Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل وتوصيف الجراثيم الطبيعية للنموذج الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64249
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Evolutionary Ecology and Genetics, University of Kiel, 2Max-Planck-Institute for Evolutionary Biology

Summary

Caenorhabditis elegans هو أحد الأنواع النموذجية الرئيسية في علم الأحياء ، ومع ذلك يتم إجراء جميع الأبحاث تقريبا في غياب الميكروبات المرتبطة بها بشكل طبيعي. ستساعد الطرق الموضحة هنا على تحسين فهمنا لتنوع الميكروبات المرتبطة بها كأساس لأبحاث C. elegans الوظيفية المستقبلية.

Abstract

تتفاعل الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الكائنات الحية الدقيقة في الطبيعة. بشكل عام ، توجد C. elegans بشكل شائع في المواد النباتية الفاسدة ، وخاصة الفواكه الفاسدة مثل التفاح أو على أكوام السماد. كما أنه يرتبط ببعض مضيفات اللافقاريات مثل الرخويات وقمل الخشب. هذه الموائل غنية بالميكروبات ، والتي تعمل كغذاء ل C. elegans والتي يمكنها أيضا استعمار الأمعاء الخيطية باستمرار. حتى الآن ، لم يتم فهم التنوع الدقيق والاتساق لميكروبات C. elegans الأصلية عبر الموائل والمواقع الجغرافية بشكل كامل. هنا ، نصف نهجا مناسبا لعزل C. elegans عن الطبيعة وتوصيف الكائنات الحية الدقيقة للديدان. يمكن عزل الديدان الخيطية بسهولة عن مواد السماد أو التفاح المتعفن أو الرخويات أو جذبها عن طريق وضع التفاح على أكوام السماد. وقت الذروة للعثور على C. elegans في نصف الكرة الشمالي هو من سبتمبر حتى نوفمبر. يمكن غسل الديدان من مواد الركيزة المجمعة عن طريق غمر الركيزة في محلول عازل ، يليها جمع الديدان الخيطية ونقلها إلى وسط نمو الديدان الخيطية أو مخزن PCR المؤقت للتحليل اللاحق. نوضح كذلك كيف يمكن استخدام العينات لعزل وتنقية الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بالديدان ومعالجة الديدان لتحليل الحمض النووي الريبي الريبوسومي 16S لتكوين مجتمع الميكروبات. بشكل عام ، قد تحفز الطرق الموصوفة أبحاثا جديدة حول توصيف الكائنات الحية الدقيقة C. elegans عبر الموائل والمواقع الجغرافية ، مما يساعد على الحصول على فهم شامل لتنوع واستقرار ميكروبات الديدان الخيطية كأساس للبحث الوظيفي في المستقبل.

Introduction

في الطبيعة ، توجد C. elegans بشكل شائع في المواد النباتية الفاسدة ، وخاصة الفواكه الفاسدة مثل التفاح أو على أكوام السماد1. كما أنه يرتبط ببعض مضيفات اللافقاريات مثل الرخويات وقمل الخشب 2,3. هذه الموائل غنية بالميكروبات ، والتي لا تعمل فقط كغذاء للدودة ، ولكنها قد تشكل أيضا ارتباطات مستقرة معها. تم نشر معلومات عن تنوع الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بشكل طبيعي فقط في عام 20164،5،6. منذ ذلك الحين ، كشفت هذه الدراسات وعدد قليل فقط من الدراسات الحديثة أن C. elegans مرتبطة بمجموعة متنوعة من البكتيريا والفطريات ، بما في ذلك البكتيريا من جنس Pseudomonas ، Enterobacter ، Ochrobactrum ، Erwinia ، Comamonas ، Gluconobacter ، والعديد من الدراسات الأخرى6،7،8. يمكن للعديد من البكتيريا المرتبطة بها استعمار أمعاء الدودة بثبات ، على الرغم من أنها ليست كلها6،9،10،11،12. من المحتمل أن تكون ذات أهمية رئيسية لفهمنا لبيولوجيا C. elegans لأنها يمكن أن توفر التغذية ، وتحمي من مسببات الأمراض وربما الضغوطات الأخرى ، وتؤثر على سمات تاريخ الحياة المركزية مثل معدل التكاثر أو التطور أو الاستجابات السلوكية.

على سبيل المثال ، يمكن للعزلات المرتبطة بشكل طبيعي من أجناس Pseudomonas و Ochrobactrum وأيضا Enterobacter أو Gluconobacter أن تحمي الدودة من العدوى الممرضة والقتل بطرق مميزة5،6،11،13،14. تؤثر عزلة محددة من جنس Comamonas على الاستجابة الغذائية للديدان الخيطية وتطورها وعمرها وخصوبتها15،16،17. تنتج بكتيريا بروفيدنسيا التيرامين المعدل العصبي وبالتالي تعدل نشاط الجهاز العصبي المضيف والاستجابات السلوكية الناتجة18. تم إثبات أن مجموعة من البكتيريا المختلفة المرتبطة بشكل طبيعي تؤثر على معدل النمو السكاني والخصوبة والاستجابات السلوكية5،6،9،11،19.

حتى الآن ، لم يتم فهم التنوع والاتساق الدقيق لميكروبات C. elegans الأصلية عبر الموائل والمواقع الجغرافية بشكل كامل ، ولا يزال يتعين الكشف عن المزيد من الارتباطات بين الدودة والميكروبات من بيئتها. استخدمت العديد من الدراسات السابقة سلالات بكتيرية معزولة من بعض بيئة التربة ، أو موائل C. elegans الطبيعية ، أو من تجارب mesocosm (أي البيئات القائمة على المختبر التي تعيد إنشاء الموائل الطبيعية) مع سلالات مختبر C. elegans 4،5،20. على الرغم من أن هذه الدراسات حصلت على رؤى جديدة حول تأثير الميكروبات على سمات الديدان الخيطية المحددة (على سبيل المثال ، استقلاب الديدان الخيطية21) ، فإن أهمية هذه التفاعلات لبيولوجيا C. elegans في الطبيعة غير واضحة. لذلك ، تصف هذه المخطوطة طرق عزل C. elegans مباشرة عن الطبيعة وعزل الميكروبات المرتبطة بشكل طبيعي وتوصيفها لاحقا من كل من الديدان المفردة ومجموعات الديدان. الطرق الموصوفة هي نسخة محدثة ومحسنة من الإجراءات المستخدمة سابقا لعزل وتوصيف C. elegans الطبيعية والميكروبات الأصلية2،6،7. بالنظر إلى أن C. elegans موجود على نطاق واسع في المواد النباتية المتحللة في جميع أنحاء العالم (خاصة في الفواكه المتعفنة والمناطق المعتدلة وفي الخريف)1،2،22،23،24،25 ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول من قبل أي مختبر كلما كان هناك اهتمام بربط C. elegans سمات الميكروبات المرتبطة بشكل طبيعي وبالتالي سياق أكثر صلة بشكل طبيعي. هذا الأخير محوري لفهم كامل لبيولوجيا الديدان الخيطية لأنه من المعروف من مجموعة متنوعة من الأنظمة المضيفة الأخرى أن الجراثيم المرتبطة بها يمكن أن تؤثر على خصائص تاريخ الحياة المتنوعة26 ، وهو جانب يتم إهماله حاليا إلى حد كبير في العديد من دراسات C. elegans عبر جميع تخصصات علوم الحياة تقريبا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة والوسائط

  1. قم بإعداد S-buffer بإضافة 5.85 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.123 جم من K 2 HPO 4 ، و 5.926 جم من KH 2 PO4 ، و 1 لتر من H2O منزوع الأيونات إلى دورقوأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
  2. تحضير وسط لزج عن طريق إضافة S-buffer يحتوي على 1.2٪ (وزن / حجم) هيدروكسي ميثيل سلولوز (المادة المسببة لزوجة الوسط) ، 5 ملغ / مل من الكوليسترول ، 1 ملي مول MgSO4 ، 1 ملي مول CaCl2 ، و 0.1٪ (v / v) أسيتون. الأوتوكلاف وتحريك الوسط اللزج حتى يصبح متجانسا تماما.
    ملاحظة: قد يستغرق هذا عدة ساعات. أيضا ، يمكن تحضير S-buffer مباشرة وإضافته إلى الوسط اللزج دون تعقيم مسبق.
  3. قم بإعداد M9-buffer بإضافة 3 جم من KH 2 PO 4 ، و 6 جم من NA 2 HPO4 · 2 H 2 O ، و 5 جم من NaCl ، و 1 L من H2O منزوع الأيونات إلى دورق 1 لتر. الأوتوكلاف الحل ، وبعد التبريد ، إضافة 1 مل من 1 M MgSO 4 (123.24 غرام من MgSO4 · 7H 2 O في 500 مل من H2O منزوع الأيونات ، مرشح معقمة).
  4. قم بإعداد محلول مخزون Triton X-100 بنسبة 10٪ (v / v) عن طريق خلط 5 مل من Triton X-100 مع 45 مل من M9-buffer. قم بتصفية وتعقيم المحلول باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر.
  5. قم بإعداد M9-buffer باستخدام Triton X-100 (M9-T) عن طريق إضافة 2.5 مل من محلول مخزون Triton X-100 بنسبة 10٪ (v / v) إلى 1 لتر من M9-buffer بعد التعقيم للحصول على 0.025٪ (v / v) M9-T.
  6. تحضير 30٪ (v / v) من الجلسرين في S-buffer عن طريق خلط 15 مل من الجلسرين المعقم بنسبة 100٪ و 35 مل من المخزن المؤقت S المعقم في أنبوب سعة 50 مل.

2. إعداد العينات البيئية (الشكل 1)

  1. اجمع عينات بيئية مثل السماد أو الفواكه الفاسدة وضع كل عينة في كيس بلاستيكي فردي أو أنبوب أو حاوية نظيفة أخرى.
    ملاحظة: من أجل جذب الديدان الخيطية ، يمكن وضع التفاح على السماد قبل عدة أسابيع من أخذ العينات.
  2. انشر قطعا من العينة البيئية بالتساوي في طبق بتري فارغ ومعقم بطول 9 سم.
    ملاحظة: من المرجح أن تحتوي العينات ذات المستويات الأعلى من الاضمحلال على C. elegans. اختياريا ، يمكن استخدام طبق بتري مملوء بوسط أجار خال من الببتون (PFM) لزيادة التباين.
  3. قم بتغطية العينة بعناية بحوالي 20 مل من الوسط اللزج المعقم.
    ملاحظة: تطفو الديدان الخيطية على السطح في غضون 1-2 ساعة. يبطئ الوسط اللزج حركة الديدان ويسهل أخذ عينات منها. يمكن استخدام المخزن المؤقت M9 المعقم كبديل ، ومع ذلك ، ستكون حركة الدودة أسرع.

Figure 1
الشكل 1: عزل الديدان الخيطية من الركائز. توضع عينات الركيزة في أطباق بتري فارغة ومغطاة بوسط لزج لطرد الديدان الخيطية. يتم نقل الديدان الخيطية إلى M9-T وغسلها بشكل متكرر لإزالة البكتيريا من الخارج. يمكن استخدام الديدان الخيطية الفردية لعزل الحمض النووي ، أو عزل البكتيريا المرتبطة بها ، أو وضعها على ألواح أجار لمجموعات دودة الثقافة. الشكل الذي تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. عزل نيماتودا Caenorhabditis (الشكل 1)

  1. ابحث عن الديدان الخيطية Caenorhabditis باستخدام مجهر تشريح ، باتباع الإرشادات الواردة في فصل WormBook حول عزل C. elegans والديدان الخيطية ذات الصلة بواسطة Barrière و Félix27.
    ملاحظة: Caenorhabditis خنثى / الإناث لديها أمعاء من اللون البني الفاتح (تحت الإضاءة المرسلة). علاوة على ذلك ، تحتوي خلايا الأمعاء على نوى خلايا كبيرة ، والتي يمكن رؤيتها كنقاط بيضاء. على النقيض من ذلك ، غالبا ما يكون لأنواع الديدان الخيطية الأخرى أمعاء بنية داكنة وقد تظهر عدم تناسق أمامي خلفي في شدة الصباغ وعادة لا توجد نوى مرئية. تم العثور على الفرج من البالغين Caenorhabditis خنثى / الإناث في منتصف الحيوان. لا يظهر توطين الفرج هذا دائما من قبل أصناف الديدان الخيطية الأخرى. تمتلك نيماتودا Caenorhabditis اثنين من المصابيح البلعومية ، وكلاهما مرئي مع تكبير كاف وإضاءة منقولة وتباين مع العديد من أصناف الديدان الخيطية الأخرى. الديدان الخيطية Caenorhabditis لها ذيل مدبب ، في حين أن بعض الديدان الخيطية الأخرى لها ذيل مستدير.
  2. جمع الديدان الخيطية Caenorhabditis تحت المجهر تشريح في أقل قدر ممكن من السائل باستخدام ماصة 20-100 ميكرولتر. انقل الديدان الخيطية المجمعة مباشرة إلى 1-3 مل من M9-T المعقم في طبق بتري معقم 3 سم لغسل الديدان لإزالة الميكروبات غير المرفقة (الخطوة 3.3) أو ، بدلا من ذلك ، نقل الديدان الفردية إلى طبق به وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) لإنشاء مجموعة من الديدان (الخطوة 3.4).
  3. اغسل الديدان الخيطية لإزالة الميكروبات من خارج الديدان الخيطية.
    ملاحظة: يثري هذا البروتوكول بكتيريا الأمعاء ولكنه لا يقضي تماما على البكتيريا الملتصقة ببشرة الدودة.
    1. احتضان الديدان الخيطية لمدة 10-15 دقيقة في M9-T.
    2. ماصة الديدان الخيطية في أقل قدر ممكن من السائل في 1-3 مل من M9-T الطازجة في طبق بتري معقم جديد 3 سم.
    3. كرر الحضانة ونقل الديدان الخيطية إلى M9-T الطازجة مرتين أخريين.
      ملاحظة: يمكن القيام بالخطوات التالية إما مع الديدان الفردية أو مع مجموعات الديدان. يمكن الآن استخدام الديدان لتوصيف C. elegans والميكروبات المرتبطة بها ، وكذلك عزل البكتيريا (الخطوتان 4 و 5). بدلا من ذلك ، يمكن نقلها بشكل فردي إلى لوحات NGM لإنشاء مجموعة من الديدان (الخطوة 3.4).
  4. للحصول على مجموعة من الديدان ، ماصة نيماتودا فردية إلى لوحة NGM.
    ملاحظة: فقط الديدان الخيطية الخنثى مثل C. elegans أو C . briggsae هي القادرة على إنتاج ذرية من الديدان المفردة. ومع ذلك ، قد تستمر الديدان المفردة من الأنواع الأخرى في إنتاج ذرية إذا كانت قد تزاوجت بالفعل.
    1. عادة ما تحتوي الديدان الخيطية المعزولة بشكل طبيعي على بكتيريا في أمعائها ، والتي تسقطها على ألواح NGM ، حيث تنمو هذه البكتيريا وتكون متاحة كغذاء ل C. elegans. لا تضيف كائنات غذائية منفصلة مثل كائن الغذاء المختبري القياسي ، سلالة الإشريكية القولونية OP50.
      ملاحظة: تؤثر تربية الديدان على الصفائح على تكوين المجتمع البكتيري المرتبط ، ومع ذلك لا يزال التكوين مشابها لتكوين عزلات C. elegans الطبيعية 6,7.
    2. اسمح للديدان الخيطية بالتكاثر لمدة تصل إلى 10 أيام عند درجة الحرارة المناسبة (على سبيل المثال ، 15-20 درجة مئوية للمواقع المعتدلة). قم بتجميد هذه الديدان الخيطية (الخطوة 3.5) أو استخدمها لتوصيف C. elegans والميكروبات المرتبطة بها وكذلك عزل الميكروبات (الخطوتان 4 و 5).
  5. تجميد الديدان الخيطية للتخزين طويل الأجل
    1. اترك الديدان الخيطية على الأطباق حتى تختفي بكتيريا الطعام ، وهناك مراحل يرقات صغيرة بشكل أساسي على اللوحات. اغسل الديدان من الألواح في 1.5 مل من S-buffer.
    2. امزج 500 ميكرولتر من S-buffer المحتوي على الديدان جيدا مع 500 ميكرولتر من 30٪ (v / v) من الجلسرين في S-buffer في أنبوب معقم سعة 2 مل. قم بتجميد الأنابيب على الفور عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل ، وإلا فقد يضر الجلسرين بالديدان الخيطية.

4. تحضير الديدان للتعرف الجزيئي على C. elegans والميكروبات

  1. لتحديد غير متحيز للميكروبات المرتبطة بالديدان الخيطية ، قم بإعداد صفيحة 96 بئرا بثلاث حبات معقمة 1 مم ، و 19.5 ميكرولتر من محلول تفاعل البوليميراز المتسلسل ، و 0.5 ميكرولتر من بروتيناز K (20 مجم / مل) لكل بئر. ماصة فرد ، وغسل الديدان الخيطية إلى كل بئر ، ونقل أقل قدر ممكن من السائل.
  2. يمكن أيضا استخدام مجموعات الديدان. لهذا ، اغسل الديدان من الألواح باستخدام M9-buffer وانقل ~ 300 ميكرولتر من M9-buffer المحتوي على الديدان إلى أنابيب 2 مل مع 10-15 حبة.
  3. قم بتفتيت الديدان الخيطية باستخدام خالط الخرز (على سبيل المثال ، ضرب الخرز لمدة 3 دقائق عند 30 هرتز). قم بالطرد المركزي للوحة أو الأنابيب لفترة وجيزة لإيصال السائل إلى القاع (على سبيل المثال ، لمدة 10 ثوان عند 8000 × جم في درجة حرارة الغرفة [RT]).
  4. تحديد C . ايليجانس
    1. عزل الحمض النووي للديدان الخيطية الفردية عن طريق تسخين العينات في دورة PCR لمدة 1 ساعة عند 50 درجة مئوية و 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية. عزل الحمض النووي لمجموعات الديدان باستخدام أي طريقة عزل مفضلة (مثال بروتوكولات طرق العزل المختلفة باستخدام مجموعات تجارية 7,9). قم بتجميد الحمض النووي عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
    2. لتحديد C. elegans ، استخدم الحمض النووي والزوج التمهيدي nlp30-F (الجدول 1 ، 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') و nlp30-R (الجدول 1 ، 5'-TACTTTCCCCATCCGTATC-3') في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، باتباع تعليمات مورد Taq المفضل.
    3. استخدم شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: خطوة التمسخ الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، تليها 35 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، وخطوة استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تنتج C. elegans منتج PCR بقوة 154 نقطة أساس.
  5. قم بتوصيف البكتيريا المرتبطة بالديدان الخيطية عبر تسلسل 16S amplicon لمنطقة V3-V4 ، باستخدام الحمض النووي المعزول.
    1. قم بإعداد مكتبة 16S باستخدام البادئات 16S المفضلة واتبع بروتوكول مجموعة أدوات إعداد المكتبة. أحد الخيارات هو استخدام البادئات 341F (الجدول 1 ، 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') و 806R (الجدول 1 ، 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') التي تغطي منطقة V3-V4 من جين 16S rRNA ، مما ينتج عنه تسلسلات يمكن تصنيفها بقواعد بيانات قياسية بدقةجيدة 7.
      ملاحظة: كمية الحمض النووي المدخلات أمر بالغ الأهمية في هذه الخطوة. سيكون الحمض النووي المكتسب من الديدان المفردة أقل بكثير من الحمض النووي الذي تم الحصول عليه من مجموعات الديدان. بالنسبة للديدان المفردة ، قد يكون من الضروري زيادة كمية الحمض النووي المدخلات أو زيادة كمية دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل7.
    2. يمكن تسلسل المكتبات على منصة تسلسل باستخدام مجموعة تسلسل مناسبة.
      ملاحظة: هنا ، يتم استخدام منصة MiSeq مع مجموعة كاشف MiSeq المناسبة. يتم تحسين الكواشف باستمرار ويجب اختيارها وفقا لأحدث المعايير.

5. عزل وزراعة البكتيريا المرتبطة بالديدان الخيطية (الشكل 2)

  1. لعزل البكتيريا ، قم بإعداد صفيحة 96 بئرا بثلاث خرزات معقمة 1 مم ، و 20 ميكرولتر من M9-buffer لكل بئر ، وماصة للديدان الخيطية المغسولة الفردية إلى كل بئر ، ونقل أقل قدر ممكن من السائل.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن غسل مجموعات الديدان من الألواح باستخدام M9-buffer و ~ 300 ميكرولتر من M9-buffer المحتوي على الديدان يمكن نقلها إلى أنابيب 2 مل مع 10-15 حبة. في جميع الحالات ، يجب أن تأتي الديدان من مزرعة تم تحديدها على أنها C. elegans باستخدام الخطوات 4.1-4.4.
  2. قم بتفتيت الديدان الخيطية باستخدام خالط الخرز (على سبيل المثال ، ضرب الخرز لمدة 3 دقائق عند 30 هرتز). قم بالطرد المركزي للوحة أو الأنابيب لفترة وجيزة لإيصال السائل إلى القاع (على سبيل المثال ، لمدة 10 ثوان عند 8000 × جم عند RT).
    ملاحظة: أدى استخدام هذه الطريقة إلى عزل الأصناف البكتيرية المشابهة لتلك التي كشف عنها تسلسل amplicon 16S rDNAamplicon 7 ، مما يشير إلى أن ضرب الخرزة الموصوف يترك معظم الخلايا البكتيرية سليمة.
  3. اجمع المادة الطافية ، وقم بتخفيفها بشكل متسلسل في الساعة 1:10 ، وقم بصفيحة تصل إلى 100 ميكرولتر على ألواح أجار 9 سم.
    1. لضمان إمكانية زراعة معظم البكتيريا ، استخدم مجموعة متنوعة من الوسائط البديلة ذات التركيبات الغذائية المختلفة ، بما في ذلك أجار الصويا المخفف (TSA ، تخفيف 1:10) ، أو أجار MacConkey ، أو أجار الجلوكوز Sabouraud ، أو أجار سكر العنب في البطاطس ، أو أجار سكر العنب الخميرة الببتون.
  4. احتضان الألواح في متوسط ظروف درجة الحرارة لموقع أخذ العينات (على سبيل المثال ، درجات حرارة تتراوح بين 15-20 درجة مئوية للمواقع المعتدلة) لمدة 24-48 ساعة.
  5. استخدم تقنية الخطوط الثلاثة القياسية وحلقة معقمة للحصول على مزارع بكتيرية نقية (الشكل 2).
    1. اختر مستعمرة واحدة من صفيحة باستخدام حلقة معقمة أو عود أسنان وقم بخطها على صفيحة أجار جديدة تحتوي على نفس وسط الأجار المستخدم للتنقية. تأكد من استخدام ما يقرب من 1/3 فقط من اللوحة.
    2. إما استخدام حلقة معقمة جديدة أو تعقيم حلقة قابلة لإعادة الاستخدام واسحبها خلال الخط الأول لإنشاء خط ثان على 1/3 آخر من نفس اللوحة.
    3. كرر هذه الخطوة عن طريق سحب حلقة معقمة خلال الخط الثاني.
    4. احتضان اللوحة في نفس ظروف النمو المستخدمة للعزل. يجب أن تؤدي هذه التقنية إلى مستعمرات مفردة تنمو في منطقة الخط الثالث.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري تكرار خطوة التنقية عدة مرات لأن العزلات الطبيعية تميل إلى تكوين الأغشية الحيوية و / أو الركام.
  6. قم بزراعة المستعمرات النقية في وسط سائل (من نفس نوع وسط أجار) باستخدام نفس درجة الحرارة ووقت النمو على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 5.4)
  7. تحضير مخزون البكتيريا بإضافة 300 ميكرولتر من المزرعة البكتيرية إلى 200 ميكرولتر من 86٪ (v / v) من الجلسرين (في وسط النمو المعني ، على سبيل المثال ، TSB) والماصة لأعلى ولأسفل للخلط بشكل صحيح. بدلا من ذلك ، قم بإعداد مخزون DMSO عن طريق خلط 50 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية مع 50 ميكرولتر من 7٪ (v / v) DMSO. تجمد عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
  8. توصيف البكتيريا باستخدام تسلسل جين الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي الكامل 16S
    1. استخراج الحمض النووي البكتيري من الثقافات السائلة النقية باستخدام تقنية مناسبة (على سبيل المثال ، مجموعة استخراج الحمض النووي ؛ من التجربة ، يعمل بروتوكول الاستخراج القائم على CTAB بشكل جيد للغاية22).
    2. تضخيم جين 16S rRNA باستخدام البادئات 27F (الجدول 1 ، 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') و 1495R (الجدول 1 ، 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3')28 وشروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: 95 درجة مئوية ، 2 دقيقة ، 22x (95 درجة مئوية ، 30 ثانية ؛ 55 درجة مئوية ، 30 ثانية ؛ 72 درجة مئوية ، 100 ثانية) ، وفترة تمديد نهائية عند 72 درجة مئوية ، 5 دقائق.
    3. من أجل الحصول على التسلسلات الكاملة ، استخدم أيضا اثنين من بادئات التسلسل الداخلي ، مثل 701F (الجدول 1 ، 5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3') و 785R (الجدول 1 ، 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')6.

Figure 2
الشكل 2: تحديد الأنواع وعزل البكتيريا الفردية. يتم تقسيم الديدان الخيطية الفردية باستخدام خالط حبة ، ويتم عزل الحمض النووي لتحديد الأنواع عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل أو التسلسل. بدلا من ذلك ، يتم تخفيف مادة الديدان الخيطية المكسورة بشكل متسلسل ومطلية على ألواح متوسطة النمو. يتم تحضين الصفائح حتى تظهر المستعمرات البكتيرية ، ويتم ربط المستعمرات المفردة بألواح جديدة للحصول على ثقافات نقية. تستخدم المستعمرات المفردة من المزارع النقية لزراعة مزارع بكتيرية سائلة لإعداد مخزون بكتيري للتخزين طويل الأجل عند -80 درجة مئوية. الشكل الذي تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كثيرا ما توجد الديدان الخيطية C. elegans في الفواكه المتحللة ، مثل التفاح ، وكذلك عينات السماد. في شمال ألمانيا ، تم العثور على C. elegans وكذلك الأنواع الجنيسة (خاصة C. remanei ولكن أيضا C. briggsae) بشكل أساسي من سبتمبر حتى2 نوفمبر. توجد الديدان الخيطية بشكل شائع في المواد النباتية المتحللة ، وخاصة الفواكه المتعفنة مثل التفاح أو الكمثرى ، وكذلك السماد العضوي ، وخاصة المواد التي تظهر درجة عالية من التحلل. يمكن أخذ عينات الفاكهة والسماد العضوي إلى المختبر (الشكل 3 أ ، ب) ، وتوزيعها في أطباق بتري (الشكل 3 ج ، د) ، ثم غمرها لاحقا في وسط سائل أو لزج لإجبار الديدان على ترك مادة الركيزة والسباحة إلى سطح الوسط (الشكل 3 ه ، و). بعد ذلك ، يمكن جمع الديدان ونقلها إلى ألواح أجار أو أنابيب طرد مركزي دقيقة ، وتحديد هوية الأنواع باستخدام PCRs التشخيصية2،6،7،22.

Figure 3
الشكل 3: تحضير التفاح لعزل الديدان الخيطية. (أ ، ب) يمكن عزل الديدان الخيطية من العينات البيئية مثل السماد أو الفواكه الفاسدة بالإضافة إلى جذبها عن طريق وضع التفاح على السماد. (ج، د) يتم تقسيم العينات ، وتوضع قطع صغيرة في طبق بتري. (ه، واو) يضاف الوسط اللزج إلى العينات ، مما يؤدي عادة إلى ترك الديدان الخيطية لمادة الركيزة والسباحة إلى سطح الوسط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ينتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات الخاصة ب C. elegans nlp30-F و nlp30-R منتج PCR بطول 154 نقطة أساس ل C. elegans ولا يوجد منتج للديدان الخيطية الأخرى (الشكل 4). لتأكيد الأداء الناجح لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، يجب تشغيل الحمض النووي لسلالة مختبرية مثل N2 كتحكم إيجابي بالتزامن مع الحمض النووي للديدان الخيطية المعزولة. يمكن أن تؤدي الكميات الصغيرة من المواد البيولوجية ، مثل مراحل اليرقات الصغيرة ، إلى ضعف نطاقات تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 4 أ). يمكن تحسين رؤية نطاقات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام المزيد من الحمض النووي في تفاعل البوليميراز المتسلسل (لاحظ أن هذا سيقلل من كمية الحمض النووي المتبقية لتسلسل amplicon البكتيري 16S rDNA ، على سبيل المثال ، 2 ميكرولتر من الحمض النووي بدلا من 1 ميكرولتر) ، عن طريق تطبيق كمية أكبر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على الجل (على سبيل المثال ، 10-15 ميكرولتر) ، أو عن طريق زيادة عدد دورات PCR. بالمقارنة مع الديدان المفردة ، عادة ما تنتج مجموعات الديدان التي تتكون من 50 دودة على الأقل كمية أكبر من الحمض النووي ، وتكون العصابات الموجودة في هلام الرحلان الكهربائي مرئية بوضوح (الشكل 4 ب).

Figure 4
الشكل 4: منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لتفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص ب C. elegans. (أ، ب) تنتج البادئات الخاصة ب C. elegans nlp30-F و nlp30-R منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بطول 154 نقطة أساس. على سبيل المثال ، تم إجراء PCRs على (A) الديدان المفردة و (B) مجموعات الديدان (على سبيل المثال ، 300-500 فرد) ، وكلها معزولة بالبروتوكول الموصوف من المواد النباتية المتعفنة من سماد الحديقة النباتية في كيل ، ألمانيا. (أ) غالبا ما يؤدي الحمض النووي للديدان المفردة، وعلى وجه الخصوص، مراحل اليرقات الصغيرة، إلى ضعف نطاقات تفاعل البوليميراز المتسلسل. (ب) ينتج عن الحمض النووي المعزول من مجموعات الديدان (على سبيل المثال ، 300-500 فرد) نطاقات أكثر وضوحا. تم استخدام الحمض النووي ل C. elegans N2 كتحكم إيجابي (+) ، ولم يتم استخدام أي قالب كتحكم سلبي (-). اللطاخات الموجودة أسفل نطاقات PCR هي قطع أثرية هلامية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يمكن عزل الميكروبات ، المرتبطة ب C. elegans ، من الديدان وكذلك عينات الركيزة المحتوية على الديدان. يتبع عزل الميكروبات معايير علم الأحياء الدقيقة العامة ، بما في ذلك عزل الثقافات النقية من ألواح الآجار ، ونموها في الوسائط السائلة ، وتوصيفها اللاحق (على سبيل المثال ، باستخدام تسلسل جين الحمض النووي الريبي الريبوسومي 16S للبكتيريا). من الأهمية بمكان أن يتم عزل الميكروبات كمستعمرات مفردة نقية من الصفائح ، باستخدام إجراءات علم الأحياء الدقيقة القياسية (الشكل 5). هذا مهم لأن بعض البكتيريا المرتبطة ب C. elegans يمكن أن تشكل أغشية حيوية و / أو تتجمع بسهولة ، مما يؤدي إلى مزارع متعددة الأنواع (الشكل 5C ، D). يمكن تأكيد نقاء الثقافات البكتيرية المعزولة من خلال تسلسل جين 16S rRNA ، كما هو الحال مع الميكروبات المرتبطة ب C. elegans المعزولة سابقا 6,7. يمكن استخدام الميكروبات التي تم الحصول عليها لاحقا في التجارب مع C. elegans.

Figure 5
الشكل 5: العزلات البكتيرية على ألواح الآجار. يتم وضع العزلات البكتيرية الفردية على ألواح أجار ، في هذه الحالة ، صفائح أجار الصويا التربتيك (TSA) ، والتي تظهر كأمثلة عزلة (A) Pseudomonas lurida ، (B) Pseudomonas fluorescens ، ومثال مع العديد من الأنواع البكتيرية ، كما هو موضح كنظرة عامة (C) على اللوحة بأكملها و (D) تكبير قسم من هذه اللوحة ، حيث تظهر أنواع مستعمرات متميزة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: قائمة البادئات المستخدمة في هذه الدراسة الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans هي واحدة من أكثر الكائنات النموذجية التي تمت دراستها بشكل مكثف في البحوث البيولوجية. تم تقديمه من قبل سيدني برينر في 1960s ، في الأصل لفهم تطور ووظيفة الجهاز العصبي29. منذ ذلك الحين ، أصبحت C. elegans نموذجا قويا لدراسة العمليات الأساسية في جميع التخصصات البيولوجية ، بما في ذلك علم الأحياء السلوكي ، وعلم الأعصاب ، والشيخوخة ، والبيولوجيا التطورية ، وبيولوجيا الخلية ، وعلم الأحياء التنموي ، وعلم المناعة. يعتمد نجاحها على مزيج فريد من الخصائص المفيدة ، بما في ذلك وقت جيل قصير يبلغ حوالي 3 أيام ، وسهولة الزراعة ، والجسم الشفاف (الذي يسمح بالتنميط الظاهري الفعال) ، والبقاء على قيد الحياة للتجميد ، والتعقيم الفعال والتزامن التنموي ، وكذلك الطرق الفعالة للتلاعب الجيني عن طريق الطفرات أو CRISPR-Cas أو RNAi. اليوم ، تتم دراسة C. elegans في حوالي 1500 مختبر في جميع أنحاء العالم. عندما أنشأ سيدني برينر C. elegans لأول مرة كنظام نموذجي في المختبر ، قام بزراعة الديدان الخيطية الجرثومية على بكتيريا Escherichia coli OP50 سالبة الجرام كمصدر للغذاء. منذ ذلك الحين ، تم الحفاظ على C. elegans في ثقافة أحادية الأكسجين على E. coli OP50 في المختبرات في جميع أنحاء العالم29. علاوة على ذلك ، عادة ما تتم مزامنة مجموعات C. elegans أو تطهيرها من التلوث عن طريق إجراء التبييض الذي لا ينجو إلا من البيض المعقم ولا يوجد ميكروب مرتبط به. وبالتالي فمن السهل توليد عقيمة يمكن أن تتعرض بعد ذلك للبكتيريا الفردية في ظل ظروف شديدة التحكم. ومع ذلك ، نتيجة لبروتوكولات صيانة مختبر C. elegans الموحدة هذه ، تم إجراء جميع الدراسات تقريبا على بيولوجيا C. elegans في غياب البكتيريا المرتبطة بها بشكل طبيعي. في الواقع ، تم نشر معلومات حول تنوع الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بشكل طبيعي فقط في عام 20164،5،6 ، ولا يزال التنوع الدقيق للميكروبات المرتبطة به غير مستكشف بالكامل.

ستساعد الطرق الموصوفة على زيادة توصيف تنوع الميكروبات المرتبطة ب C. elegans في الطبيعة. من المحتمل أن تكون هذه الميكروبات محددات مهمة لتاريخ حياة الديدان الخيطية ، وبالتالي يجب أن تكون موردا أساسيا للعمل المستقبلي مع هذه الدودة. الطرق الموصوفة هي نسخة محدثة من الطرق الوحيدة المنشورة سابقا لعزل الميكروبات من عينات C. elegans الطبيعية التي تم جمعها مباشرة من الحقل 6,7. يستفيد البروتوكول من حقيقة أن C. elegans يسكن المواد النباتية المتحللة في الطبيعة. هذه المواد المتعفنة غنية بالميكروبات ، والتي تعمل كغذاء ل C. elegans ومن المحتمل أن تؤدي وظائف أخرى ، مثل الحماية المناعية (أي الحماية من مسببات الأمراض)5،6،11،13،14. وبالتالي فإن الخطوة الرئيسية الأولى هي الحصول على ركائز مناسبة لعزل الديدان. قد تعتمد الملاءمة على الوقت من السنة ؛ في شمال ألمانيا ، تم العثور على C. elegans في المقام الأول من سبتمبر حتى2 نوفمبر. هذا هو الوقت الذي تصبح فيه الفواكه مثل التفاح أو الكمثرى متاحة وتبدأ في التعفن على الأرض. من المحتمل أن يختلف الوقت المحدد بين المناطق الجغرافية23،24،25،30. تبدو أي مادة نباتية مناسبة ل C. elegans ، طالما أنها تظهر درجة عالية من التحلل وبالتالي تحمل مجتمعا ميكروبيا غنيا - باستثناء المواد التي تهيمن عليها الفطريات ، والتي غالبا ما تكون مسببة للأمراض ل C. elegans1. علاوة على ذلك ، عادة ما تكون C. elegans شائعة بشكل خاص عندما لا تكون الرطوبة العامة منخفضة جدا2. حتى الآن ، لا توجد معلومات منهجية حول ما إذا كانت نيماتودا Caenorhabditis تختلف في وفرة في المواد النباتية من الزراعة الصناعية مقابل الزراعة العضوية أو السطحية مقابل الطبقة العميقة من المخلفات أو الاعتماد على المطر أم لا.

بمجرد جمع العينات ونقلها إلى المختبر ، يجب "إغراء" الديدان من ركائزها. وقد تحقق ذلك من خلال نهجين مختلفين ، على سبيل المثال ، عن طريق استخراج الديدان من خلال قمع بيرمان31 أو وضع عينات على صفيحة أجار تحتوي على طعام مختبر الإشريكية القولونية كعامل جذب في منتصف27. في تجربتنا ، يكون البروتوكول الموصوف هنا أسرع وأكثر كفاءة بشكل عام. يعتمد على فكرة أن عينات الركيزة مغمورة في محلول سائل أو لزج ، مما يجبر الديدان بكفاءة على الخروج من الركيزة وحتى سطح السائل ، حيث يمكن جمعها بسهولة. ليست هناك حاجة ماسة إلى لزوجة الوسط ، ولكنها تبطئ حركة الديدان وبالتالي قد تسهل جمعها. يتم تسهيل الجمع الفعال للديدان عند إضافة السائل بعناية إلى الركيزة ، وبالتالي تجنب إذابة أي مواد مبهمة ، والتي يمكن أن تغميق السائل وقد تجعل من الصعب رؤية الديدان الخيطية.

التحدي التالي هو تحديد C. elegans. يمكن أن تساعد بعض السمات المورفولوجية في التمييز بين ديدان Caneorhabditis والديدان الخيطية الأخرى27 ، ولكنها غير كافية لتحديد الأنواع بدقة. غالبا ما تحتوي المواد النباتية المتعفنة على نيماتودا أخرى متشابهة المظهر ، بما في ذلك الأنواع الجنيسية ، مثل C. briggsae أو C. remanei2،6،23،25 ، والتي يستحيل تمييزها للوهلة الأولى. لذلك ، يمكن تحديد C. elegans بشكل أفضل وأكثر موثوقية بمساعدة PCR التشخيصي باستخدام البادئات الخاصة بالأنواع2،6،7 ، كما هو موضح في البروتوكول. في هذا السياق ، قد يكون من المفيد إنشاء مجموعة متكاثرة من C. elegans الطبيعية المعزولة في المختبر ، على سبيل المثال ، على لوحات NGM القياسية. عادة ما تجلب C. elegans الطبيعية البكتيريا المرتبطة بها ، والتي يتم إلقاؤها على ألواح NGM ، حيث تنمو البكتيريا عادة ، وبالتالي تعمل كغذاء للديدان 6,7. على الرغم من أن التركيب الدقيق للميكروبات المرتبطة يتغير أثناء انتشار C. elegans على الصفائح ، إلا أنه لا يزال مشابها لعينات الديدان الخيطية الطبيعية المميزة على الفور 6,7 ، وبالتالي فهو حل وسط مفيد يسمح بعزل كل من C. elegans والميكروبات المرتبطة بها.

بمجرد تحديد C. elegans بنجاح ، يمكن استخدام الديدان الخيطية أو عينات الركيزة المرتبطة بها لعزل وتوصيف الميكروبات المرتبطة بها. للتأكد من أن الميكروبات مرتبطة حقا ب C. elegans في الطبيعة ، من الأهمية بمكان تجنب التلوث في جميع خطوات البروتوكولات. يجب أن يتم جمع عينات السماد والفاكهة في الحقل بعناية خاصة من قبل الباحث ، باستخدام مواد معقمة. يجب أن تضمن جميع عمليات معالجة المواد في المختبر مستوى عال من النظافة والأدوات البلاستيكية المعقمة والمخازن المؤقتة مرة أخرى. للحد من مخاطر التلوث ، يجب إجراء جميع الأعمال المختبرية بشكل مثالي في غرفة مختبر منفصلة ، مخصصة حصريا لعزل الميكروبات. كبديل ، يجب أن يتم كل العمل مع الألواح المفتوحة أو الأنابيب أو الحاويات الأخرى في خزانة تدفق رقائقي. لتقييم مخاطر التلوث ، يجب معالجة عينات المراقبة المناسبة (على سبيل المثال ، بدون عينات أو بدون ديدان) بالتوازي. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الوسائط المختلفة لضمان إمكانية زراعة وعزل جميع أنواع البكتيريا المختلفة ذات متطلبات نموها المختلفة. ومع ذلك ، أشار العمل السابق إلى أن جميع البكتيريا المعزولة حتى الآن ، والتي ترتبط بعزلات C. elegans الطبيعية ، تنمو بسهولة على لوحات NGM و TSA. وبالتالي ، قد يكون من الكافي التركيز على هذه الوسائط.

ستساهم الميكروبات المعزولة والمميزة في تحسين فهم التاريخ الطبيعي ل C. elegans. والأهم من ذلك ، حتى الآن ، ليس من المفهوم جيدا كيف تستجيب C. elegans للميكروبات المرتبطة بها بشكل طبيعي ، والعمليات الجزيئية المعنية ، والوظائف التي تتوسط تفاعل الدودة مع شركائها الميكروبيين. أحد الاستثناءات الرئيسية هو العمل الشامل الذي قامت به مجموعة Walhout حول التفاعل بين C. elegans و Comamonas DA 1877. وكشفت عن فيتامين ب 12 كمستقلب مركزي توفره البكتيريا ، والذي يؤثر على التعبير الجيني للدودة والخصوبة والعمر والتطور15،16،17. كما أظهرت مجموعة والحوت أن تأثير فيتامين ب 12 على الخصوبة والنمو يعتمد على دورة الميثيونين / S-Adenosylmethionine ويتأثر بالعديد من عوامل النسخ ، مثل مستقبل الهرمون النووي NHR-2315،16،17. علاوة على ذلك ، يساهم فيتامين ب 12 البكتيري في انهيار حمض بروبيونات الأحماض الدهنية قصير السلسلة الذي يحتمل أن يكون ساما ، والذي في حالة عدم وجود فيتامين ب 12 يمكن تعويضه من خلال إعادة توصيل شبكة التمثيل الغذائي ، على ما يبدو من خلال إنتاج 3-هيدروكسي بروبيونات 16,32. مثال مختلف هو التأثير العصبي المعدل لبروفيدنسيا ، الذي اكتشفه مختبر سينغوبتا ، حيث يتم تحويل التيرامين البكتيري بواسطة C. elegans tyramine β-hydroxylase إلى octopamine ، والذي يؤثر لاحقا على سلوك الدودة من خلال تفاعلها مع مستقبل OCTR-1 octopamine في خلايا عصبية حسية محددة18. مثال آخر هو الحماية المناعية ، والتي توفرها البكتيريا المختلفة ، وخاصة تلك الموجودة في جنس Pseudomonas. يحدث هذا إما من خلال إنتاج مركبات مضادة للميكروبات أو من خلال تأثير غير مباشر ، ربما عن طريق تنشيط استجابات مضيف محددة6،11،14. ستساعد الميكروبات الإضافية وخاصة استخدام المجتمعات الميكروبية المرتبطة بشكل طبيعي في الحصول على فهم أكثر واقعية لبيولوجيا هذا النموذج الخيطي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

نعلن أنه ليس لدينا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن نعترف بالدعم المالي من مؤسسة العلوم الألمانية (المشروعان A1.1 و A1.2 لمركز الأبحاث التعاونية 1182 حول أصل ووظيفة الكائنات الحية). نشكر أعضاء مختبر شولنبورغ على نصائحهم ودعمهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMSOL COMSOL multiphysics simulation software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schulenburg, H., Félix, M. -A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
  2. Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors. BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).
  3. Petersen, C., et al. Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes. BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).
  4. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  5. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  6. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  7. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  8. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  9. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  10. Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).
  11. Kissoyan, K. A. B., et al. Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).
  12. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  13. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  14. Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
  15. Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response. Cell. 153 (1), 253-266 (2013).
  16. Watson, E., et al. Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits. Cell. 156 (4), 759-770 (2014).
  17. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  18. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  19. Snoek, B. L., et al. A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits. BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).
  20. Avery, L., Shtonda, B. B. Food transport in the C. elegans pharynx. Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).
  21. Zhang, J., et al. A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development. Cell Host & Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).
  22. Petersen, C., et al. Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations. Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).
  23. Félix, M. -A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).
  24. Barrière, A., Félix, M. -A. Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations. Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).
  25. Dolgin, E. S., Félix, M. -A., Cutter, A. D. Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).
  26. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).
  27. Barrière, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans and related nematodes. WormBook. , ed. The C elegans research community 1-19 (2014).
  28. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
  29. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  30. Crombie, T. A., et al. Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands. Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).
  31. Haber, M. Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding. Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).
  32. Watson, E., et al. Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans. eLife. 5, 17670 (2016).

Tags

علم الأحياء ، العدد 186 ، Caenorhabditis elegans ، تفاعلات الميكروبات المضيفة ، التفاح ، السماد ، Ochrobactrum ، Pseudomonas lurida
عزل وتوصيف الجراثيم الطبيعية للنموذج الديدان الخيطية <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petersen, C., Dierking, K., Johnke,… More

Petersen, C., Dierking, K., Johnke, J., Schulenburg, H. Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (186), e64249, doi:10.3791/64249 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter