעי לשמירה על המבנה הטבעי של האפטמר והמטרה במהלך המדידה. עם התכונות שהוזכרו, ITC יכול לשמש כשיטה סטנדרטית לאפיון קשירה בין aptamer לבין מטרות קטנות.
לאחר בחירה על ידי קבוצת Gu, אפטמר זה שולב עם פלטפורמות שונות, כולל ביוסנסורים מבוססי אפטמר אלקטרוכימיים, בדיקת אפטמר תחרותית הקשורה לאנזים, וצלחת מיקרוטיטר, שיכולה להשיג זיהוי תפוקה גבוהה של טטרציקלין 8,9,10. עם זאת, המאפיינים המחייבים שלה לא הובהרו מספיק טוב כדי לבחור את הפלטפורמה הנכונה8; כדאי לאפיין את הכריכה של aptamer לטטרציקלין באמצעות ITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: איור 2 מציג את השלבים העיקריים של ניסוי ITC לקביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין.
1. הכנת דוגמאות
הערה: יש להכין דגימות עבור ITC באותו חיץ הן עבור האפטמר והן עבור הליגנד כדי למנוע שחרור חום הנגרם על ידי ערבוב מאגרים שונים מתא הדגימה והמזרק. זה מושג בדרך כלל באמצעות דיאליזה של כל החומרים לתוך אותו חיץ. המאגר מוחלף באמצעות פרוטוקול המותאם מהפרוטוקול של רכז חיתוך משקל מולקולרי של 3 kDa (MWC) עם כמה שינויים, כמפורט להלן:
- הפעל את הממברנה של עמודת הדיאליזה (3 kDa MWC) עם 1x PBS, pH 7.4, שנרכש מהיצרן, באמצעות השלבים הבאים: מלא במאגר 1x (PBS), שיווי משקל למשך 10 דקות ב- RT, וצנטריפוגה ב- 5,000 x g למשך 15 דקות.
- הסר את המאגר וטען 500 μL של דגימות aptamer לתוך העמודה, צנטריפוגה ב 5,000 x גרם, ולחזור על זה 4x כדי להחליף את המאגר המקורי עבור 1x PBS. כאשר החיץ עובר דרך הממברנה, כל המולקולות עם מסה קטנה מ -3 kDa יעברו דרך הממברנה, והאפטמר יישאר בצד העליון של הממברנה.
- אסוף את ה-DNA aptamer שעבר דיאליזה באמצעות פיפט והעבר אותו לצינור(ים) החדשים של 1.5 מ"ל.
- אסוף את מאגר הזרימה האחרון כדי להמיס טטרציקלין. אבקת טטרציקלין היא טהורה וקטנה, ולכן אין צורך בדיאליזה. עם זאת, השתמש במאגר הדיאליזה הקודם עבור דנ"א עבור המטרה כדי להבטיח שהמאגר לניסוי במזרק יתאים למאגר בתא הייחוס.
- קבע שוב את ריכוז האפטמר באמצעות ספקטרומטר הנראה לעין UV. השתמש במאגר החליפין האחרון כדי להתאים את הריכוז ל-40 μM טטרציקלין ו-2 μM aptamer.
- קפלו את ה-DNA aptamer על ידי חימום ב-90°C למשך 10 דקות, קירור ב-4°C למשך 10 דקות, ולאחר מכן חזרו ל-RT למשך 20 דקות.
- דגה את האפטאמר המקופל והטטרציקלין המקופל באמצעות תחנת degassing או משאבת ואקום המוגדרת ל-600 מ"מ כספית ב-25 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות כדי לחסל גזים מומסים.
2. שטיפת המכשיר והפעלת ערכת הבדיקה
- נקה את יציאות הממס כדי לוודא שכל נתיב הדגימה ברור. נקו על ידי השלכת תמיסת הפסולת והעמסתה במתנול טהור, מים וחוצץ. כל יציאה מכילה יותר מ -250 מ"ל כדי להבטיח פתרון מספיק לניקוי.
הערה: תהליך הניקוי הושלם באופן אוטומטי על-ידי תוכנת בקרת ITC הניתנת לתכנות על-ידי המשתמש. - בדוק את ניקיון המחשב על-ידי הפעלת ITC באמצעות מאגר לתוך מאגר (כלומר, 1x PBS לתוך 1x PBS).
הערה: קו בסיס רגיל של רעש נראה בין המאגר הזעיר לפסגות הזרקת חיץ. כאשר מזרק הטיטרציה והצינוריות מנוקים כראוי ויבשים לחלוטין, קו הבסיס יהיה יציב; עלייה או ירידה בנקודת ההתחלה משקפת מכשור מלוכלך או בועות בתוך המכשיר, שיש לתקן לפני הפעלת דגימות בפועל. - בדוק את דיוק המכונה באמצעות ערכה סטנדרטית הכוללת EDTA ו- CaCl2 (איור 3), באמצעות תוכנית ברירת המחדל וביצוע הוראות היצרן.
3. הרצת הדגימה לקביעת הקשירה בין אפטמר לטטרציקלין
- הגדר את פרמטרי הריצה: קצב ערבוב של 200 סל"ד, ריצה ב 25 מעלות צלזיוס, 2 μM aptamer ו 40 μM טטרציקלין, 30 זריקות עם 2.0 μL כל אחד, זמן עיכוב של 180 שניות.
- בדוק את אמצעי האחסון הדרושים באמצעות מחשבון תוכנית פועלת. עם פרמטר ריצה זה, בצע מדידת ITC עם 230 μL של 40 μM טטרציקלין במזרק ITC ו 485 μL של 2 μM aptamer בתא הדגימה ITC באמצעות ITC.
- העמיסו את לוחות המזרק טטרציקלין המקופלים ואת האפטמר המקופל לתוך תא הדגימה, תוך הימנעות מבועות, באמצעות פיפטה.
- התחל להפעיל את מכשיר ה- ITC על ידי לחיצה על כפתור התחל בתוכנה.
הערה: תהליך ההפעלה של מכשיר ITC הוא אוטומטי לחלוטין לאחר מילוי ידני של תאי הייחוס ולוחות דגימת הטיטראנט.
4. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה
- פתח את תוכנת ניתוח הנתונים על ידי לחיצה כפולה כדי להתחיל לנתח את הנתונים.
- פתח את הנתיב של הנתונים הגולמיים שנשמרו כדי לדעת את הנטייה של כריכה.
- פתח את כרטיסיית המידול והשתמש במודלי איגוד שונים כדי למצוא את ההתאמה הטובה ביותר לעקומת הנתונים. לאחר מכן, התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את התרמוגרמה של ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים, כולל אנתלפיה (ΔH), אנטרופיה (ΔS), אנרגיה חופשית (ΔG), קבוע קשירת שיווי משקל (Ka) וסטויכיומטריה.
- אסוף את הפרמטרים התרמודינמיים שנקבעו מהנתונים וממידע המודל המתאים.
- צור דוח, הכולל תמונות של התרמוגרמה ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים, כפי שמוצג באיור 4 ובטבלה 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ITC מספק קבוע התנתקות מדויק (Kd), את הסטויכיומטריה המחייבת ואת הפרמטרים התרמודינמיים של אינטראקציות דו-מולקולות6. בדוגמה זו, האפטמר שנבחר על ידי Kim et al.9,11 נקשר לטטרציקלין עם זיקות קשירה של K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. מעניין לציין כי קשירה זו נקבעה באמצעות שיטת סינון שיווי המשקלודיווח על K d של 63.3 ננומטר, שאינו שונה בהרבה מאתר הקשירה החיובי (אתר 2). המודל המתאים והסטויכיומטריה של ITC משקפים את העובדה שהאפטאמר נקשר לטטרציקלין באמצעות יחס קשירה של 2:1 עם מודל הקשירה הרציפה (איור 4, טבלה 1).
הפרמטרים התרמודינמיים שנקבעו על ידי מדידת ITC לאתר 2 (ΔH = -1200 קק"ל/מול ו--TΔS = 99.75 קק"ל/מול) הצביעו על כך שהתגברות על אנתלפיה משמעותית יחסית מניעה את הקשירה החזקה. הקשירה מונחית האנתלפיה עם אובדן האנטרופיה מתייחסת לשינויים הקונפורמיים של הרנ"א, שדווחו כהתנהגויות קשירה בין רנ"א למולקולה קטנה. לדוגמה, Thoa et al. דיווחו על התנהגות מחייבת כזו (ΔH = -27 קק"ל/מול ו--TΔS = +17 קק"ל/מול) בין רנ"א אפטמר לבין Ru(bpy)312. חוץ מזה, הורוביץ ואחרים ציינו כי קשירה מונעת אנטרופיה קשורה לאינטרקלציה של פרופלווין לאוליגונוקלאוטיד (ΔH = -2.6 קק"ל/מול ו--TΔS = -3.3 קק"ל/מול)13. בהתבסס על השוואות אלה, האפטאמר מתפקד עם התנהגות מיתוגית-מבנית על קשירה מונחית אנתלפיה, ומאפשר להשתמש באפטמר כהכרה לפיתוח חיישן פשוט.
איור 1: קבוע התנתקות מחייב (Kd) ופרופיל תרמודינמי. (A) ITC מזהה את קבוע ההתנתקות המקשר (Kd) ואת הפרופיל התרמודינמי, כולל שינוי באנתלפיה (ΔH) ושינוי באנטרופיה (ΔS). (B) הפרופיל התרמודינמי מספק את החוזק והמנגנון של האינטראקציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: השלבים העיקריים של ניסוי ITC. הסכימה מראה את השלבים העיקריים של ניסוי ITC לקביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: בדיקה סטנדרטית של ITC בין EDTA ל-CaCl2. הכלציה Ca2+-EDTA שימשה כתגובה סטנדרטית לאימות ITC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תרמוגרמה של ITC של אפטמר דנ"א וטטרציקלין. המודל ההולם של קשר תרמודינמי וקינטי משקף כי לכריכה יש שני אתרי קשירה עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| רצף שני אתרים | KD (ז) | 1.359 x 10-5 |
| KD (ז) | 5.378 x 10-8 | |
| ΔH (קק"ל/מול) | 1223 | |
| ΔH (קק"ל/מול) | -1200 | |
| Ka (Mˉ¹) | 7.358 x 104 | |
| Ka (Mˉ¹) | 1.859 x 107 | |
| ΔS (קל/מול K) | 4.123 x 103 | |
| ΔS (קל/מול K) | -3.992 x 103 |
טבלה 1: פרמטרים של הכריכה בין אפטמר לטטרציקלין. פרמטרים תרמודינמיים שונים, כולל אנתלפיה (ΔH), אנטרופיה (ΔS), אנרגיה חופשית (ΔG), קבוע קשירת שיווי משקל (Ka) וסטויכיומטריה, יכולים להיקבע על ידי מנגנון הקישור של שתי מולקולות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצגת כאן שונתה בהתאם להוראת ת"א מכשירים והיא מספיקה כדי לקבוע את זיקת הקשירה והתרמודינמיקה של אפטאמרים ומטרות נבחרות רבות במרכזנו. שלבים מכריעים מהליך זה כוללים החלפת המאגר כך שיהיה לו יעד התואם את הליגנד, הרצת דגימות עם פרמטרים מתאימים ומציאת מודל התאמת המחייב המתאים לניתוח הנתונים. הקלטה רציפה של שחרור חום דורשת ביטול כל חום הרעש, כגון חוסר התאמה של החיץ, לכלוך של התא והמזרק, ובועות בתוך הדגימות. בשלב חילופי החיץ, עדיף להשתמש בחיץ הדיאליזה האחרון או במאגר הזרימה בקרום הדיאליזה או בעמודת הספין כדי להמיס את הליגנד מכיוון שיקר להחליף מולקולות קטנות ישירות.
רוב שיטות קביעת זיקת הקשירה האחרות מניחות יחס קשירה של 1:1 בין אפטמר לליגנד. עם זאת, בשל התנהגות הקשירה והגודל השונה באופן דרסטי בין מולקולות קטנות לאפטמרים, מודל הקשירה 1:1 לא תמיד מדויק14,15. בהיבט זה, ה- ITC יכול לתת נתונים על סטויכיומטריה מחייבת כדי לדעת את מספר אתרי הקישור ולתת מידע על התנהגות הקשירה 7,15. ניתן לספק פונקציה מתקדמת זו על ידי שימוש במודל הכריכה הנכון מתוכנת ניתוח ITC, או מודל איגוד של אתר אחד או שניים. ניתן לנתח נקודה רוויה אחת ביחס קשירה שונה של 1:1 (1 אתר קשירה), 1:2 או 0.5:1 (שני אתרי קשירה). עבור המודל הרציף, אין אתר רווי מובהק אלא רק מספר כולל של אתרים רוויים. אם האתרים זהים, הנתונים מתאימים לרוויה רציפה. שם, באתר הכריכה הראשון יש יותר עותקים ריקים מאותו סוג לבחירה מאשר באתר השני, כפי שניתן לראות מהירידה באנרגיית החום המשתחררת מאתר לאתר14,15,16. פרמטרי הכריכה קובעים את קבוע הכריכה K עבור כל אתר כריכה. במקרה זה, הוא מראה את הכריכה עם שני אתרי קישור רציפים, המאשרים את השינוי הקונפורמציה במולקולה הכוללת. למרות ש- ITC מציע פונקציות מתקדמות רבות לאפיון הקשירה בין האפטמר למולקולות קטנות, תהליך אופטימיזציה בעל תנאים טובים עולה זמן 7,16,17. חוץ מזה, בהשוואה למכשירים אחרים, ציוד ITC הוא יקר ודורש טיפול על ידי טכנאי מיומן היטב.
ברוב המקרים, קביעת זיקת הקשירה בין אפטמר לליגנד מולקולה קטנה היא מאתגרת. ITC יכול להיחשב כשיטה מתקדמת למטרה זו מכיוון ש- ITC מספק זיקות קשירה מדויקות ביותר, כמו גם מידע תרמודינמי. ממידע זה, אנו יכולים לחזות את התנהגותו להשתמש בו לשימוש קליני או לזיהוי. לדוגמה, עם aptamer שנבחר עם שני אתרי קשירה, אנו יכולים לחתוך אותו כדי לשמור על אתר קשירה אחד אם אתר אחד אינו נוח לכריכה, או שאנו יכולים לפצל את האפטמר לשני אפטמרים אם לשני אתרי הקישור יש אותה התנהגות. כמו כן, עם התנהגות שינוי מבנה קונפורמציה, אנו יכולים לשלב את האפטמר עם פלטפורמת מרווה כדי לפתח חיישן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מימון המחקר והפיתוח של Aptagen LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
