Summary
Denne protokollen beskriver bruken av isotermisk titreringskalorimetri (ITC) for å analysere assosiasjons- og dissosiasjonskinetikken til bindingen mellom en DNA-aptamer og tetracyklin, inkludert prøvepreparering, løpende standarder og prøver, og tolkning av de resulterende dataene.
Abstract
Bestemmelsen av bindende affinitet og oppførsel mellom en aptamer og dens mål er det mest avgjørende trinnet i å velge og bruke en aptamer for anvendelse. På grunn av de drastiske forskjellene mellom aptamer og små molekyler, må forskere legge mye arbeid i å karakterisere deres bindingsegenskaper. Isotermisk titreringskalorimetri (ITC) er en kraftig tilnærming til dette formålet. ITC går utover å bestemme disassosiasjonskonstanter (Kd) og kan gi entalpiendringer og bindende støkiometri av samspillet mellom to molekyler i løsningsfasen. Denne tilnærmingen utfører kontinuerlig titrering ved hjelp av etikettfrie molekyler og registrerer frigjort varme over tid på bindingshendelsene produsert av hver titrering, slik at prosessen følsomt kan måle bindingen mellom makromolekyler og deres små mål. Her introduserer artikkelen en trinnvis prosedyre for ITC-måling av en valgt aptamer med et lite mål, tetracyklin. Dette eksemplet viser allsidigheten til teknikken og dens potensial for andre applikasjoner.
Introduction
Aptamerer er ssDNA- eller RNA-fragmenter valgt gjennom en evolusjonsprosess med høy bindingsaffinitet og spesifisitet til de ønskede målene 1,2, som kan fungere som avanserte gjenkjenningselementer eller kjemiske antistoffer 3,4,5. Dermed spiller aptamerenes bindingsaffinitet og spesifisitet til deres mål en avgjørende rolle i valg og anvendelse av en aptamer, og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) har blitt mye brukt til disse karakteriseringsformålene. Mange tilnærminger har blitt brukt til å bestemme affiniteten til aptamerer, inkludert ITC, overflateplasmonresonans (SPR), kolorimetrisk titrering, mikroskala termoforese (MST) og Bio-Layer Interferometry (BLI). Blant dem er ITC en av de nyeste teknikkene for å bestemme den termodynamiske og kinetiske assosiasjonen til to molekyler i løsningsfasen. Denne tilnærmingen utfører kontinuerlig titrering ved hjelp av etikettfrie molekyler og registrerer frigjort varme over tid på bindingshendelsene produsert ved hver titrering 6,7. I motsetning til andre metoder kan ITC tilby bindingsaffinitet, flere bindingssteder og termodynamisk og kinetisk assosiasjon (figur 1A). Fra disse innledende parametrene bestemmes Gibbs frie energiendringer og entropiendringer ved hjelp av følgende forhold:
ΔG = ΔH-TΔS
Det betyr at ITC tilbyr en komplett termodynamisk profil av den molekylære interaksjonen for å belyse bindingsmekanismene (figur 1B). Det er vanskelig å bestemme bindingsaffiniteten for små molekyler med aptamer på grunn av de drastisk forskjellige størrelsene mellom aptamer og mål. I mellomtiden kan ITC gi sensitiv måling uten merking og immobilisering av molekyler, noe som gir et middel til å holde den naturlige strukturen til aptameren og målet under målingen. Med de nevnte attributtene kan ITC brukes som standardmetode for karakterisering av binding mellom en aptamer og små mål.
Etter valg av Gu-gruppen ble denne aptameren integrert med forskjellige plattformer, inkludert elektrokjemiske aptamerbaserte biosensorer, en konkurransedyktig enzymbundet aptameranalyse og en mikrotiterplate som kan oppnå høy gjennomstrømningsdeteksjon av tetracyklin 8,9,10. Dens bindende egenskaper er imidlertid ikke belyst godt nok til å velge riktig plattform8; det er verdt å karakterisere bindingen av aptameren til tetracyklinen ved hjelp av ITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Figur 2 viser hovedtrinnene i ITC-eksperimentet for å bestemme den termodynamiske og kinetiske assosiasjonen til en DNA-aptamer og tetracyklin.
1. Klargjøring av prøver
MERK: Prøver for ITC må fremstilles i samme buffer for både aptamer og ligand for å unngå varmeutslipp forårsaket av blanding av forskjellige buffere fra prøvecellen og sprøyten. Dette oppnås vanligvis gjennom dialyse av alle materialer i samme buffer. Bufferen utveksles ved hjelp av en protokoll tilpasset protokollen til en 3 kDa molekylvekt cutoff (MWC) konsentrator med noen modifikasjoner, som nedenfor:
- Aktiver membranen til dialysekolonnen (3 kDa MWC) med 1x PBS, pH 7,4, kjøpt fra produsenten, ved hjelp av følgende trinn: fyll med 1x buffer (PBS), likevekt i 10 minutter ved RT, og sentrifuge ved 5,000 x g i 15 min.
- Fjern bufferen og last 500 μL aptamerprøver inn i kolonnen, sentrifugen ved 5000 x g, og gjenta den 4x for å bytte ut den opprinnelige bufferen for 1x PBS. Når bufferen går gjennom membranen, vil alle molekyler med en masse mindre enn 3 kDa gå gjennom membranen, og aptameren vil forbli på oversiden av membranen.
- Samle den dialyserte DNA-aptameren ved hjelp av en pipet og overfør den til det nye 1,5 ml røret (e).
- Samle den siste gjennomstrømningsbufferen for å oppløse tetracyklin. Tetracyklinpulver er rent og lite, så dialyse er ikke nødvendig. Bruk imidlertid den forrige dialyserte bufferen for DNA for målet for å sikre at bufferen for eksperimentet i sprøyten samsvarer med bufferen i referansecellen.
- Bestem aptamerkonsentrasjonen igjen ved hjelp av et UV-synlig spektrometer. Bruk den siste utvekslingsbufferen til å justere konsentrasjonen til 40 μM tetracyklin og 2 μM aptamer.
- Brett DNA-aptameren ved oppvarming ved 90 °C i 10 minutter, avkjøl ved 4 °C i 10 minutter, og sett deretter tilbake til RT i 20 minutter.
- Degas den brettede aptameren og dialysert tetracyklin ved hjelp av en avgassingsstasjon eller vakuumpumpe satt til 600 mmHg ved 25 °C i 25 minutter for å eliminere oppløste gasser.
2. Vasking av instrumentet og kjøring av testsettet
- Rengjør løsemiddelportene for å sikre at hele prøvebanen er klar. Rengjør ved å kaste avfallsløsningen og fylle dem med ren metanol, vann og buffer. Hver port inneholder mer enn 250 ml for å sikre nok løsning for rengjøring.
MERK: Rengjøringsprosessen fullføres automatisk av brukerprogrammerbar ITC-kontrollprogramvare. - Test maskinens renslighet ved å kjøre ITC ved hjelp av buffer til en buffer (dvs. 1x PBS til 1x PBS).
MERK: En normal støybaseline er synlig mellom den lille bufferen i bufferinjeksjonstopper. Når titreringssprøyten og kanylene er tilstrekkelig rengjort og helt tørre, vil grunnlinjen være stabil. En økning eller reduksjon i grunnlinjen reflekterer skitten instrumentering eller bobler inne i instrumentet, som må korrigeres før de faktiske prøvene kjøres. - Test nøyaktigheten til maskinen med et standardsett som inkluderer EDTA og CaCl2 (figur 3), ved hjelp av standardprogrammet og følg instruksjonene fra produsenten.
3. Kjøre prøven for å bestemme bindingen mellom aptamer og tetracyklin
- Sett opp løpeparametrene: en omrøringshastighet på 200 o / min, kjører ved 25 ° C, 2 μM aptamer og 40 μM tetracyklin, 30 injeksjoner med 2,0 μL hver, en forsinkelsestid på 180 s.
- Kontroller de nødvendige volumene ved hjelp av en løpende programkalkulator. Med denne løpeparameteren utfører du ITC-måling med 230 μL 40 μM tetracyklin i ITC-sprøyten og 485 μL 2 μM aptamer i ITC-prøvecellen ved hjelp av ITC.
- Legg de dialyserte tetracyklinsprøyteplatene og den brettede aptameren inn i prøvecellen, unngå bobler, ved hjelp av en pipette.
- Begynn å kjøre ITC-instrumentet ved å klikke på startknappen på programvaren.
MERK: ITC-instrumentkjøringsprosessen er helautomatisk etter manuell fylling av referansecellen og titrantprøveplatene.
4. Analysere data ved hjelp av programvare
- Åpne dataanalyseprogramvaren ved å dobbeltklikke for å begynne å analysere dataene.
- Åpne banen til de lagrede rådataene for å vite tendensen til binding.
- Åpne modelleringsfanen, og bruk forskjellige bindingsmodeller for å finne den beste tilpasningen for datakurven. Deretter beregner programvaren automatisk ITC-termogrammet og forskjellige termodynamiske parametere, inkludert entalpi (ΔH), entropi (ΔS), fri energi (ΔG), likevektsbindende konstant (Ka) og støkiometri.
- Samle de termodynamiske parametrene bestemt fra dataene og tilpasningsmodellinformasjonen.
- Lag en rapport, inkludert bilder av ITC-termogrammet og ulike termodynamiske parametere, som vist i figur 4 og tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ITC gir en nøyaktig disassosiasjonskonstant (Kd), bindingsstøkiometrien og de termodynamiske parametrene for tomolekylære interaksjoner6. I dette eksemplet binder aptameren valgt av Kim et al.9,11 til tetracyklin med bindingsaffiniteter av K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Interessant nok ble denne bindingen bestemt ved bruk av likevektsfiltreringsmetoden og en rapportert Kd på 63,3 nM, som ikke er mye forskjellig fra det gunstige bindingsstedet (sted 2). Tilpasningsmodellen og støkiometrien fra ITC gjenspeiler at aptameren binder seg til tetracyklin gjennom et bindingsforhold på 2:1 med sekvensiell bindingsmodell (figur 4, tabell 1).
De termodynamiske parametrene bestemt ved ITC-måling for sted 2 (ΔH = -1200 kcal/mol og -TΔS = 99,75 kcal/mol) indikerte at entalpi som overvinner relativt betydelig entropisk tap driver den sterke bindingen. Den entalpidrevne bindingen med entropitap relaterer seg til RNA-konformasjonsendringene, som er rapportert som bindingsadferd mellom RNA og et lite molekyl. For eksempel rapporterte Thoa og medarbeidere slik bindingsatferd (ΔH = -27 kcal/mol og -TΔS = +17 kcal/mol) mellom en RNA-aptamer og Ru(bpy)312. Dessuten indikerte Horowitz og medarbeidere at entropidrevet binding er assosiert med interkalering av proflavin til et oligonukleotid (ΔH = -2,6 kcal/mol og -TΔS = -3,3 kcal/mol)13. Basert på disse sammenligningene fungerer aptameren med koblingsstrukturell oppførsel ved entalpidrevet binding, slik at aptameren kan brukes som gjenkjenning for utvikling av en enkel sensor.
Figur 1: Bindingsdisassosiasjonskonstant (Kd) og termodynamisk profil. (A) ITC identifiserer bindingsdisassosiasjonskonstanten (Kd) og termodynamisk profil, inkludert endring i entalpi (ΔH) og endring i entropi (ΔS). (B) Den termodynamiske profilen gir styrke og mekanisme for interaksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Hovedtrinn i ITC-eksperimentet. Skjemaet viser hovedtrinnene i ITC-eksperimentet for å bestemme den termodynamiske og kinetiske foreningen av en DNA-aptamer og tetracyklin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: ITC-standardtest mellom EDTA og CaCl2. Ca2+-EDTA-chelasjonen har blitt brukt som en standardreaksjon for å validere ITC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: ITC-termogram av DNA-aptamer og tetracyklin. Tilpasningsmodellen for termodynamisk og kinetisk assosiasjon gjenspeiler at bindingen har to uavhengige bindingssteder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Sekvensielt to nettsted | Kd (M) | 1.359 x 10-5 |
| Kd (M) | 5.378 x 10-8 | |
| ΔH (kcal/mol) | 1223 | |
| ΔH (kcal/mol) | -1200 | |
| Ka (Mˉ¹) | 7,358 x 104 | |
| Ka (Mˉ¹) | 1,859 x 107 | |
| ΔS (cal/mol K) | 4,123 x 103 | |
| ΔS (cal/mol K) | -3,992 x 103 |
Tabell 1: Parametre for bindingen mellom aptamer og tetracyklin. Ulike termodynamiske parametere, inkludert entalpi (ΔH), entropi (ΔS), fri energi (ΔG), likevektsbindende konstant (Ka) og støkiometri, kan bestemmes av bindingsmekanismen til to molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteres her ble modifisert i henhold til instruksjon fra TA Instruments og er tilstrekkelig til å bestemme bindingsaffiniteten og termodynamikken til mange utvalgte aptamerer og mål ved vårt senter. Viktige trinn fra denne prosedyren inkluderer utveksling av bufferen for å ha et mål som samsvarer med liganden, kjøre prøver med riktige parametere og finne riktig bindingstilpasningsmodell for å analysere dataene. Kontinuerlig registrering av varmeutslipp krever eliminering av all støyvarme, for eksempel fra manglende samsvar mellom bufferen, smuss i cellen og sprøyten og bobler inne i prøvene. I bufferutvekslingstrinnet er det bedre å bruke den siste dialysebufferen eller gjennomstrømningsbufferen i dialysemembranen eller spinnkolonnen for å oppløse liganden fordi det er dyrt å bytte små molekyler direkte.
De fleste andre bindingsaffinitetsbestemmelsesmetoder antar et bindingsforhold på 1:1 mellom aptamer og ligand. På grunn av bindingsadferden og den drastisk forskjellige størrelsen mellom små molekyler og aptamerer, er 1: 1-bindingsmodellen imidlertid ikke alltid nøyaktig14,15. I dette aspektet kan ITC gi data om bindingstokiometrien for å vite antall bindingssteder og gi informasjon om bindingsadferd 7,15. Den avanserte funksjonen kan leveres ved å bruke riktig bindingsmodell fra ITC-analyseprogramvaren, enten en- eller to-steds bindingsmodellen. Ett mettet punkt kan analyseres ved et annet bindingsforhold på 1:1 (1 bindingssted), 1:2 eller 0,5:1 (to bindingssteder). For den sekvensielle modellen er det ikke noe distinkt mettet sted, men bare et totalt antall mettede steder. Hvis nettstedene er identiske, passer dataene med sekvensiell metning. Der har det første bindingsstedet flere tomme kopier av samme type å velge mellom enn det andre stedet, noe som fremgår av nedgangen i frigjort varmeenergi fra sted til sted14,15,16. Bindingsparametrene bestemmer bindingskonstanten K for hvert bindingssted. I dette tilfellet viser det bindingen med to sekvensielle bindingssteder, som bekrefter konformasjonsendringen i det totale molekylet. Selv om ITC tilbyr mange avanserte funksjoner for å karakterisere bindingen mellom aptamer og små molekyler, koster optimaliseringsprosessen med gode forhold tid 7,16,17. Dessuten, i sammenligning med andre instrumenter, er ITC-utstyr dyrt og krever håndtering av en godt trent tekniker.
I de fleste tilfeller er det utfordrende å bestemme bindingsaffiniteten mellom en aptamer og en liten molekylligand. ITC kan betraktes som en avansert metode for dette formålet fordi ITC gir svært nøyaktige bindingsaffiniteter, samt termodynamisk informasjon. Fra denne informasjonen kan vi forutsi dens oppførsel for å bruke den til klinisk bruk eller deteksjon. For eksempel, med den valgte aptameren med to bindingssteder, kan vi avkorte den for å beholde ett bindingssted hvis ett nettsted ikke er gunstig for binding, eller vi kan dele aptameren i to aptamerer hvis begge bindingsstedene har samme oppførsel. Med konformasjonsstrukturendringsadferd kan vi også kombinere aptameren med en slukkeplattform for å utvikle en sensor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av forsknings- og utviklingsfinansiering fra Aptagen LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
