Summary
Detta protokoll beskriver användningen av isotermisk titreringskalorimetri (ITC) för att analysera associerings- och dissociationskinetiken för bindningen mellan en DNA-aptamer och tetracyklin, inklusive provberedning, körstandarder och prover och tolkning av resulterande data.
Abstract
Bestämningen av bindande affinitet och beteende mellan en aptamer och dess mål är det viktigaste steget i att välja och använda en aptamer för applikation. På grund av de drastiska skillnaderna mellan aptameren och små molekyler måste forskare lägga mycket ansträngning på att karakterisera deras bindande egenskaper. Isotermisk titreringskalorimetri (ITC) är ett kraftfullt tillvägagångssätt för detta ändamål. ITC går utöver att bestämma disassociationskonstanter (Kd) och kan ge entalpiförändringar och bindande stökiometri av interaktionen mellan två molekyler i lösningsfasen. Detta tillvägagångssätt utför kontinuerlig titrering med hjälp av etikettfria molekyler och registrerar frigjord värme över tiden vid bindningshändelserna som produceras av varje titrering, så att processen känsligt kan mäta bindningen mellan makromolekyler och deras små mål. Häri introducerar artikeln en steg-för-steg-procedur för ITC-mätning av en vald aptamer med ett litet mål, tetracyklin. Detta exempel bevisar teknikens mångsidighet och dess potential för andra applikationer.
Introduction
Aptamers är ssDNA- eller RNA-fragment utvalda genom en evolutionsprocess med hög bindningsaffinitet och specificitet till de önskade målen 1,2, som kan fungera som avancerade igenkänningselement eller kemiska antikroppar 3,4,5. Således spelar aptamers bindande affinitet och specificitet till sina mål en avgörande roll vid valet och tillämpningen av en aptamer, och isotermisk titreringskalorimetri (ITC) har använts i stor utsträckning för dessa karakteriseringsändamål. Många metoder har använts för att bestämma affiniteten hos aptamerer, inklusive ITC, ytplasmonresonans (SPR), kolorimetrisk titrering, termofores i mikroskala (MST) och bioskiktsinterferometri (BLI). Bland dem är ITC en av de senaste teknikerna för att bestämma den termodynamiska och kinetiska föreningen av två molekyler i lösningsfasen. Detta tillvägagångssätt utför kontinuerlig titrering med hjälp av etikettfria molekyler och registrerar frigjord värme över tiden vid de bindningshändelser som produceras av varje titrering 6,7. Till skillnad från andra metoder kan ITC erbjuda bindningsaffinitet, flera bindningsställen och termodynamisk och kinetisk association (figur 1A). Från dessa initiala parametrar bestäms Gibbs fria energiförändringar och entropiförändringar med hjälp av följande förhållande:
ΔG = ΔH-TΔS
Det betyder att ITC erbjuder en komplett termodynamisk profil för den molekylära interaktionen för att belysa bindningsmekanismerna (figur 1B). Att bestämma bindningsaffiniteten för små molekyler med en aptamer är svårt på grund av de drastiskt olika storlekarna mellan aptamer och mål. Under tiden kan ITC tillhandahålla känslig mätning utan märkning och immobiliserande molekyler, vilket ger ett sätt att hålla den naturliga strukturen hos aptameren och målet under mätningen. Med de nämnda attributen kan ITC användas som standardmetod för karakterisering av bindning mellan en aptamer och små mål.
Efter selektion av Gu-gruppen integrerades denna aptamer med olika plattformar, inklusive elektrokemiska aptamerbaserade biosensorer, en konkurrenskraftig enzymbunden aptameranalys och en mikrotiterplatta, som kan uppnå högkapacitetsdetektering av tetracyklin 8,9,10. Dess bindande egenskaper har dock inte belysts tillräckligt bra för att välja rätt plattform8; det är värt att karakterisera bindningen av aptameren till tetracyklin med hjälp av ITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Figur 2 visar huvudstegen i ITC-experimentet för att bestämma den termodynamiska och kinetiska föreningen av en DNA-aptamer och tetracyklin.
1. Beredning av prover
OBS: Prover för ITC måste beredas i samma buffert för både aptamer och ligand för att undvika värmeavgivning orsakad av blandning av olika buffertar från provcellen och sprutan. Detta uppnås vanligtvis genom dialys av alla material i samma buffert. Bufferten utbyts med hjälp av ett protokoll anpassat från protokollet för en 3 kDa molekylviktsavgränsning (MWC) koncentrator med vissa modifieringar, enligt nedan:
- Aktivera membranet i dialyskolonnen (3 kDa MWC) med 1x PBS, pH 7,4, köpt från tillverkaren, med hjälp av följande steg: fyll med 1x buffert (PBS), balansera i 10 min vid RT och centrifugera vid 5 000 x g i 15 min.
- Ta bort bufferten och ladda 500 μL aptamerprover i kolonnen, centrifugera vid 5 000 x g och upprepa den 4x för att byta ut den ursprungliga bufferten mot 1x PBS. När bufferten går genom membranet kommer alla molekyler med en massa mindre än 3 kDa att gå igenom membranet, och aptameren kommer att förbli på membranets övre sida.
- Samla in den dialyserade DNA-aptameren med hjälp av en pipett och överför den till de nya 1,5 ml rören.
- Samla den sista genomströmningsbufferten för att lösa upp tetracyklin. Tetracyklinpulver är rent och litet, så dialys behövs inte. Använd dock den tidigare dialyserade bufferten för DNA för målet för att säkerställa att bufferten för experimentet i sprutan matchar bufferten i referenscellen.
- Bestäm aptamerkoncentrationen igen med hjälp av en UV-synlig spektrometer. Använd den sista utbytesbufferten för att justera koncentrationen till 40 μM tetracyklin och 2 μM aptamer.
- Vik DNA-aptameren genom att värma vid 90 °C i 10 minuter, kyla vid 4 °C i 10 minuter och sedan återgå till RT i 20 min.
- Avgasa den vikta aptameren och dialyserat tetracyklin med hjälp av en avgasningsstation eller vakuumpump inställd på 600 mmHg vid 25 °C i 25 minuter för att eliminera upplösta gaser.
2. Tvätta instrumentet och kör testsatsen
- Rengör lösningsmedelsportarna för att säkerställa att hela provvägen är klar. Rengör genom att kassera avfallslösningen och ladda dem med ren metanol, vatten och buffert. Varje port innehåller mer än 250 ml för att säkerställa tillräckligt med lösning för rengöring.
OBS: Rengöringsprocessen slutförs automatiskt av användarprogrammerbar ITC-kontrollprogramvara. - Testa maskinens renhet genom att köra ITC med buffert i en buffert (dvs. 1x PBS till 1x PBS).
OBS: En normal brusbaslinje är synlig mellan den lilla bufferten till buffertinjektionstoppar. När titreringssprutan och kanylerna är tillräckligt rengjorda och helt torra kommer baslinjen att vara stabil; En ökning eller minskning av baslinjen återspeglar smutsig instrumentering eller bubblor inuti instrumentet, som måste korrigeras innan faktiska prover körs. - Testa maskinens noggrannhet med ett standardkit som inkluderar EDTA och CaCl2 (figur 3), med standardprogrammet och följ instruktionerna från tillverkaren.
3. Kör provet för att bestämma bindningen mellan aptamer och tetracyklin
- Ställ in körparametrarna: en omrörningshastighet på 200 rpm, kör vid 25 °C, 2 μM aptamer och 40 μM tetracyklin, 30 injektioner med 2,0 μL vardera, en fördröjningstid på 180 s.
- Kontrollera de önskade volymerna med hjälp av en löpande programkalkylator. Med denna löpande parameter, utför ITC-mätning med 230 μL 40 μM tetracyklin i ITC-sprutan och 485 μL 2 μM aptamer i ITC-provcellen med hjälp av ITC.
- Ladda de dialyserade tetracyklinsprutplattorna och den vikta aptameren i provcellen och undvik bubblor med hjälp av en pipett.
- Börja köra ITC-instrumentet genom att klicka på startknappen på programvaran.
OBS: ITC-instrumentets körprocess är helt automatiserad efter manuell fyllning av referenscellen och titrantprovplattorna.
4. Analysera data med hjälp av programvara
- Öppna dataanalysprogramvaran genom att dubbelklicka för att börja analysera data.
- Öppna sökvägen till sparade rådata för att känna till tendensen att binda.
- Öppna modelleringsfliken och använd olika bindningsmodeller för att hitta den bästa passformen för datakurvan. Därefter beräknar programvaran automatiskt ITC-termogrammet och olika termodynamiska parametrar, inklusive entalpi (ΔH), entropi (ΔS), fri energi (ΔG), jämviktsbindningskonstant (Ka) och stökiometri.
- Samla in de termodynamiska parametrarna som bestäms utifrån data och anpassningsmodellinformation.
- Skapa en rapport, inklusive bilder av ITC-termogrammet och olika termodynamiska parametrar, som visas i figur 4 och tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ITC ger en exakt disassociationskonstant (Kd), bindningsstökiometrin och de termodynamiska parametrarna för tvåmolekylsinteraktioner6. I detta exempel binder aptameren vald av Kim et al.9,11 till tetracyklin med bindningsaffiniteter av K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Intressant nog bestämdes denna bindning med användning av jämviktsfiltreringsmetoden och en rapporterad Kd på 63, 3 nM, vilket inte skiljer sig mycket från det gynnsamma bindningsstället (plats 2). Monteringsmodellen och stökiometrin från ITC återspeglar att aptameren binder till tetracyklin genom ett 2: 1-bindningsförhållande med den sekventiella bindningsmodellen (figur 4, tabell 1).
De termodynamiska parametrar som bestämdes genom ITC-mätning för plats 2 (ΔH = -1200 kcal/mol och -TΔS = 99,75 kcal/mol) indikerade att entalpi som övervinner relativt signifikant entropisk förlust driver den starka bindningen. Den entalpidrivna bindningen med entropiförlust relaterar till RNA-konformationsförändringarna, som har rapporterats som bindningsbeteenden mellan RNA och en liten molekyl. rapporterade till exempel sådant bindningsbeteende (ΔH = -27 kcal/mol och -TΔS = +17 kcal/mol) mellan en RNA-aptamer och Ru(bpy)312. indikerade dessutom att entropidriven bindning är associerad med interkalationen av proflavin till en oligonukleotid (ΔH = -2,6 kcal / mol och -TΔS = -3,3 kcal / mol)13. Baserat på dessa jämförelser fungerar aptameren med omkopplingsstrukturellt beteende vid entalpidriven bindning, vilket gör det möjligt att använda aptameren som igenkänning för utvecklingen av en enkel sensor.
Figur 1: Bindande disassociationskonstant (Kd) och termodynamisk profil. (A) ITC identifierar den bindande disassociationskonstanten (Kd) och den termodynamiska profilen, inklusive förändring i entalpi (ΔH) och förändring i entropi (ΔS). (B) Den termodynamiska profilen ger styrkan och mekanismen för interaktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Huvudstegen i ITC-experimentet. Schemat visar huvudstegen i ITC-experimentet för att bestämma den termodynamiska och kinetiska föreningen av en DNA-aptamer och tetracyklin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ITC-standardtest mellan EDTA och CaCl2. Ca2+-EDTA-keleringen har använts som en standardreaktion för att validera ITC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: ITC-termogram för en DNA-aptamer och tetracyklin. Monteringsmodellen för termodynamisk och kinetisk association återspeglar att bindningen har två oberoende bindningsställen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sekventiell två webbplats | Kd (M) | 1.359 x 10-5 |
| Kd (M) | 5.378 x 10-8 | |
| ΔH (kcal/mol) | 1223 | |
| ΔH (kcal/mol) | -1200 | |
| Ka (Mˉ¹) | 7,358 x 104 | |
| Ka (Mˉ¹) | 1,859 x 107 | |
| ΔS (kal/mol K) | 4,123 x 103 | |
| ΔS (kal/mol K) | -3.992 x 103 |
Tabell 1: Parametrar för bindningen mellan aptamer och tetracyklin. Olika termodynamiska parametrar, inklusive entalpi (ΔH), entropi (ΔS), fri energi (ΔG), jämviktsbindningskonstant (Ka) och stökiometri, kan bestämmas av bindningsmekanismen för två molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteras här modifierades enligt instruktioner från TA Instruments och är tillräcklig för att bestämma bindningsaffiniteten och termodynamiken hos många utvalda aptamerer och mål i vårt centrum. Viktiga steg från denna procedur inkluderar att utbyta bufferten för att ha ett mål som matchar liganden, köra prover med rätt parametrar och hitta lämplig bindningspassningsmodell för att analysera data. Kontinuerlig registrering av värmeavgivning kräver att all bullervärme elimineras, till exempel från felaktig matchning av bufferten, smuts i cellen och sprutan och bubblor inuti proverna. I buffertutbytessteget är det bättre att använda den sista dialysbufferten eller genomströmningsbufferten i dialysmembranet eller spinnkolonnen för att lösa upp liganden eftersom det är dyrt att byta ut små molekyler direkt.
De flesta andra bindande affinitetsbestämningsmetoder antar ett bindningsförhållande på 1: 1 mellan aptamer och ligand. Men på grund av bindningsbeteendet och den drastiskt olika storleken mellan små molekyler och aptamerer är 1: 1-bindningsmodellen inte alltid korrekt14,15. I denna aspekt kan ITC ge data om bindningsstökiometrin för att känna till antalet bindningsställen och ge information om bindningsbeteende 7,15. Den avancerade funktionen kan tillhandahållas genom att använda rätt bindningsmodell från ITC-analysprogramvaran, antingen bindningsmodellen med en eller två platser. En mättad punkt kan analyseras med ett annat bindningsförhållande på 1:1 (1 bindningsställe), 1:2 eller 0,5:1 (två bindningsställen). För den sekventiella modellen finns det ingen distinkt mättad plats utan bara ett totalt antal mättade platser. Om platserna är identiska passar data med sekventiell mättnad. Där har det första bindningsstället fler tomma kopior av samma slag att välja mellan än det andra stället, vilket framgår av minskningen av frigjord värmeenergi från plats till plats14,15,16. Bindningsparametrarna bestämmer bindningskonstanten K för varje bindningsställe. I det här fallet visar det bindningen med två sekventiella bindningsställen, vilket bekräftar konformationsförändringen i den totala molekylen. Även om ITC erbjuder många avancerade funktioner för att karakterisera bindningen mellan aptameren och små molekyler, kostar optimeringsprocessen med goda förhållanden tid 7,16,17. Dessutom, i jämförelse med andra instrument, är ITC-utrustning dyr och kräver hantering av en välutbildad tekniker.
I de flesta fall är det utmanande att bestämma bindningsaffiniteten mellan en aptamer och en liten molekylligand. ITC kan betraktas som en avancerad metod för detta ändamål eftersom ITC ger mycket exakta bindningsaffiniteter, såväl som termodynamisk information. Från denna information kan vi förutsäga dess beteende för att använda den för klinisk användning eller upptäckt. Till exempel, med den valda aptameren med två bindningsställen, kan vi trunkera den för att behålla en bindningsplats om en plats inte är gynnsam för bindning, eller så kan vi dela aptameren i två aptamerer om båda bindningsställena har samma beteende. Med konformationsstrukturförändringsbeteende kan vi också kombinera aptameren med en släckningsplattform för att utveckla en sensor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av forsknings- och utvecklingsfinansieringen från Aptagen LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
