Summary
El presente protocolo describe el uso de la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para analizar la cinética de asociación y disociación de la unión entre un aptámero de ADN y tetraciclina, incluida la preparación de muestras, los patrones de ejecución y las muestras, y la interpretación de los datos resultantes.
Abstract
La determinación de la afinidad y el comportamiento de unión entre un aptámero y su objetivo es el paso más crucial en la selección y el uso de un aptámero para su aplicación. Debido a las drásticas diferencias entre el aptámero y las moléculas pequeñas, los científicos deben esforzarse mucho en caracterizar sus propiedades de unión. La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es un enfoque poderoso para este propósito. ITC va más allá de determinar constantes de disociación (Kd) y puede proporcionar los cambios de entalpía y la estequiometría de unión de la interacción entre dos moléculas en la fase de solución. Este enfoque lleva a cabo una valoración continua utilizando moléculas sin etiquetas y registra el calor liberado a lo largo del tiempo sobre los eventos de unión producidos por cada valoración, por lo que el proceso puede medir con sensibilidad la unión entre macromoléculas y sus pequeños objetivos. Aquí, el artículo presenta un procedimiento paso a paso de la medición ITC de un aptámero seleccionado con un objetivo pequeño, la tetraciclina. Este ejemplo demuestra la versatilidad de la técnica y su potencial para otras aplicaciones.
Introduction
Los aptámeros son fragmentos de ssDNA o ARN seleccionados a través de un proceso de evolución con alta afinidad y especificidad de unión a las dianas deseadas1,2, que pueden funcionar como elementos de reconocimiento avanzado o anticuerpos químicos 3,4,5. Por lo tanto, la afinidad y especificidad de unión de los aptámeros a sus objetivos juegan un papel crucial en la selección y aplicación de un aptámero, y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se ha utilizado ampliamente para estos fines de caracterización. Se han utilizado muchos enfoques para determinar la afinidad de los aptámeros, incluyendo ITC, resonancia de plasmones de superficie (SPR), titulación colorimétrica, termoforesis a microescala (MST) e interferometría de biocapa (BLI). Entre ellas, ITC es una de las últimas técnicas para determinar la asociación termodinámica y cinética de dos moléculas en la fase de solución. Este enfoque lleva a cabo una valoración continua utilizando moléculas sin etiquetas y registra el calor liberado a lo largo del tiempo sobre los eventos de unión producidos por cada valoración 6,7. A diferencia de otros métodos, ITC puede ofrecer afinidad de unión, varios sitios de unión y asociación termodinámica y cinética (Figura 1A). A partir de estos parámetros iniciales, los cambios de energía libre de Gibbs y los cambios de entropía se determinan utilizando la siguiente relación:
ΔG = ΔH-TΔS
Eso significa que ITC ofrece un perfil termodinámico completo de la interacción molecular para dilucidar los mecanismos de unión (Figura 1B). Determinar la afinidad de unión para moléculas pequeñas con un aptámero es difícil debido a los tamaños drásticamente diferentes entre el aptámero y el objetivo. Mientras tanto, ITC puede proporcionar mediciones sensibles sin etiquetar e inmovilizar moléculas, lo que proporciona un medio para mantener la estructura natural del aptámero y el objetivo durante la medición. Con los atributos mencionados, ITC se puede utilizar como el método estándar para la caracterización de la unión entre un aptámero y objetivos pequeños.
Después de la selección por parte del grupo Gu, este aptámero se integró con diferentes plataformas, incluidos biosensores electroquímicos basados en aptámeros, un ensayo competitivo de aptámero ligado a enzimas y una placa de microtitulación, que puede lograr una detección de alto rendimiento de tetraciclina 8,9,10. Sin embargo, sus características de unión no se han dilucidado lo suficientemente bien como para elegir la plataforma adecuada8; vale la pena caracterizar la unión del aptámero a la tetraciclina utilizando ITC.
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Protocol
NOTA: La Figura 2 muestra los pasos principales del experimento ITC para determinar la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina.
1. Preparación de las muestras
NOTA: Las muestras para ITC deben prepararse en el mismo tampón tanto para el aptámero como para el ligando, a fin de evitar la liberación de calor causada por la mezcla de diferentes tampones de la celda y la jeringa de la muestra. Esto generalmente se logra a través de la diálisis de todos los materiales en el mismo tampón. El tampón se intercambia utilizando un protocolo adaptado del protocolo de un concentrador de corte de peso molecular (MWC) de 3 kDa con algunas modificaciones, como se muestra a continuación:
- Active la membrana de la columna de diálisis (3 kDa MWC) con 1x PBS, pH 7.4, comprada al fabricante, siguiendo los siguientes pasos: llene con 1x tampón (PBS), equilibre durante 10 min a RT y centrifugar a 5,000 x g durante 15 min.
- Retire el tampón y cargue 500 μL de muestras de aptámero en la columna, centrifugar a 5.000 x g y repetirlo 4 veces para cambiar el tampón original por 1x PBS. Cuando el tampón atraviesa la membrana, todas las moléculas con una masa inferior a 3 kDa pasarán a través de la membrana y el aptámero permanecerá en la parte superior de la membrana.
- Recoja el aptámero de ADN dializado con una pipeta y transfiéralo a los nuevos tubos de 1,5 ml.
- Recoja el último tampón de flujo para disolver la tetraciclina. El polvo de tetraciclina es puro y pequeño, por lo que no se necesita diálisis. Sin embargo, utilice el tampón dializado anterior para el ADN del objetivo para asegurarse de que el tampón para el experimento en la jeringa coincida con el tampón en la celda de referencia.
- Determine de nuevo la concentración del aptámero utilizando un espectrómetro UV-visible. Utilice el último tampón de intercambio para ajustar la concentración a 40 μM de tetraciclina y 2 μM de aptámero.
- Doblar el aptámero de ADN calentando a 90 °C durante 10 min, enfriando a 4 °C durante 10 min y luego volviendo a RT durante 20 min.
- Desgasifique el aptámero plegado y la tetraciclina dializada utilizando una estación de desgasificación o una bomba de vacío ajustada a 600 mmHg a 25 °C durante 25 min para eliminar los gases disueltos.
2. Lavado del instrumento y funcionamiento del kit de prueba
- Limpie los puertos de disolvente para asegurarse de que toda la ruta de la muestra esté despejada. Limpie desechando la solución residual y cargándola con metanol puro, agua y tampón. Cada puerto contiene más de 250 ml para garantizar suficiente solución para la limpieza.
NOTA: El proceso de limpieza se completa automáticamente mediante un software de control ITC programable por el usuario. - Pruebe la limpieza de la máquina ejecutando ITC usando buffer en un buffer (es decir, 1x PBS en 1x PBS).
NOTA: Una línea base de ruido normal es visible entre el pequeño búfer en los picos de inyección de tampón. Cuando la jeringa de titulación y las cánulas se limpian adecuadamente y se secan por completo, la línea de base será estable; Un aumento o disminución en la línea de base refleja instrumentación sucia o burbujas dentro del instrumento, que deben corregirse antes de ejecutar muestras reales. - Pruebe la precisión de la máquina con un kit estándar que incluye EDTA y CaCl2 (Figura 3), utilizando el programa predeterminado y siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Ejecución de la muestra para determinar la unión entre el aptámero y la tetraciclina
- Configure los parámetros de funcionamiento: una velocidad de agitación de 200 rpm, funcionando a 25 °C, 2 μM aptámero y 40 μM tetraciclina, 30 inyecciones con 2,0 μL cada una, un tiempo de retardo de 180 s.
- Compruebe los volúmenes necesarios utilizando una calculadora de programas en ejecución. Con este parámetro de ejecución, realice la medición ITC con 230 μL de tetraciclina de 40 μM en la jeringa ITC y 485 μL de aptámero de 2 μM en la celda de muestra ITC utilizando el ITC.
- Cargue las placas de jeringa de tetraciclina dializada y el aptámero plegado en la celda de muestra, evitando burbujas, utilizando una pipeta.
- Comience a ejecutar el instrumento ITC haciendo clic en el botón de inicio del software.
NOTA: El proceso de funcionamiento del instrumento ITC está totalmente automatizado después de llenar manualmente la celda de referencia y las placas de muestra de valorante.
4. Análisis de datos usando software
- Abra el software de análisis de datos haciendo doble clic para comenzar a analizar los datos.
- Abra la ruta de los datos sin procesar guardados para conocer la tendencia de vincular.
- Abra la pestaña de modelado y utilice diferentes modelos de enlace para encontrar el que mejor se ajuste a la curva de datos. Luego, el software calcula automáticamente el termograma ITC y varios parámetros termodinámicos, incluida la entalpía (ΔH), la entropía (ΔS), la energía libre (ΔG), la constante de enlace de equilibrio (Ka) y la estequiometría.
- Recopile los parámetros termodinámicos determinados a partir de los datos y la información del modelo de ajuste.
- Cree un informe, que incluya imágenes del termograma ITC y varios parámetros termodinámicos, como se muestra en la Figura 4 y la Tabla 1.
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Representative Results
ITC proporciona una constante de disociación precisa (Kd), la estequiometría de unión y los parámetros termodinámicos de las interacciones de dos moléculas6. En este ejemplo, el aptámero seleccionado por Kim et al.9,11 se une a la tetraciclina con afinidades de unión de K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Curiosamente, esta unión se determinó utilizando el método de filtración de equilibrio y un Kd reportado de 63.3 nM, que no es muy diferente del sitio de unión favorable (sitio 2). El modelo de ajuste y la estequiometría de ITC reflejan que el aptámero se une a la tetraciclina a través de una relación de unión de 2:1 con el modelo de unión secuencial (Figura 4, Tabla 1).
Los parámetros termodinámicos determinados por la medición ITC para el sitio 2 (ΔH = -1200 kcal/mol y -TΔS = 99,75 kcal/mol) indicaron que la entalpía que supera la pérdida entrópica relativamente significativa impulsa la unión fuerte. La unión impulsada por entalpía con pérdida de entropía se relaciona con los cambios conformacionales de ARN, que se han reportado como comportamientos de unión entre el ARN y una molécula pequeña. Por ejemplo, Thoa et al. reportaron tal comportamiento de unión (ΔH = -27 kcal/mol y -TΔS = +17 kcal/mol) entre un aptámero de ARN y Ru(bpy)312. Además, Horowitz et al. indicaron que la unión impulsada por entropía está asociada con la intercalación de la proflavina a un oligonucleótido (ΔH = -2,6 kcal/mol y -TΔS = -3,3 kcal/mol)13. Sobre la base de estas comparaciones, el aptámero funciona con un comportamiento estructural de conmutación en la unión impulsada por entalpía, lo que permite el uso del aptámero como reconocimiento para el desarrollo de un sensor sencillo.
Figura 1: Constante de disociación de enlace (Kd) y perfil termodinámico. (A) ITC identifica la constante de disociación de enlace (Kd) y el perfil termodinámico, incluido el cambio en la entalpía (ΔH) y el cambio en la entropía (ΔS). (B) El perfil termodinámico proporciona la fuerza y el mecanismo de interacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pasos principales del experimento ITC. El esquema muestra los pasos principales del experimento ITC para determinar la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Prueba estándar ITC entre EDTA y CaCl2. La quelación de Ca2+-EDTA se ha utilizado como reacción estándar para validar el ITC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Termograma ITC de un aptámero de ADN y tetraciclina. El modelo de ajuste de asociación termodinámica y cinética refleja que la unión tiene dos sitios de unión independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Dos sitios secuenciales | Kd (M) | 1,359 x 10-5 |
| Kd (M) | 5,378 x 10-8 | |
| ΔH (kcal/mol) | 1223 | |
| ΔH (kcal/mol) | -1200 | |
| Ka (Mˉ¹) | 7,358 x 104 | |
| Ka (Mˉ¹) | 1,859 x 107 | |
| ΔS (cal/mol K) | 4,123 x 103 | |
| ΔS (cal/mol K) | -3,992 x 103 |
Tabla 1: Parámetros de la unión entre aptámero y tetraciclina. Varios parámetros termodinámicos, incluyendo entalpía (ΔH), entropía (ΔS), energía libre (ΔG), constante de enlace de equilibrio (Ka) y estequiometría, pueden determinarse mediante el mecanismo de unión de dos moléculas.
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Discussion
El método presentado aquí fue modificado de acuerdo con las instrucciones de TA Instruments y es suficiente para determinar la afinidad de unión y la termodinámica de muchos aptámeros y objetivos seleccionados en nuestro centro. Los pasos cruciales de este procedimiento incluyen el intercambio del tampón para tener un objetivo que coincida con el ligando, ejecutar muestras con los parámetros adecuados y encontrar el modelo de ajuste de unión apropiado para analizar los datos. El registro continuo de la liberación de calor requiere eliminar todo el calor del ruido, como el desajuste del tampón, la suciedad de la célula y la jeringa, y las burbujas dentro de las muestras. En la etapa de intercambio de tampón, es mejor usar el último tampón de diálisis o tampón de flujo en la membrana de diálisis o columna de espín para disolver el ligando porque es costoso intercambiar moléculas pequeñas directamente.
La mayoría de los otros métodos de determinación de afinidad de unión asumen una relación de unión de 1:1 entre el aptámero y el ligando. Sin embargo, debido al comportamiento de unión y al tamaño drásticamente diferente entre moléculas pequeñas y aptámeros, el modelo de unión 1:1 no siempre es preciso14,15. En este aspecto, el ITC puede dar datos sobre la estequiometría de unión para conocer el número de sitios de unión y dar información sobre el comportamiento de unión 7,15. Esa función avanzada puede proporcionarse utilizando el modelo de encuadernación correcto del programa informático de análisis ITC, ya sea el modelo de encuadernación de uno o dos sitios. Un punto saturado se puede analizar en una proporción de unión diferente de 1: 1 (1 sitio de unión), 1: 2 o 0.5: 1 (dos sitios de unión). Para el modelo secuencial, no hay un sitio saturado distinto, sino solo un número total de sitios saturados. Si los sitios son idénticos, los datos encajan con la saturación secuencial. Allí, el primer sitio de unión tiene más copias vacías del mismo tipo para elegir que el segundo sitio, como lo demuestra la disminución de la energía térmica liberada del sitio al sitio14,15,16. Los parámetros de enlace determinan la constante de enlace K para cada sitio de enlace. En este caso, muestra la unión con dos sitios de unión secuenciales, confirmando el cambio conformacional en la molécula general. Aunque ITC ofrece muchas funciones avanzadas para caracterizar la unión entre el aptámero y moléculas pequeñas, el proceso de optimización que tiene buenas condiciones cuesta tiempo 7,16,17. Además, en comparación con otros instrumentos, el equipo de ITC es costoso y requiere su manejo por un técnico bien capacitado.
En la mayoría de los casos, determinar la afinidad de unión entre un aptámero y un ligando de molécula pequeña es un desafío. ITC puede considerarse un método avanzado para este propósito porque ITC proporciona afinidades de enlace altamente precisas, así como información termodinámica. A partir de esta información, podemos predecir su comportamiento para usarlo para uso clínico o detección. Por ejemplo, con el aptámero seleccionado con dos sitios de enlace, podemos truncarlo para mantener un sitio de enlace si un sitio no es favorable para el enlace, o podemos dividir el aptámero en dos aptámeros si ambos sitios de enlace tienen el mismo comportamiento. Además, con el comportamiento de cambio de estructura de conformación, podemos combinar el aptámero con una plataforma de enfriamiento para desarrollar un sensor.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la financiación de investigación y desarrollo de Aptagen LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
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