Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Определение термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина с использованием изотермической титрационной калориметрии

Published: August 23, 2022 doi: 10.3791/64247

Summary

Настоящий протокол описывает использование изотермической титрационной калориметрии (ITC) для анализа кинетики ассоциации и диссоциации связывания между аптамером ДНК и тетрациклином, включая подготовку образцов, текущие стандарты и образцы, а также интерпретацию полученных данных.

Abstract

Определение сродства связывания и поведения между аптамером и его мишенью является наиболее важным шагом в выборе и использовании аптамера для применения. Из-за резких различий между аптамером и малыми молекулами ученым необходимо приложить много усилий для характеристики их связывающих свойств. Изотермическая титрующая калориметрия (ITC) является мощным подходом для этой цели. ITC выходит за рамки определения констант диссоциации (Kd) и может обеспечить изменения энтальпии и стехиометрию связывания взаимодействия между двумя молекулами в фазе раствора. Этот подход проводит непрерывное титрование с использованием молекул без меток и регистрирует выделяемое тепло с течением времени при событиях связывания, производимых каждым титрованием, поэтому процесс может чувствительно измерять связывание между макромолекулами и их небольшими мишенями. В статье представлена пошаговая процедура измерения ITC выбранного аптамера с малой мишенью, тетрациклином. Этот пример доказывает универсальность методики и ее потенциал для других применений.

Introduction

Аптамеры представляют собой фрагменты сдНК или РНК, отобранные в процессе эволюции с высоким сродством связывания и специфичностью к желаемым мишеням 1,2, которые могут работать как элементы расширенного распознавания или химические антитела 3,4,5. Таким образом, сродство связывания и специфичность аптамеров с их мишенями играют решающую роль в выборе и применении аптамера, и изотермическая титрационная калориметрия (ITC) широко используется для этих целей характеристики. Многие подходы были использованы для определения сродства аптамеров, включая ITC, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), колориметрическое титрование, микромасштабный термофорез (MST) и биослойную интерферометрию (BLI). Среди них ITC является одним из новейших методов определения термодинамической и кинетической ассоциации двух молекул в фазе раствора. Этот подход проводит непрерывное титрование с использованием молекул без меток и регистрирует выделяемое тепло с течением времени при событиях связывания, производимых каждым титрованием 6,7. В отличие от других методов, ITC может предложить сродство связывания, несколько сайтов связывания, а также термодинамическую и кинетическую ассоциацию (рисунок 1A). Из этих начальных параметров изменения свободной энергии Гиббса и энтропии определяются с помощью следующей зависимости:

ΔG = ΔH-TΔS

Это означает, что ITC предлагает полный термодинамический профиль молекулярного взаимодействия для выяснения механизмов связывания (рисунок 1B). Определение сродства связывания для малых молекул с аптамером затруднено из-за резко различающихся размеров между аптамером и мишенью. Между тем, ITC может обеспечить чувствительное измерение без маркировки и иммобилизации молекул, что обеспечивает средства сохранения естественной структуры аптамера и мишени во время измерения. С указанными атрибутами ЦМТ может использоваться в качестве стандартного метода для характеристики связывания между аптамером и малыми мишенями.

После выбора группой Gu этот аптамер был интегрирован с различными платформами, включая биосенсоры на основе электрохимического аптамера, конкурентный анализ аптамера, связанный с ферментами, и микротитерную пластину, которая может обеспечить высокую пропускную способность обнаружения тетрациклина 8,9,10. Однако его связующие характеристики не были выяснены достаточно хорошо, чтобы выбрать правильную платформу8; стоит охарактеризовать связывание аптамера с тетрациклином с помощью ITC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показаны основные этапы эксперимента ITC по определению термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина.

1. Подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы для КВТ должны быть подготовлены в одном буфере как для аптамера, так и для лиганда, с тем чтобы избежать выделения тепла, вызванного смешиванием различных буферов из ячейки образца и шприца. Обычно это достигается путем диализа всех материалов в один буфер. Буфер обменивается с помощью протокола, адаптированного из протокола концентратора отсечения молекулярной массы (MWC) 3 кДа с некоторыми модификациями, как показано ниже:

  1. Активируйте мембрану диализной колонны (3 кДа MWC) с 1x PBS, pH 7,4, приобретенную у производителя, используя следующие этапы: заполнить 1x буфером (PBS), уравновесить в течение 10 мин при RT и центрифугу при 5000 x g в течение 15 мин.
  2. Извлеките буфер и загрузите 500 мкл образцов аптамера в колонну, центрифугу при 5000 x g и повторите ее 4x, чтобы заменить исходный буфер на 1x PBS. Когда буфер проходит через мембрану, все молекулы с массой менее 3 кДа проходят через мембрану, а аптамер останется на верхней стороне мембраны.
  3. Соберите диализированный АПТАМЕР ДНК с помощью пипетки и перенесите его в новую трубку (трубки) объемом 1,5 мл.
  4. Соберите последний проточный буфер для растворения тетрациклина. Тетрациклиновый порошок чистый и мелкий, поэтому диализ не нужен. Однако используйте предыдущий диализованный буфер для ДНК для мишени, чтобы гарантировать, что буфер для эксперимента в шприце соответствует буферу в эталонной клетке.
  5. Снова определите концентрацию аптамера с помощью УФ-видимого спектрометра. Используйте последний буфер обмена, чтобы отрегулировать концентрацию до 40 мкМ тетрациклина и 2 мкМ аптамера.
  6. Сложите ДНК-аптамер нагреванием при 90 °C в течение 10 мин, охлаждением при 4 °C в течение 10 мин, а затем возвратом к RT в течение 20 мин.
  7. Дегазировать сложенный аптамер и диализованный тетрациклин с помощью станции дегазации или вакуумного насоса, установленного на 600 мм рт.ст. при 25 °C в течение 25 мин для удаления растворенных газов.

2. Мойка инструмента и запуск тестового комплекта

  1. Очистите отверстия растворителя, чтобы убедиться, что весь путь образца чист. Очистите, выбросив раствор отходов и загрузив их чистым метанолом, водой и буфером. Каждый порт содержит более 250 мл, чтобы обеспечить достаточное количество раствора для очистки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс очистки автоматически завершается программируемым пользователем программным обеспечением управления ITC.
  2. Проверьте чистоту машины, запустив ITC с помощью буфера в буфер (т. Е. 1x PBS в 1x PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальная базовая линия шума видна между крошечным буфером в пики впрыска буфера. Когда шприц титрования и канюли будут надлежащим образом очищены и полностью высохнут, исходный уровень будет стабильным; увеличение или уменьшение базового уровня отражает грязные приборы или пузырьки внутри инструмента, которые необходимо исправить перед запуском фактических образцов.
  3. Проверьте точность машины со стандартным комплектом, который включает в себя EDTA и CaCl2 (рисунок 3), используя программу по умолчанию и следуя инструкциям производителя.

3. Запуск образца для определения связывания между аптамером и тетрациклином

  1. Установите рабочие параметры: скорость перемешивания 200 об/мин, работающая при 25 °C, 2 мкМ аптамера и 40 мкМ тетрациклина, 30 инъекций по 2,0 мкл каждая, время задержки 180 с.
  2. Проверьте необходимые тома с помощью работающего калькулятора программ. С помощью этого рабочего параметра выполните измерение ITC с использованием 230 мкл тетрациклина 40 мкМ в шприце ITC и 485 мкл 2 мкМ аптамера в пробной ячейке ITC с использованием ITC.
  3. Загрузите диализированные тетрациклиновые пластины шприца и сложенный аптамер в клетку образца, избегая пузырьков, используя пипетку.
  4. Запустите инструмент ITC, нажав кнопку «Пуск» на программном обеспечении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс работы прибора ITC полностью автоматизирован после ручного заполнения пластин образцов эталонной ячейки и титранта.

4. Анализ данных с помощью программного обеспечения

  1. Откройте программное обеспечение для анализа данных, дважды щелкнув, чтобы начать анализ данных.
  2. Откройте путь к сохраненным необработанным данным, чтобы узнать тенденцию привязки.
  3. Откройте вкладку моделирования и используйте различные модели привязки, чтобы найти наиболее подходящую для кривой данных. Затем программное обеспечение автоматически вычисляет термограмму ITC и различные термодинамические параметры, включая энтальпию (ΔH), энтропию (ΔS), свободную энергию (ΔG), константу равновесного связывания (Ka) и стехиометрию.
  4. Соберите термодинамические параметры, определенные на основе данных и информации о модели подгонки.
  5. Создайте отчет, включающий изображения термограммы ITC и различных термодинамических параметров, как показано на рисунке 4 и в таблице 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ITC обеспечивает точную константу разъединения (Kd), стехиометрию связывания и термодинамические параметры двухмолекулярных взаимодействий6. В этом примере аптамер, выбранный Kim et al.9,11, связывается с тетрациклином со сродством связывания Kd 1 = 13 мкМ, Kd 2 = 53 нМ. Интересно, что это связывание определяли с использованием метода равновесной фильтрации и сообщаемого Kd 63,3 нМ, что мало чем отличается от благоприятного сайта связывания (сайт 2). Модель подгонки и стехиометрия КВТ отражают, что аптамер связывается с тетрациклином через коэффициент связывания 2:1 с моделью последовательного связывания (рисунок 4, таблица 1).

Термодинамические параметры, определенные путем измерения ITC для участка 2 (ΔH = -1200 ккал/моль и -TΔS = 99,75 ккал/моль), показали, что энтальпия, преодолевающая относительно значительные энтропийные потери, приводит к сильному связыванию. Энтальпийное связывание с потерей энтропии относится к РНК-конформационным изменениям, которые, как сообщалось, были связаны между РНК и небольшой молекулой. Например, Thoa et al. сообщили о таком связывающем поведении (ΔH = -27 ккал/моль и -TΔS = +17 ккал/моль) между аптамером РНК и Ru(bpy)312. Кроме того, Horowitz et al. указали, что энтропийное связывание связано с интеркаляцией профлавина в олигонуклеотид (ΔH = -2,6 ккал/моль и -TΔS = -3,3 ккал/моль)13. Основываясь на этих сравнениях, аптамер функционирует с переключающим структурным поведением при энтальпийном связывании, что позволяет использовать аптамер в качестве распознавания для разработки простого датчика.

Figure 1
Рисунок 1: Константа разъединения связывания (Kd) и термодинамический профиль. (A) ITC определяет константу разъединения связывания (Kd) и термодинамический профиль, включая изменение энтальпии (ΔH) и изменение энтропии (ΔS). (B) Термодинамический профиль обеспечивает прочность и механизм взаимодействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Основные этапы эксперимента ЦМТ. На схеме показаны основные этапы эксперимента ITC по определению термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Стандартный тест ITC между ЭДТА и CaCl2. Хелатирование Ca2+-EDTA использовалось в качестве стандартной реакции для проверки ITC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Термограмма ITC аптамера ДНК и тетрациклина. Модель подгонки термодинамической и кинетической ассоциации отражает, что связывание имеет два независимых сайта связывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Последовательные два сайта Кд (М) 1.359 х 10-5
Кд (М) 5.378 х 10-8
ΔH (ккал/моль) 1223
ΔH (ккал/моль) -1200
Ка (Mˉ¹) 7,358 х 104
Ка (Mˉ¹) 1,859 х 107
ΔS (кал/моль К) 4,123 х 103
ΔS (кал/моль К) -3,992 х 103

Таблица 1: Параметры связывания между аптамером и тетрациклином. Различные термодинамические параметры, включая энтальпию (ΔH), энтропию (ΔS), свободную энергию (ΔG), константу равновесного связывания (Ka) и стехиометрию, могут быть определены механизмом связывания двух молекул.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод, представленный здесь, был модифицирован в соответствии с инструкцией от TA Instruments и достаточен для определения сродства связывания и термодинамики многих выбранных аптамеров и мишеней в нашем центре. Важные шаги из этой процедуры включают обмен буфером, чтобы иметь целевой объект, соответствующий лиганду, запуск образцов с надлежащими параметрами и поиск подходящей модели привязки для анализа данных. Непрерывная регистрация выделения тепла требует устранения всего шумового тепла, например, от несоответствия буфера, грязи ячейки и шприца и пузырьков внутри образцов. На стадии буферного обмена лучше использовать последний диализный буфер или проточный буфер в диализной мембране или спиновой колонке для растворения лиганда, потому что напрямую обмениваться малыми молекулами дорого.

Большинство других методов определения аффинности связывания предполагают соотношение связывания 1:1 между аптамером и лигандом. Однако из-за поведения связывания и резко разного размера между малыми молекулами и аптамерами модель связывания 1:1 не всегда точна14,15. В этом аспекте ITC может дать данные о стехиометрии связывания, чтобы узнать количество сайтов связывания и дать информацию о поведении связывания 7,15. Эта расширенная функция может быть обеспечена с помощью правильной модели привязки из аналитического программного обеспечения ЦМТ, модели привязки одного или двух сайтов. Одна насыщенная точка может быть проанализирована при различном соотношении связывания 1:1 (1 сайт связывания), 1:2 или 0,5:1 (два сайта связывания). Для последовательной модели нет четкого насыщенного сайта, а только общее количество насыщенных сайтов. Если сайты идентичны, данные подходят с последовательной насыщенностью. Там первый сайт привязки имеет больше пустых копий того же рода на выбор, чем второй сайт, о чем свидетельствует уменьшение выделяемой тепловой энергии от участка к участку 14,15,16. Параметры привязки определяют константу привязки K для каждого сайта привязки. В этом случае он показывает связывание с двумя последовательными сайтами связывания, подтверждая конформационное изменение в общей молекуле. Хотя ITC предлагает множество расширенных функций для характеристики связывания между аптамером и малыми молекулами, процесс оптимизации с хорошими условиями стоит времени 7,16,17. Кроме того, по сравнению с другими инструментами, оборудование ITC является дорогостоящим и требует обращения с хорошо обученным техником.

В большинстве случаев определение сродства связывания между аптамером и лигандом малой молекулы является сложной задачей. ITC можно считать передовым методом для этой цели, поскольку ITC обеспечивает высокоточные сродства связывания, а также термодинамическую информацию. Исходя из этой информации, мы можем предсказать его поведение, чтобы использовать его для клинического использования или обнаружения. Например, с выбранным аптамером с двумя сайтами связывания мы можем урезать его, чтобы сохранить один сайт привязки, если один сайт не благоприятен для связывания, или мы можем разделить аптамер на два аптамера, если оба сайта связывания имеют одинаковое поведение. Кроме того, при изменении структуры конформации мы можем комбинировать аптамер с платформой закалки для разработки датчика.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано финансированием исследований и разработок от Aptagen LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG
C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG
TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'
Integrated DNA Technologies, Inc The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells TA Instruments 61000.901 Isothermal titration calorimetry system
CaCl2 Avantor (VWR) E506-100ML Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
Centrifuge Eppendorf 5417R The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V) TA Instruments 6326 This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTA TekNova E0375 EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer ThermoFisher ND-ONE-W UV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices Pall Laboratory OD030C34 3 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4 IBI Scientific IB70165 Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes labForce (a Thomas Scientific Brand) 1149K01
Tetracycline, Hydrochoride EMD Millipore Corperation CAS64-75-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  3. Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
  4. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
  5. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
  6. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
  7. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
  8. Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
  9. Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
  10. Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
  11. Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
  12. Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
  13. Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
  14. Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
  15. Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
  16. Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
  17. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).

Tags

Биохимия выпуск 186 Изотермическая титрующая калориметрия (ITC) аптамер ДНК тетрациклин константы диссоциации (Kd) термодинамические и кинетические ассоциации
Определение термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина с использованием изотермической титрационной калориметрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thoa, T. T. T., Liao, A. M.,More

Thoa, T. T. T., Liao, A. M., Caltagirone, G. T. Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry. J. Vis. Exp. (186), e64247, doi:10.3791/64247 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter