Summary
본 프로토콜은 샘플 준비, 실행 표준 및 샘플을 포함하여 DNA 압타머와 테트라사이클린 간의 결합의 연관성 및 해리 역학을 분석하고 결과 데이터를 해석하기 위한 등온 적정 열량측정법(ITC)의 사용을 설명합니다.
Abstract
압타머와 그 표적 사이의 결합 친화도와 거동을 결정하는 것은 적용을 위해 압타머를 선택하고 사용하는 가장 중요한 단계입니다. 압타머와 저분자 사이의 급격한 차이로 인해 과학자들은 결합 특성을 특성화하는 데 많은 노력을 기울일 필요가 있습니다. 등온 적정 열량측정법(ITC)은 이러한 목적을 위한 강력한 접근 방식입니다. ITC는 분리 상수(Kd)를 결정하는 것 이상으로 용액 단계에서 두 분자 간의 상호 작용에 대한 엔탈피 변화 및 결합 화학량론을 제공할 수 있습니다. 이 접근법은 표지가 없는 분자를 사용하여 연속 적정을 수행하고 각 적정에 의해 생성된 결합 이벤트에 따라 시간이 지남에 따라 방출되는 열을 기록하므로 공정은 거대분자와 작은 표적 간의 결합을 민감하게 측정할 수 있습니다. 본 명세서에서는 선택된 압타머와 소형 표적인 테트라사이클린의 ITC 측정의 단계별 절차를 소개합니다. 이 예는 기술의 다양성과 다른 응용 분야에 대한 잠재력을 입증합니다.
Introduction
압타머는 원하는 표적 1,2에 대한 높은 결합 친화도 및 특이성을 갖는 진화 과정을 통해 선택된 ssDNA 또는 RNA 단편으로, 고급 인식 요소 또는 화학 항체 3,4,5로 작용할 수 있습니다. 따라서, 표적에 대한 압타머의 결합 친화도 및 특이성은 압타머의 선택 및 적용에 결정적인 역할을 하며, 등온 적정 열량측정법(ITC)이 이러한 특성화 목적으로 널리 사용되어 왔다. 압타머의 친화도를 측정하기 위해 ITC, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 비색 적정, 마이크로 스케일 열영동(MST) 및 바이오층 간섭계(BLI)를 포함한 많은 접근법이 사용되었습니다. 그 중 ITC는 용액 단계에서 두 분자의 열역학적 및 운동 적 결합을 결정하는 최신 기술 중 하나입니다. 이 접근법은 표지가없는 분자를 사용하여 연속 적정을 수행하고 각 적정 6,7에 의해 생성 된 결합 이벤트에 따라 시간이 지남에 따라 방출 된 열을 기록합니다. 다른 방법과 달리 ITC는 결합 친화도, 여러 결합 부위, 열역학적 및 동역학적 연관성을 제공할 수 있습니다(그림 1A). 이러한 초기 매개 변수에서 Gibbs 자유 에너지 변화와 엔트로피 변화는 다음 관계를 사용하여 결정됩니다.
ΔG = ΔH-TΔS
이는 ITC가 결합 메커니즘을 설명하기 위해 분자 상호 작용의 완전한 열역학적 프로파일을 제공한다는 것을 의미합니다(그림 1B). 압타머를 사용한 소분자의 결합 친화도를 결정하는 것은 압타머와 표적 사이의 크기가 크게 다르기 때문에 어렵습니다. 한편, ITC는 분자를 표지하고 고정화하지 않고도 민감한 측정을 제공할 수 있으며, 이는 측정 중에 압타머와 표적의 자연 구조를 유지하는 수단을 제공합니다. 언급된 특성을 통해 ITC는 압타머와 소형 표적 간의 결합 특성화를 위한 표준 방법으로 사용할 수 있습니다.
Gu 그룹에 의한 선택 후, 이 압타머는 전기화학적 압타머 기반 바이오센서, 경쟁력 있는 효소 결합 압타머 분석법 및 테트라사이클린 8,9,10의 고처리량 검출을 달성할 수 있는 마이크로타이터 플레이트를 포함한 다양한 플랫폼과 통합되었습니다. 그러나, 그 결합 특성은 적절한 플랫폼8을 선택하기에 충분히 잘 밝혀지지 않았다. ITC를 사용하여 압타머와 테트라 사이클린의 결합을 특성화 할 가치가 있습니다.
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Protocol
참고: 그림 2 는 DNA 앱타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성을 결정하기 위한 ITC 실험의 주요 단계를 보여줍니다.
1. 시료 준비
참고: ITC용 샘플은 샘플 셀과 주사기의 다른 버퍼를 혼합하여 발생하는 열 방출을 방지하기 위해 압타머와 리간드 모두에 대해 동일한 버퍼에서 준비해야 합니다. 이는 일반적으로 모든 물질을 동일한 완충액으로 투석하여 달성됩니다. 버퍼는 아래와 같이 일부 수정 된 3kDa 분자량 컷오프 (MWC) 농축기의 프로토콜에서 채택 된 프로토콜을 사용하여 교환됩니다.
- 다음 단계를 사용하여 제조업체에서 구입한 1x PBS, pH 7.4로 투석 컬럼(3kDa MWC)의 멤브레인을 활성화합니다: 1x 버퍼(PBS)로 채우고, RT에서 10분 동안 평형화하고, 5,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
- 완충액을 제거하고 500μL의 압타머 샘플을 컬럼에 넣고 5,000 x g에서 원심분리한 다음 4x 반복하여 원래 완충액을 1x PBS로 교환합니다. 완충액이 막을 통과하면 질량이 3kDa 미만인 모든 분자가 막을 통과하고 압타머는 막의 윗면에 남습니다.
- 피펫을 사용하여 투석된 DNA 압타머를 수집하고 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 테트라 사이클린을 용해시키기 위해 마지막 플로우 스루 버퍼를 수집하십시오. 테트라 사이클린 분말은 순수하고 작기 때문에 투석이 필요하지 않습니다. 그러나 주사기에서 실험용 버퍼가 기준 셀의 버퍼와 일치하는지 확인하기 위해 대상에 대한 DNA에 대해 이전에 투석된 버퍼를 사용합니다.
- UV 가시광선 분광기를 사용하여 압타머 농도를 다시 결정합니다. 마지막 교환 완충액을 사용하여 농도를 40μM 테트라사이클린 및 2μM 압타머로 조정합니다.
- DNA 압타머를 90°C에서 10분 동안 가열하고, 4°C에서 10분 동안 냉각한 다음, 20분 동안 RT로 복귀하여 접습니다.
- 탈기된 압타머를 탈기하고 투석된 테트라사이클린을 25°C에서 25분 동안 600 mmHg로 설정된 탈기소 스테이션 또는 진공 펌프를 사용하여 용해된 가스를 제거하였다.
2. 기기 세척 및 테스트 키트 실행
- 용매 포트를 청소하여 전체 샘플 경로가 깨끗한지 확인합니다. 폐액을 버리고 순수한 메탄올, 물 및 완충액을 채워 청소하십시오. 각 포트에는 세척을 위한 충분한 용액을 보장하기 위해 250mL 이상이 들어 있습니다.
알림: 청소 프로세스는 사용자가 프로그래밍 할 수있는 ITC 제어 소프트웨어에 의해 자동으로 완료됩니다. - 버퍼를 버퍼로 사용하여 ITC를 실행하여 기계의 청결도를 테스트합니다(즉, 1x PBS를 1x PBS로).
참고: 버퍼 주입 피크에 대한 작은 버퍼 사이에서 정상적인 노이즈 기준선이 표시됩니다. 적정 주사기와 캐뉼러가 적절하게 세척되고 완전히 건조되면 기준선이 안정적입니다. 기준선의 증가 또는 감소는 기기 내부의 더러운 기기 또는 기포를 반영하므로 실제 샘플을 실행하기 전에 수정해야 합니다. - EDTA 및 CaCl2 (그림 3)가 포함된 표준 키트로 기본 프로그램을 사용하고 제조업체의 지침에 따라 기계의 정확도를 테스트합니다.
3. 압타머와 테트라사이클린 사이의 결합을 결정하기 위해 샘플 실행
- 실행 매개 변수 설정 : 200 rpm의 교반 속도, 25 ° C, 2 μM 압타머 및 40 μM 테트라 사이클린에서 실행, 각각 2.0 μL로 30 회 주입, 180 초의 지연 시간.
- 실행중인 프로그램 계산기를 사용하여 필요한 볼륨을 확인하십시오. 이 실행 파라미터를 사용하여 ITC 주사기에서 230μL의 40μM 테트라사이클린과 ITC를 사용하여 ITC 샘플 셀에서 485μL의 2μM 압타머로 ITC 측정을 수행합니다.
- 투석된 테트라사이클린 주사기 플레이트와 접힌 압타머를 피펫을 사용하여 기포를 피하면서 샘플 셀에 넣습니다.
- 소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하여 ITC 기기 실행을 시작합니다.
참고: ITC 기기 실행 프로세스는 기준 셀과 적정제 샘플 플레이트를 수동으로 채운 후 완전히 자동화됩니다.
4. 소프트웨어를 사용한 데이터 분석
- 두 번 클릭하여 데이터 분석 소프트웨어를 열어 데이터 분석을 시작합니다.
- 저장된 원시 데이터의 경로를 열어 바인딩 경향을 파악합니다.
- 모델링 탭을 열고 다른 바인딩 모델을 사용하여 데이터 곡선에 가장 적합한 모델을 찾습니다. 그런 다음 소프트웨어는 ITC 서모그램과 엔탈피(ΔH), 엔트로피(ΔS), 자유 에너지(ΔG), 평형 결합 상수(Ka) 및 화학량론을 포함한 다양한 열역학 파라미터를 자동으로 계산합니다.
- 데이터 및 피팅 모델 정보에서 결정된 열역학적 파라미터를 수집합니다.
- 그림 4 및 표 1과 같이 ITC 서모그램 및 다양한 열역학 파라미터 사진을 포함한 보고서를 작성합니다.
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Representative Results
ITC는 정확한 분리 상수 (Kd), 결합 화학 양론 및 2 분자 상호 작용의 열역학적 매개 변수를 제공합니다6. 이 예에서, Kim et al.9,11에 의해 선택된 압타머는 Kd1 = 13 μM, Kd2 = 53 nM의 결합 친화도를 갖는 테트라사이클린에 결합한다. 흥미롭게도, 이러한 결합은 평형 여과법 및 63.3 nM의 보고된Kd를 사용하여 결정되었으며, 이는 유리한 결합 부위(부위 2)와 크게 다르지 않다. ITC의 피팅 모델과 화학량론은 압타머가 순차 결합 모델과 2:1 결합비를 통해 테트라사이클린에 결합한다는 것을 반영합니다(그림 4, 표 1).
사이트 2에 대한 ITC 측정에 의해 결정된 열역학적 매개변수(ΔH = -1200kcal/mol 및 -TΔS = 99.75kcal/mol)는 상대적으로 상당한 엔트로피 손실을 극복하는 엔탈피가 강한 결합을 유도한다는 것을 나타냅니다. 엔트로피 손실과의 엔탈피 구동 결합은 RNA와 소분자 사이의 결합 거동으로보고 된 RNA 구조적 변화와 관련이 있습니다. 예를 들어, Thoa 등은 RNA 앱타머와 Ru(bpy)3 사이의 이러한 결합 거동(ΔH = -27kcal/mol 및 -TΔS = +17kcal/mol)을 보고했습니다.312. 게다가, Horowitz et al. 엔트로피 구동 결합은 올리고뉴클레오티드(ΔH = -2.6kcal/mol 및 -TΔS = -3.3kcal/mol)에 대한 프로플라빈의 삽입과 관련이 있음을 지적했습니다.13. 이러한 비교를 바탕으로 압타머는 엔탈피 구동 결합 시 스위칭 구조 거동으로 기능하여 압타머를 간단한 센서 개발을 위한 인식으로 사용할 수 있습니다.
그림 1: 결합 분리 상수(Kd) 및 열역학적 프로파일. (A) ITC는 엔탈피의 변화 (ΔH) 및 엔트로피의 변화 (ΔS)를 포함하는 결합 분리 상수 (Kd) 및 열역학적 프로파일을 식별한다. (B) 열역학적 프로파일은 상호 작용의 강도와 메커니즘을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: ITC 실험의 주요 단계. 개략도는 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성을 결정하기 위한 ITC 실험의 주요 단계를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : EDTA와 CaCl2 간의 ITC 표준 테스트. Ca2+-EDTA 킬레이트화는 ITC를 검증하기 위한 표준 반응으로 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: DNA 앱타머와 테트라사이클린의 ITC 서모그램. 열역학적 및 동역학적 결합의 피팅 모델은 결합이 두 개의 독립적인 결합 부위를 갖는다는 것을 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 순차 2 사이트 | 케이디(남) | 1.359 x 10-5 |
| 케이디(남) | 5.378 엑스 10-8 | |
| ΔH (킬로 칼로리 / 몰) | 1223 | |
| ΔH (킬로 칼로리 / 몰) | -1200 | |
| 카 (mˉ¹) | 7.358 x 104 | |
| 카 (mˉ¹) | 1.859 x 107 | |
| ΔS (칼 / 몰 K) | 4.123 엑스 103 | |
| ΔS (칼 / 몰 K) | -3.992 x 103 |
표 1 : 압타머와 테트라 사이클린 사이의 결합 매개 변수. 엔탈피 (ΔH), 엔트로피 (ΔS), 자유 에너지 (ΔG), 평형 결합 상수 (Ka) 및 화학 양론을 포함한 다양한 열역학적 매개 변수는 두 분자의 결합 메커니즘에 의해 결정될 수 있습니다.
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Discussion
여기에 제시된 방법은 TA Instruments의 지시에 따라 수정되었으며 당사 센터에서 선택된 많은 압타머 및 표적의 결합 친화도 및 열역학을 결정하기에 충분합니다. 이 절차의 중요한 단계에는 리간드와 일치하는 표적을 갖도록 버퍼를 교환하고, 적절한 매개 변수로 샘플을 실행하고, 데이터를 분석하기 위한 적절한 결합 피팅 모델을 찾는 것이 포함됩니다. 열 방출을 지속적으로 기록하려면 버퍼의 불일치, 셀과 주사기의 더러움, 샘플 내부의 기포와 같은 모든 노이즈 열을 제거해야 합니다. 완충액 교환 단계에서는 소분자를 직접 교환하는 것이 비싸기 때문에 리간드를 용해시키기 위해 투석막 또는 스핀 컬럼에 마지막 투석 완충액 또는 유동 완충액을 사용하는 것이 좋습니다.
대부분의 다른 결합 친화도 결정 방법은 압타머와 리간드 사이의 1:1 결합 비율을 가정합니다. 그러나 결합 거동과 소분자와 압타머 사이의 크기가 크게 다르기 때문에 1:1 결합 모델이 항상 정확한것은 아닙니다 14,15. 이러한 측면에서, ITC는 결합 부위의 수를 알기 위해 결합 화학량론에 대한 데이터를 제공하고 결합 거동(7,15)에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 고급 기능은 ITC 분석 소프트웨어의 올바른 바인딩 모델인 1개 또는 2개 사이트 바인딩 모델을 사용하여 제공할 수 있습니다. 하나의 포화점은 1:1(1개의 결합 부위), 1:2 또는 0.5:1(2개의 결합 부위)의 상이한 결합 비율로 분석될 수 있다. 순차 모델의 경우 뚜렷한 포화 부위가 없고 총 포화 부위 수만 있습니다. 사이트가 동일한 경우 데이터는 순차적 채도에 적합합니다. 거기에서, 제 1 결합 부위는 제 2 부위보다 선택할 수있는 동일한 종류의 빈 사본을 더 많이 가지며, 이는 부위에서 부위(14,15,16)로 방출 된 열 에너지의 감소로부터 명백하다. 결합 매개 변수는 각 결합 부위에 대한 결합 상수 K를 결정합니다. 이 경우, 2개의 순차적 결합 부위와의 결합을 보여주고, 전체 분자의 구조적 변화를 확인한다. ITC는 압타머와 소분자 사이의 결합을 특성화하는 많은 고급 기능을 제공하지만 양호한 조건을 갖는 최적화 프로세스는 7,16,17의 시간이 소요됩니다. 또한 다른 기기와 비교할 때 ITC 장비는 비싸고 잘 훈련된 기술자가 취급해야 합니다.
대부분의 경우 압타머와 저분자 리간드 사이의 결합 친화도를 결정하는 것은 어려운 일입니다. ITC는 매우 정확한 결합 친화도와 열역학 정보를 제공하기 때문에 ITC는 이러한 목적을 위한 고급 방법으로 간주될 수 있습니다. 이 정보로부터 우리는 임상 사용 또는 검출에 사용하기 위해 행동을 예측할 수 있습니다. 예를 들어, 두 개의 결합 부위가 있는 선택된 압타머를 사용하여 한 부위가 결합에 유리하지 않은 경우 하나의 결합 부위를 유지하도록 절단하거나 두 결합 부위가 동일한 동작을 갖는 경우 압타머를 두 개의 압타머로 분할할 수 있습니다. 또한 형태 구조 변화 거동으로 압타머와 담금질 플랫폼을 결합하여 센서를 개발할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 Aptagen LLC의 연구 개발 자금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
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